PARTE Ⅰ:Il processo infiammatorio modula l'espressione e la localizzazione di WT1 nei podociti che portano a danno renale
Mar 23, 2022
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MARIELA ARELLANO-RODRÍGUEZ, PABLO ZAPATA-BENAVIDES & ET AL.
introduzione
Gene del tumore di Wilm-1(WTI) è uno dei principali geni coinvolti nella sopravvivenza dei podociti e nell'inefficiente filtrazione renale. I processi infiammatori portano arenefallimentoe ciò potrebbe eventualmente verificarsi attraverso la modulazione di WT1(Gene del tumore di Wilm-1). WT1(Gene del tumore di Wilm-1) codifica per un fattore di trascrizione, una proteina zinc finger che ha quattro isoforme principali mediante splicing alternativo nell'esone 5(17AA±) e nell'esone 9(KTS±)(1). L'isoforma KTS ha una maggiore affinità per il DNA, KTS plus co-localizza con le proteine dello spliceosoma nel citoplasma (2, 3).WT1(Gene del tumore di Wilm-1) svolge un ruolo cruciale nell'embriogenesi, principalmente nelle gonadi erenesviluppo; negli adulti, la sua espressione è limitata alle cellule viscerali specializzate nelrene(podociti) ed è essenziale per il mantenimento e la modulazione di diversi geni, come la podocalyxin, la nefrina (NPHS1) e il fattore di trascrizione paired-box (4-6). Mutazioni o riduzione dell'espressione di WTl possono portare a una ridotta espressione di nefrina e podocalyxin ed è associata a nefropatie come la glomerulosclerosi(5, 7-10).
La sindrome nefrosica è la sindrome renale più frequente nell'infanzia, la sua classificazione istologica è alterazione nefrosica minima, glomerulosclerosi segmentaria focale e sclerosi mesangiale diffusa e, in base alla sua estensione della risposta agli steroidi, è classificata come sindrome nefrosica sensibile e resistente (11) .
effetti della cistanche: antinfiammatorio
Mutazione di WT1(Gene del tumore di Wilm-1) è comunemente riportato nei bambini con sindrome nefrosica resistente agli steroidi, una malattia rara che colpisce il 10-15 percento dei pazienti con sindrome nefrosica(12,13). Circa l'80% di tutti i bambini con sindrome nefrosica sporadica risponde al trattamento con steroidi, tuttavia non sono state riscontrate mutazioni in WT1(Gene del tumore di Wilm-1) in un ampio studio di coorte(14).Riduzione dell'espressione della sindrome nefrosica resistente agli steroidi e in misura minore nei pazienti con sindrome nefrosica steroido-sensibile(15).In un modello murino di infiammazione sistemica indotta da lipopolisaccaride (LPS), 24 h dopo la somministrazione di LPS, WT1(Gene del tumore di Wilm-1) è stato traslocato nel citoplasma ed è stato associato a una diminuzione dell'espressione della nefrina, un componente chiave per il mantenimento del diaframma a fessura nei podociti ed essenziale per una corretta filtrazione glomerulare, mostrando così WT1(Gene del tumore di Wilm-1) agisce come fattore trascrizionale per la sovraregolazione del gene della nefrina(16).
Nelle cellule di cancro del polmone A459 trattate con fattore di necrosi tumorale-alfa (TNFa), traslocazione di WT1(Gene del tumore di Wilm-1) è stata osservata proteina al citoplasma, suggerendo che uno stimolo infiammatorio può alterarne la localizzazione intracellulare e la funzione trascrizionale (17). La fosforilazione può svolgere un ruolo nella modulazione dell'attività regolatoria trascrizionale di WT1(Gene del tumore di Wilm-1) per interferenza con la traslocazione nucleare, nonché per inibizione di WT1(Gene del tumore di Wilm-1) Legame al DNA (18) mediante fosforilazione mediata da chinasi della proteina cAMP-dipendente di Ser-365 e Ser-393 nel dominio del dito di zinco (19).
