Parte Ⅰ: L'AKT1 mitocondriale tubolare è attivato durante la lesione da riperfusione da ischemia e ha un ruolo critico nella predisposizione alla malattia renale cronica.
Apr 03, 2023
Astratto
La disfunzione tubulare renale può portare a danno renale acuto e trasformazione in malattia renale cronica. Sebbene i mitocondri tubulari siano associati alla fisiopatologia dell'insufficienza renale, il meccanismo non è chiaro. Qui, dimostriamo che la lesione da ischemia-riperfusione induce traslocazione acuta e attivazione della proteina chinasi B mitocondriale (nota anche come AKT1) nei tubuli renali. Abbiamo ipotizzato che la segnalazione mitocondriale di AKT1 potesse prevenire lo sviluppo di danno renale acuto e successiva malattia renale cronica. Per testare questa previsione, abbiamo utilizzato la strategia Cre-Lox per generare due nuovi ceppi di topi transgenici specifici del tubulo renale che hanno indotto l'espressione di AKT1 dominante negativo mirato ai mitocondri o AKT1 costitutivamente attivo. nei topi AKT1-negativi mirati ai mitocondri, l'inibizione dell'AKT1 mitocondriale ha esacerbato l'azotemia, il danno tubulare, la fibrosi renale, la glomerulosclerosi e la sopravvivenza dopo il danno da ischemia-riperfusione negativamente. Al contrario, nei topi AKT1 costitutivamente attivi mirati ai mitocondri, la segnalazione AKT1 mitocondriale mitocondriale potenziata ha attenuato il danno renale, ha protetto la funzione renale e ha migliorato significativamente la sopravvivenza dopo il danno da ischemia-riperfusione (rispettivamente 76,9% contro 20,8%). Quando l'AKT1 mitocondriale è stato inibito, nei tubuli renali è stato riscontrato un aumento della respirazione mitocondriale disaccoppiata e dello stress ossidativo, a sostegno del ruolo della disfunzione mitocondriale nella fisiopatologia dell'insufficienza renale. Pertanto, il nostro studio suggerisce che la via di segnalazione AKT1 mitocondriale tubolare potrebbe essere un nuovo obiettivo per lo sviluppo di nuove strategie per prevenire e curare meglio le lesioni renali.
Dichiarazione di traduzione
Il danno renale acuto (AKI) e il successivo sviluppo della malattia renale cronica (CKD) sono i principali problemi di salute. Abbiamo sviluppato un modello di topo transgenico e determinato il ruolo dell'attivazione AKT dei mitocondri tubulari renali prossimali in AKI e CKD. Questo meccanismo di salvataggio della protezione renale può essere un nuovo obiettivo per lo sviluppo di nuove strategie per prevenire e trattare meglio AKI e CKD. Studi futuri dovrebbero confermare il coinvolgimento della via di segnalazione mitocondriale dell'AKT nel danno renale umano ed esplorare i bersagli farmacologici della via mitocondriale dell'AKT1.
Parole chiave
Akt1 mitocondriale; Lesione da rifusione da ischemia; Danno renale acuto; Malattia renale cronica;Estratto di cistanche.
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introduzione
Il danno renale acuto (AKI) e il successivo sviluppo della malattia renale cronica (CKD) sono i principali problemi di salute. Attualmente, i trattamenti medici specifici per questi stati patologici sono limitati, in parte a causa della mancanza di comprensione dei meccanismi molecolari alla base del danno renale. Il rene è uno degli organi più energivori del corpo e i mitocondri, necessari per facilitare il trasporto attivo, mantenere gradienti elettrochimici adeguati e regolare l'omeostasi dei fluidi, sono la fonte primaria della produzione di ATP cellulare attraverso la fosforilazione ossidativa. disturbi nella produzione di ATP e disfunzione mitocondriale possono portare ad un aumento della produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che a sua volta compromette la funzione delle cellule renali e induce la morte cellulare. Sebbene siano stati segnalati danni e disfunzioni mitocondriali in pazienti con malattia renale e modelli animali di danno renale acuto e cronico, la conoscenza del ruolo fisiopatologico dei mitocondri nel danno renale rimane incompleta.