La sepsi è il risultato della risposta infiammatoria sistemica ed è caratterizzata dal rilascio di citochine pro e antinfiammatorie indotte dall'infezione. Il danno renale acuto è comune nei pazienti critici in presenza di infiammazione acuta e ha un forte legame con la progressione del danno renale cronico (20,21). Ci sono prove che l'infiammazione gioca un ruolo importante nel danno a vari organi, inclusoreni(22). In questo lavoro, abbiamo valutato l'effetto delle citochine pro-infiammatorie sulla modulazione di WT1(Gene del tumore di Wilm-1) espressione e sua traslocazione nel citoplasma.
cistanche tubulosa beneficio: antit-cncer e anti-tumore
Materiali e metodi
Modello animale. Topi femmina BALB/c (di 8-10 settimane) sono stati ottenuti da Harland, Messico (Città del Messico, Messico). I topi sono stati ingabbiati a temperatura ambiente, umidità e luce controllate (ciclo luce-buio di 12/12 ore) con acqua e cibo ad libitum.LPS di Escherichia coli O111:B4 (Sigma Aldrich, Toluca, Città del Messico, Messico) e un singolo l'iniezione di LPS è stata somministrata alla dose di 8 mg/kg per via intraperitoneale(16); la soluzione salina è stata utilizzata per il controllo, topi non trattati. I topi sono stati sacrificati con un'iniezione intraperitoneale di 200 mg/kg di soluzione di pentobarbital sodico a 12,24,36,48 e 72 ore, con n=5 in ogni momento, e poirenetessuti e sangue sono stati raccolti. L'urina veniva raccolta prima di sacrificare gli animali.
Due topi perrenegli espianti sono stati iniettati con 1 mg/kg di LPS ogni 2 giorni per indurre la cronicarene lesionecome controllo positivo (21). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con la previa approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Facoltà di scienze biologiche (CEIBA-2016-034).
Reneespianti. Dalrenedi topi BALB/c, fette di tessuto spesse 250-300 um sono state preparate con un'affettatrice di tessuti Krumdieck (Alabama Research and Development, Munford, AL, USA) a 4 gradi con il flusso costante di tampone di bicarbonato Krebs Henseleit (KB) che è stato aerato con il 5% di CO2. Le fette sono state raccolte nel buffer KB a 4 gradi.Renegli espianti sono stati piastrati in 12-piastre a pozzetti con il mezzo Eagle's modificato/F12 di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale e il 5% di agente antibiotico-antimicotico, e incubati a 37 gradi C, con il 5% di CO e agitando a 25 giri/min. Gli espianti sono stati trattati con 10 ng/ml di TNFa (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 20 ng/ml di interleuchina 1 (IL1 ; R&D Systems) e 100 ng/ml di LPS e analizzati a 6, 12 e 24 ore dopo.
Proteine urinarie. I campioni di urina sono stati raccolti in ogni punto temporale sopra. La concentrazione proteica è stata misurata utilizzando il kit DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) e l'albuminuria è stata valutata mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide e in base alla dimensione della banda dell'albumina sierica bovina (16).
Citochine pro-infiammatorie. I livelli di IL6, IL1 e TNFa sono stati misurati utilizzando kit di test immunoassorbenti enzimatici sandwich (PeproTech, Città del Messico, Messico).
Reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR). L'RNA totale è stato isolato dai tessuti renali utilizzando il reagente Trizolw (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore. Il cDNA a filamento singolo è stato sintetizzato mediante trascrizione inversa utilizzando il kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore. La PCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando il sistema 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems) con saggi di espressione genica TaqMan. Sono stati eseguiti saggi PCR comparativi in tempo reale per ciascun campione in triplicato. I primer per WT1(Gene del tumore di Wilm-1) erano avanti:5-TCTGCGG AGCCCAATACAG-3'; retromarcia:5-CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA-3';e sonda FAM:5-CACCGTGCGTGTGTATT-3'NFQ;il protocollo è stato eseguito per 95 gradi per 10 minuti e 40 cicli a 94 gradi per 30 se 64 gradi C per gli anni '30. L'espressione relativa del WT1(Gene del tumore di Wilm-1) è stato calcolato utilizzando l'equazione 2-AACT(23) con il gene della gliceraldeide{2}}fosfato deidrogenasi (GAPDH) (Applied Biosystems) utilizzato per la normalizzazione.
trattare l'estratto di cistanche per malattie renali
L'espressione dell'mRNA della nefrina è stata determinata con 3 ug di cDNA e i seguenti primer: Forward: 5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT-3'e reverse:5'-GGCAGGACATCCATGTAGAG-3'a 94 gradi per 30 s,60 degree degree per 30 s e 72 degree degree per 30s per 30 cicli(372 bp)(16). Per l'espressione di GAPDH, i primer utilizzati sono stati: Forward:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3',reverse:5'- TCCACCACCC TGTTGCTGTA-3', con le seguenti condizioni di reazione: 94 gradi per 40 secondi, 60 gradi per 30 secondi e 72 gradi per 40 secondi per 35 cicli (452 bp). Espressione di WT1(Gene del tumore di Wilm-1): Avanti 5'-CACATGAGAGAAACGCCCCTTCATGTG-3', indietro 5'-TTTGAGCTGGTCTGAACGAGAAA-3'a 94 gradi per 40 s, 64 gradi per 30 secondi e 72 gradi per 30 secondi per 35 cicli (160 bp). L'espressione di WT1(Gene del tumore di Wilm-1) isoforme KTS±e 17 AA±(F2- primer R2 per rilevare 17 AA più /-e F3-R3 per rilevare KTS più /-isoforme di splicing) è stato eseguito mediante PCR convenzionale secondo Oji et .al.(24). La determinazione dell'espressione di -actina è stata eseguita secondo Lauxet al. (25). I prodotti sono stati osservati utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide al 10% per l'isoforma KTS± e un gel di agarosio al 2% per l'isoforma 17AA±.
Immunofluorescenza. Ilrenida topi e controlli trattati con LPS sono stati fissati in formalina al 10% ed elaborati per la colorazione di ematossilina ed eosina, immunoistochimica e immunofluorescenza.
Per determinare la posizione di WT1(Gene del tumore di Wilm-1) in topi trattati con LPS, sono state utilizzate{{0}}sezioni di tessuto renale spesse um montate su vetrini da microscopio. I campioni sono stati decerati, permeabilizzati con Triton X-100 [tritone allo 0,1% con citrato di sodio all'1% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)] e lavati tre volte con PBS. I tessuti sono stati bloccati con siero bovino fetale al 20% in PBS per 30 minuti e incubati a 4 gradi durante la notte con anticorpi monoclonali contro WT1(Gene del tumore di Wilm-1) sc{{0}}(F-6)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) diluito 1:100 nel 10% di siero bovino fetale in PBS. Dopo lavaggi con PBS, la presenza di anticorpi legati è stata identificata mediante colorazione con IgG Texas Red sc-2979 di capra anti-topo (Santa Cruz Biotechnology). I vetrini sono stati colorati di contrasto con 4',{8}}diamidino-2-fenilindolo. Infine, i vetrini sono stati montati ed esaminati qualitativamente utilizzando un microscopio confocale Olympus BX61W1 con obiettivo a immersione in acqua 40 × e software Fluoview 4.0a (Olympus, Tokyo, Giappone).
Immunoistochimica. Per determinare fosforilato (p)-WT1(Gene del tumore di Wilm-1) in podociti di topi trattati con LPS, anticorpi policlonali contro p-WT1(Gene del tumore di Wilm-1) sono state utilizzate serina 393,sc-12933 e 363,sc-12934-R(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). I vetrini contenenti sezioni di 4-μm di tessuto renale sono stati decerati e permeabilizzati L'immunoistochimica è stata eseguita utilizzando Universal Quick Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) secondo il protocollo del produttore.I vetrini sono stati esaminati utilizzando un microscopio ottico con un obiettivo a immersione in olio 100× (Primo Star, Carl Zeiss, GmbH, Germania) .
Macchia occidentale. La proteina totale è stata isolata con 200 ul di tampone di lisi (1% Triton, 150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,6) e la concentrazione è stata misurata utilizzando un kit di test proteico DC (Bio-Rad). La proteina (50 ug) è stata separata mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide al 12% e analizzata mediante western blotting con WT1(Gene del tumore di Wilm-1) [F6] anticorpo sc-7585(Biotecnologia di Santa Cruz). I campioni sono stati normalizzati utilizzando anti-GAPDH (AB2302; Sigma, San Louis, MO, USA). Le proteine sono state visualizzate utilizzando un sistema Lumi-Light Western Blotting sc-2048 (Biotecnologia di Santa Cruz).
beneficio della cistanche: proteggere i reni
Risultati
Induzione direnedannonei topi BALB/c da LPS. È ben noto che la lesione dei podociti è associata a un aumento della proteinuria. L'albumina e la proteina totale nelle urine sono state determinate mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide e kit di dosaggio delle proteine DC (Bio-Rad). Un aumento significativo (p=0.001) dell'albumina urinaria è stato osservato 12 h dopo il trattamento con LPS, con un aumento massimo a 24 h(215,87±1,41 ug/ml) rispetto al controllo（15,53 ±5,0 ug/ml）（Figura 1A）.La concentrazione di proteine urinarie totali è stata osservata raggiungere il picco a 36 ore (26,02±2,43 mg/ml) ed era significativamente più alta rispetto al controllo(p{20}}.01) come mostrato in Figura 1. Il danno renale indotto da LPS è stato analizzato dall'istologia.A 24 h dopo il trattamento, è stata osservata glomerulonefrite focale nel tessuto renale, con il danno maggiore riscontrato a 36 h, aumentando le dimensioni del glomerulo, con mesangiale proliferazione cellulare A 48 ore dopo, è stato osservato un graduale recupero del glomerulo fino a 72 ore, come mostrato nella Figura 1C.