La funzione mitocondriale potenziata può prevenire il danno da ischemia-riperfusione (IRI). Durante la fase ischemica dell'IRI, la deplezione di ossigeno inibisce il trasferimento di elettroni nella catena respiratoria mitocondriale e riduce la produzione di ATP. Il successivo afflusso di ioni sodio e l'efflusso di protoni aiutano a ripristinare il pH normale e possono favorire la sopravvivenza cellulare ripristinando il volume intracellulare Durante la riperfusione, il ripristino del flusso sanguigno è associato ad un aumento delle specie reattive dell'ossigeno (ROS), Ca2 più flusso interno ai mitocondri, perdita di gradienti elettrochimici transmembrana mitocondriale e attivazione delle vie apoptotiche Questi cambiamenti intracellulari possono essere dannosi per le cellule che sopravvivono dopo il danno ischemico iniziale.
L'AKI è più comune nei pazienti ospedalizzati e può accelerare l'insorgenza di una nuova insufficienza renale cronica, esacerbare l'insufficienza renale esistente e portare alla morte renale. I meccanismi alla base della transizione da AKI a insufficienza renale cronica non sono chiari. Recenti studi sugli animali suggeriscono che la disfunzione tubulare renale svolge un ruolo importante nella progressione dell'AKI in CKD, rispecchiando la transizione da AKI a CKD nell'uomo. Comprendere le vie di segnalazione che regolano il danno renale ci consentirà di identificare nuovi bersagli terapeutici per mitigare il danno renale e prevenire la progressione dell'AKI in CKD.
Il legame tra le vie di segnalazione citoplasmatica e la funzione mitocondriale durante il danno renale è in gran parte sconosciuto. La funzione mitocondriale è strettamente legata alla segnalazione citoplasmatica, ad altri organelli e alle vie nucleari riducendo i ROS. Tuttavia, non è noto se l'IRI possa innescare la traslocazione dell'AKT1 attivato dal citoplasma ai mitocondri nei tubuli renali. Se l'AKT1 mitocondriale può essere attivato nei tubuli renali in risposta al danno renale, sarebbe importante valutare il ruolo fisiopatologico dell'AKT1 mitocondriale nello sviluppo del danno renale acuto (AKI) e della malattia renale cronica (CKD). Qui, abbiamo utilizzato due modelli murini transgenici specifici del tubulo renale inducibile che modulano la segnalazione mitocondriale di AKT1 in vivo e hanno dimostrato il ruolo protettivo dell'attivazione di AKT1 mitocondriale tubulare renale durante l'IRI contro l'AKI e il successivo sviluppo di CKD.
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Risultati
Attivazione dell'AKT1 mitocondriale nei tubuli renali su IRI
Per prima cosa abbiamo studiato se l'IRI attiva AKT1 nei mitocondri renali. A tal fine, abbiamo stabilito un modello IRI renale legando l'arteria renale sinistra per 30 minuti seguita da nefrectomia controlaterale (Nx). La legatura dell'arteria renale sinistra è stata invertita per terminare la fase ischemica, è stata eseguita la riperfusione e il rene sinistro è stato prelevato all'intervallo di tempo indicato.
La corteccia renale arricchita in tubuli renali è stata isolata ei mitocondri sono stati preparati mediante subfrazionamento. Dopo la riperfusione, l'abbondanza di pAKT1 e AKT1 mitocondriale è stata aumentata, suggerendo la traslocazione di AKT1 attivato nei mitocondri (Figura 1A). Questo è simile a quello che abbiamo osservato nel miocardio rispetto ai controlli simulati o ai controlli renali resecati, dove l'AKT1 mitocondriale era significativamente elevato 30-60 minuti dopo la riperfusione (Figura 1A e B) (n= 11-15). Anche pAKT1 mitocondriale è stato aumentato. Questi risultati suggeriscono che l'attivazione indotta da IRI e la traslocazione di AKT1 nei mitocondri renali. La colorazione iHC ha confermato la fosforilazione di AKT1 nei tubuli renali dopo IRI (Figura 1C). La colorazione di fondo per pAKT1 era minima nei tubuli renali dei controlli simulati, mentre pAKT1 era notevolmente elevato nei tubuli renali dopo IRI (Figure 1C e 1D). Nessun pAKT1 è stato osservato in nessuna regione renale ad eccezione dei tubuli. per confermare la localizzazione subcellulare di pAKT1 nei tubuli, pAKT1 è stato colorato in combinazione con marcatori mitocondriali. una significativa co-localizzazione di pAKT1 e mitocondri è stata osservata nelle cellule tubulari renali all'IRI (Figura 1E). Insieme, questi risultati suggeriscono la traslocazione dell'IRI e l'attivazione di AKT1 nei mitocondri.