Figura 1. Effetto dell'infiammazione sistemica sul rene.Concentrazioni di albumina urinaria (A) e proteina urinaria (B) come marcatori di danno renale nei topi trattati con lipopolisaccaride. C: Un'immagine rappresentativa dell'istologia renale del topo (colorazione con ematossilina ed eosina) in momenti diversi (12,24,36,48 e 72 ore) dopo l'iniezione di lipopolisaccaridi, con il confronto di un modello di infiammazione cronica, ingrandimento 100 ×. Significativamente diverso a: *n<><0,0]><0.00>
Produzione delle citochine pro-infiammatorie TNFa e IL1 nel siero di topi trattati con LPS. Per confermare che il danno renale è stato indotto da LPS, i livelli di citochine pro-infiammatorie sono stati misurati mediante test di immunoassorbimento enzimatico. È stato osservato un aumento di TNFa e I1 dopo 12 ore(3,6±{9}},9 ng/ml, 11,9±5ng/ml) e fino a 36 ore(4,44±{17}},1 ng/ml,18 ±0,9 ng/ml rispettivamente) di trattamento con LPS, iniziando a diminuire successivamente (Figura 2A e B). L'espressione di IL6 è stata aumentata a 12 ore (49,5 ng/ml) e 36 ore (23,5 ng/ml) dopo il trattamento, essendo significativamente superiore al controllo (Figura 2C).
Figura 2. Andamento temporale dei livelli di citochine pro-infiammatorie fattore di necrosi tumorale-alfa (TNFa).(A), interleuchina 1 (LL1 )(B) e IL6(C) nel siero di topi dopo somministrazione intraperitoneale di lipopolisaccaride. Significativamente diverso a: *p Minore o uguale a 0.05,**p Minore o uguale a 0.01 e ***p Minore o uguale a 0.001 .
Espressione del gene WTI nel tessuto renale di topi trattati con LPS. Per rispondere alla nostra domanda centrale se WT1(Gene del tumore di Wilm-1) è stato modulato dal processo infiammatorio, e questo ha avuto effetti renali, l'espressione totale del WT1(Gene del tumore di Wilm-1) è stato determinato in campioni renali di topi con infiammazione sistemica in momenti diversi nel corso dell'infiammazione. WT1(Gene del tumore di Wilm-1) l'mRNA era sempre più basso analizzato rispetto al controllo, con l'espressione relativa più bassa a 36 ore e la più alta a 12 ore dopo l'induzione dell'infiammazione sistemica come mostrato nella Figura 3A. Inoltre, è stato determinato se il trattamento con LP modifica indotta dell'espressione dell'esone5(17 AA±) dell'isoforma e del KTS± di WTI mediante PCR. I dati hanno mostrato che non vi era alcuna deregolamentazione dell'espressione di queste isoforme poiché è stato osservato lo stesso comportamento del gruppo di controllo senza trattamento durante il processo infiammatorio sistemico indotto da LPS (Figura 3B). La proteina WT1 è stata mostrata dal western blotting per diminuire durante il processo infiammatorio, con un leggero recupero a 36 ore dopo il trattamento, tuttavia, la quantità di WT1 era inferiore a quella del controllo non trattato (Figura 3C e D).
Figura 3. Effetto del lipopolisaccaride (LPS) sull'espressione genica del tumore di Wilms I (WT1) nel tessuto renale di topi con infiammazione sistemica.A: Espressione relativa dell'mRNA di WTI.B: Espressione relativa delle isoforme KTS±e 17IAA± di WT1.C: Livelli di proteina WTI mediante immunoblotting dopo il trattamento con LPS e D: Densità di immunoblotting per WT1.Significativamente diverso a:**p Meno minore o uguale a 0.01 e ***p Minore o uguale a 0,001,
Fosforilazione e localizzazione di WTI in biopsie renali di topi trattati con LPS. Un evento importante nella modulazione post-traduzionale della proteina WTI è la fosforilazione dell'amminoacido 393, che induce lo spostamento della proteina nel citoplasma. Sono state determinate la fosforilazione e la localizzazione di WT1 in campioni renali di topi trattati con LPS. La fosforilazione di WT1 è stata analizzata mediante istochimica, indicando la presenza di WT1 fosforilato nel citoplasma delle cellule in sezioni di tessuto renale a partire da 12 h dopo l'induzione dell'infiammazione sistemica e mantenuta fino a 72 h. Il WT1 è stato fosforilato agli amminoacidi 393 e 363 come mostrato nella Figura 4A. La posizione della proteina WT1 è stata analizzata mediante immunofluorescenza. La posizione di WT1 nei podociti nei campioni renali di topi trattati con LPS era principalmente citoplasmatica, mentre nei podociti dei campioni di controllo la posizione non era chiara (Figura 4B).