Figura 1. Traslocazione acuta indotta da ischemia riperfusione e attivazione di AKT1 nei mitocondri renali.
Generazione di topi transgenici con espressione specifica del tubulo renale inducibile di un AKT dominante negativo nei mitocondri
Per testare l'ipotesi che l'attivazione dell'AKT1 mitocondriale tubulare renale durante l'IRI protegga il rene dall'AKI e dal successivo sviluppo di CKD, abbiamo generato un modello di topo transgenico che consente l'espressione indotta da tamoxifene (TAM) del targeting mitocondriale specifico del tubolare dell'AKT1 negativo dominante. Al terminale N sono state aggiunte sequenze dominanti negative di AKT1 (mdnAKT) e di targeting mitocondriale. L'espressione condizionale del tamoxifene dei transgeni AKT1 è stata mediata usando pCALNL (vedi Materiali e metodi). Per escludere effetti confondenti associati all'integrazione casuale di array di transgeni all'interno del genoma, una singola copia del transgene è stata introdotta mediante ricombinazione omologa in cellule ES con transgeni mirati al locus Gt(ROSA) 26 o su un cromosoma. I topi a due geni (KMDAKT) sono stati ottenuti incrociando i topi mdnAKT indotti da tam con topi emizigoti KSP-CreERT2, dove l'attività Cre indotta da tam era guidata dai promotori della calmodulina 16 specifici delle cellule tubulari renali. tam iniezione indotta attività Cre, mitocondri isolati e proteine mitocondriali separate SDS-PAGE per immunoblotting. I risultati hanno mostrato che TAM ha indotto con successo l'espressione del mutante AKT1. La proteina mutante non era rilevabile nei topi KMDAKT, nei topi KSPReERT2 e nei topi wild-type (iniezione di olio di mais).
Per verificare l'espressione specifica del rene, le proteine mitocondriali sono state estratte da diversi tessuti dopo l'iniezione di TAM. il suo mutante AKT1 era espresso solo nel rene. Le sezioni renali sono state colorate con anticorpi anti-his-tag e Mitotracker mitocondriale per l'imaging di immunofluorescenza. I risultati hanno mostrato che tutti i mutanti AKT1 erano colorati con l'anticorpo His-tag e localizzati nei mitocondri. Nessuna mutazione AKT1 è stata rilevata nei glomeruli. L'attività enzimatica dell'AKT1 mitocondriale è stata analizzata utilizzando GSK3 ricombinante per confermare un importante ruolo negativo nei mitocondri dei tubuli KMDAKT trattati con tam. Poiché l'AKT1 mitocondriale del tubulo renale è attivato dall'IRI, abbiamo confrontato l'attività enzimatica dell'AKT1 nei mitocondri isolati da topi trattati con tam e topi trattati con olio di mais dopo IRI. I risultati hanno mostrato che l'attività mitocondriale renale di AKT1 era significativamente inibita nei topi KMDAKT trattati con TAM. Pertanto, questa linea di topi transgenici è un buon modello per studiare il ruolo di AKT1 nei mitocondri tubolari.
Benefici Cistanche
L'inibizione dell'AKT mitocondriale del tubulo renale ha aggravato l'IRI in vivo
IRI è stato indotto in ischemia renale unilaterale. Nell'ultima serie di esperimenti, l'AKT1 fosforilato era appena rilevabile nei mitocondri dei tubuli renali prossimali. Non sono state osservate differenze significative nell'istologia renale, nell'azoto ureico nel sangue (BUN) e nella creatinina sierica (Cr) nei topi KMDAKT iniettati con olio di mais e tam-iniettati, suggerendo che la segnalazione mitocondriale di AKT1 non ha un ruolo significativo nella struttura e nella funzione renale al basale prima dell'induzione dell'IRI. Per studiare se l'AKT1 mitocondriale svolge un ruolo protettivo durante l'IRI, l'IRI unilaterale è stato utilizzato per indurre l'AKI nei topi dell'olio di mais o nei topi TAM-KMDAKT. non c'erano differenze nei livelli di BUN o Cr ottenuti immediatamente dopo l'induzione dell'IRI, ma nei topi TAM-KMDAKT, entrambi i livelli di BUN e Cr erano significativamente elevati dopo 45 giorni. Questi risultati suggeriscono che l'attivazione bloccata dell'AKT1 mitocondriale nei tubuli renali durante l'IRI ha esacerbato lo sviluppo tardivo della disfunzione renale. l'analisi istologica delle sezioni renali colorate con H&E ha mostrato che il danno renale era esacerbato nei topi TAM-KMDAKT. Il punteggio di Jablonski relativo alla lesione tubulare renale era più alto con perdita del bordo a spazzola tubulare, lisi tubulare e più detriti nel lume tubulare (p=0.018). Per escludere l'effetto della ricombinasi TAM o Cre, abbiamo anche analizzato i topi KSP/CreERT2 iniettati con TAM e i punteggi di Jablonski erano simili nei topi KMdakt e TAM-KSP/CreERT2 dell'olio di mais al giorno 7 dopo l'IRI (Figura 3D) (p{{ 19}}.7613). Questi dati suggeriscono che i nostri risultati non sono stati confusi dagli effetti di TAM o Cre ricombinasi. Nei topi TAM-KMDAKT dopo l'IRI, la colorazione tricromica di Masson ha mostrato un'area fibrotica maggiore (percento) (p<0,001), accompagnata da strutture tubolari disordinate con calchi intraluminali e detriti. l'espressione di col1a è stata aumentata, in linea con la colorazione tricromica di Masson. L'espressione di tGF non era aumentata, suggerendo che l'AKT1 mitocondriale non regolava la risposta infiammatoria. Dopo l'IRI, l'espressione del marcatore di danno tubulare KIM -1 è aumentata nel gruppo TAM-KMDAKT, confermando l'aumento del danno renale nel gruppo TAM-KMDAKT (p=0.002).
La colorazione TUNEL è stata utilizzata per valutare l'apoptosi delle cellule renali. Il numero di cellule apoptotiche era significativamente aumentato nei tubuli (p{{0}}.0054) e nei glomeruli (p<0,001) dei topi TAM-KMDAKT rispetto al gruppo di controllo. Si suggerisce che l'inibizione dell'AKT1 mitocondriale tubolare durante l'IRI aggravi la morte delle cellule tubulari e il danno glomerulare. Coerentemente con questo, l'attivazione sia della caspasi 9 (promotore) che della caspasi 3 (esecutore) era significativamente aumentata nelle cellule epiteliali tubulari renali TAM-KMDAKT. Per esplorare ulteriormente i cambiamenti glomerulari cronici, è stata eseguita un'analisi della colorazione con acido periodico-Schiff (PAS) su sezioni renali per quantificare la glomerulosclerosi. Sebbene non sia stata osservata alcuna differenza nella glomerulosclerosi a 7 giorni post-IRI (p=0.2634), nei topi TAM-KMDAKT è stata riscontrata più glomerulosclerosi a 45 giorni post-IRI (p<0,001). Questa scoperta suggerisce che la via di segnalazione dell'AKT mitocondriale tubulare renale può regolare la formazione della cicatrice glomerulare durante lo sviluppo della CKD. L'analisi di sopravvivenza di Kaplan-Meier ha mostrato l'effetto dell'inibizione dell'AKT mitocondriale tubolare sull'esito dell'IRI. La sopravvivenza è stata ridotta dopo l'IRI nei topi TAM-KMDAKT rispetto ai controlli (p=0.0013).
Il tasso di sopravvivenza dei topi TAM-KMDAKT era significativamente inferiore a quello dei controlli entro 7 giorni dopo l'IRI, ma i livelli di BUN/Cr dei topi TAM- e olio di mais-KMDAKT erano simili durante questo periodo. Le variazioni di BUN/Cr riportate nei topi trattati con TAM potrebbero essere state sottostimate a causa dell'indisponibilità dei dati di BUN/Cr da topi morti. Inoltre, la maggiore mortalità nei topi TAM-KMDAKT può essere causata da una disfunzione degli organi distali (polmoni, cuore, cervello) piuttosto che solo da cambiamenti di BUN/Cr.
Il ruolo dell'AKT1 mitocondriale tubolare è stato valutato anche nei topi KMDAKT femmina. siero BUN/Cr e istologia renale erano relativamente più alti nei topi femmina TAM-KMDAKT 45 giorni dopo IRI. Non è stato osservato alcun effetto sessuale significativo.
Cistanche alle erbe
RIFERIMENTI
1. Yang JY, Deng W, Chen Y, et al. Traslocazione compromessa e attivazione di Akt1 mitocondriale mitigata attività di fosforilazione ossidativa mitocondriale Complesso V nel miocardio diabetico. Cardiol a cellule J Mol. 2013;59:167–175.