Figura 4. Fosforilazione e localizzazione del tumore di Wilms I (WTI) in campioni di rene da topi trattati con lipopolisaccaridi.A: Colorazione immunoistochimica per fosforilato (p)-WTI che mostra un aumento del fosforilato alla serina 393 e 363 a partire da 12 ore dopo la somministrazione di LPS (ingrandimento 100 × al microscopio ottico). B: Localizzazione di WTI mediante immunofluorescenza nel rene; esempi che mostrano una localizzazione nucleare minore di WT1(quadrati)36 h dopo la somministrazione di lipopolisaccaride (ingrandimento 40× al microscopio confocale).DAP1:4,6-Diamidino-2-fenilindolo.
Modulazione dell'espressione di WTI e nefrina nei reni di topi trattati con LPS. La posizione di WT1 nella cellula influenza la sua attività biologica. È stato riportato che il WT1 citoplasmatico non esercita attività trascrizionale; per questo motivo, l'espressione dell'mRNA di WT1 e nefrina è stata analizzata mediante PCR in campioni renali di topi trattati con LPS (Figura 5A). La PCR ha indicato una diminuzione dell'mRNA di nefrina da 24 a 48 ore, con un aumento a 72 ore (Figura 5B). ), mentre l'espressione dell'mRNA WTI è aumentata a 12 ore e successivamente è diminuita durante le ore critiche di infiammazione e danno renale (24 e 36 ore) e (Figura 5B).
Figura 5. Analisi dell'espressione di mRNA di nefrina (NPHS1) e tumore di Wilms 1(WT1).A: Nell'analisi dell'espressione dell'mRNA, NPHSI e WTI sono diminuiti a 24,36 e 48 ore dopo l'induzione dell'infiammazione sistemica mediante lipopolisaccaride. B: Quantificazione delle bande mostrate in A mediante densitometria e normalizzate mediante espressione in gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi.
Gli espianti renali trattati con TNFa e IL1 modulano l'espressione di WTI e nefrina. Per determinare se le citochine modulano l'espressione di WT1, gli espianti renali sono stati coltivati e trattati con le citochine TNFa e IL1 per 6,12 e 24 ore per analizzare l'espressione di WT1 e nefrina mediante PCR. L'espressione dell'mRNA della nefrina è diminuita e l'espressione dell'mRNA del WTI è aumentata a 24 ore negli espianti renali trattati con TNFa e ILlb (Figura 6).
Figura 6. Analisi dell'espressione di nefrina (NPHS1) e mRNA di Wilms'tumor 1 (WT1) in espianti renali.A: Livelli di espressione di mRNA di NPHSi e WTI in tempi diversi in espianti renali esposti a 10 ng/ml di fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF) e 20 nglml di interleuchina 16 (IL16)B: Espressione relativa ottenuta mediante analisi densitometrica del prodotto di segnale. Le bande sono state quantificate mediante normalizzazione in gliceraldeide {5}}fosfato deidrogenasi.
Localizzazione di WTI negli espianti renali mediante immunofluorescenza. Per determinare se TNFa e IL fossero responsabili del cambiamento nella localizzazione della proteina WT1, gli espianti renali di topo sono stati trattati con TNFa e L1 e LPS per 24 ore. Negli espianti trattati con ILlb e LPS era evidente una localizzazione nucleo/citoplasmica della proteina WTl e negli espianti trattati con TNFa è stata osservata una localizzazione citoplasmatica della proteina WT1; nel frattempo, nei controlli non trattati, è stata osservata principalmente la localizzazione nucleare di WT1 (Figura 7).
Figura 7. Localizzazione della proteina Wilms'tumor 1(WTI) mediante immunofluorescenza utilizzando Red TX (WT1) e 4',6-diamidino{5}}fenilindolo (DAPI)(nucleo) nei podociti da espianti renali trattati con l0 ng/ml di fattore di necrosi tumorale-alfa (TNFa), 20 ng/ml di interleuchina 16(L1B) e lipopolisaccaride (LPS).Localizzazione nucleare ridotta di WTA mostrata negli espianti trattati con TNFa rispetto alla localizzazione nucleare/citoplasmica di WTI sotto trattamenti IL1 e LPS. Ingrandimento, 40×.