2. Wang Z, Ying Z, Bosy-Westphal A, et al. Tassi metabolici specifici dei principali organi e tessuti durante l'età adulta: valutazione mediante il modello meccanicistico del dispendio energetico a riposo. Sono J Clin Nutr. 2010;92(6):1369–77.
3. Li SY, Susztak K. Il ruolo del coattivatore gamma 1alfa del recettore attivato dal proliferatore del perossisoma (PGC -1 alfa) nella malattia renale. Semin Nephrol. 2018;38(2):121–6.
4. Portilla D, Dai G, McClure T, et al. Alterazioni di PPARalfa e del suo coattivatore PGC-1 nell'insufficienza renale acuta indotta da cisplatino. Rene Int. 2002;62(4):1208–18.
5. ForbesJM. Giocatori di potenza mitocondriale nella funzione renale? Tendenze Endocrinol Metab. 2016;27(7):441–4425.
6. Szeto HH, Liu S, Soong Y, et al. Il miglioramento della bioenergetica mitocondriale in condizioni ischemiche aumenta la tolleranza all'ischemia calda nel rene. Am J Physiol Renale Physiol. 2015;308(1):F11– F21.6.
7. Kalogeris T, Baines CP, Krenz M, et al. Biologia cellulare del danno da ischemia/riperfusione. Int Rev Cell Mol Biol. 2012;298:229–317.
8. Gracia-Sancho J, Casillas-Ramirez A, Peralta C. Percorsi molecolari nella protezione del fegato dal danno da ischemia/riperfusione: un aggiornamento del 2015. Clin Sci (Londra). 2015;129(4):345–62.
9. Si veda EJ, Jayasinghe K, Glassford N, et al. Rischio a lungo termine di esiti avversi dopo danno renale acuto: una revisione sistematica e una meta-analisi di studi di coorte che utilizzano definizioni di consenso dell'esposizione. Rene Int. 2019;95(1):160–72.
10. Szeto HH, Liu S, Soong Y, et al. La protezione dei mitocondri dopo l'ischemia acuta previene la sovraregolazione prolungata di IL-1beta e IL-18 e arresta la malattia renale cronica. J Am Soc Nephrol. 2017;28(5):1437–49.
11. Tran MT, Zsengeller ZK, Berg AH, et al. PGC1alpha guida la biosintesi del NAD collegando il metabolismo ossidativo alla protezione renale. Natura. 2016;531(7595):528–32.
12. Tait SW, Verde DR. Mitocondri e segnalazione cellulare. J Cell Sci. 2012;125(Pt 4):807–815.
13. Deng W, Leu HB, Chen Y, et al. La proteina chinasi B (PKB/AKT1) formava complessi di segnalazione con proteine mitocondriali e preveniva la disfunzione energetica glicolitica nei cardiomiociti in coltura durante il danno da ischemia-riperfusione. Endocrinologia. 2014;155(5):1618–28.
14. Kanegae Y, Lee G, Sato Y, et al. Efficiente attivazione genica in cellule di mammifero mediante adenovirus ricombinante che esprime Cre ricombinasi sito-specifica. Ris. Acidi Nucleici 1995;23(19):3816–21.
15. Matsuda T, Cepko CL. Espressione controllata di transgeni introdotti mediante elettroporazione in vivo. Proc Natl Acad Sci US A. 2007 1 16;104(3):1027–32.
16. Lee SA, Cozzi M, Bush EL, et al. Disfunzione d'organo a distanza nella lesione renale acuta: una rassegna. Am J Rene Dis. 2018;72(6):846–856.
Hugo YH Lin1,2,3,4, Buonissimo Chen1, Yu Han Chen1, Albert P. Ta1,2, Hsiao-Chen Lee1,5, Grant R. MacGregor6, Nosratola D. Vaziri1,2, Ping H. Wang1,2,7
1. UC Irvine Diabetes Center e Dipartimento di Medicina, Università della California, Irvine, California
2. Dipartimento di Fisiologia e Biofisica, Università della California, Irvine, California
3. Dipartimento di Medicina, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, Taiwan
4. Dipartimento di Medicina Interna, Kaohsiung Municipal Ta-Tung Hospital, Taiwan
5. Dipartimento di Chirurgia Plastica, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, Taiwan
6. Dipartimento di Biologia cellulare e dello sviluppo, Università della California, Irvine, California
7. Dipartimento di diabete, endocrinologia e metabolismo, City of Hope National Medical Center, Duarte, California