Parte 2: Attività antitumorale dei calconi naturali e sintetici

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3. Attività antitumorale

Calconei derivati ​​agiscono su vari bersagli, come l'aromatasi, il membro 2 della sottofamiglia G della cassetta di legame dell'ATP (ABCG2), la proteina resistente al cancro al seno (BCRP), il fattore di crescita delle cellule B nucleari attivato (NF-kB), il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) e recettori della tirosina chinasi (recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e fattore di transizione mesenchimale-epiteliale (MET), che mostrano importanti attività in vitro e in vivo nei tumori suscettibili e resistenti alla terapia [161,162]. Un importante meccanismo dell'attività antiproliferativa dei calconi è l'inibizione di tubulina e l'interferenza di questi composti con l'assemblaggio dei microtubuli, elementi essenziali per il mantenimento della forma e della funzione delle cellule nei processi di mitosi e replicazione cellulare.I calconi bloccano il ciclo cellulare e induconoapoptosi. La presenza di un residuo di trimetossifenile nelle molecole di calcone è favorevole all'attività antimitotica irreversibile di questi composti, che hanno la capacità di interagire con i residui di cisteina nella tubulina attraverso una reazione di addizione di tipo Michael [163]. Inoltre, la sostituzione del residuo di trimetossifenile nei calconi con una chinolina o una chinazolina è favorevole all'attività anti-tubulina. Questi calconi eterociclici formano legami idrogeno con il resto di Cys241 e si legano fortemente al sito di legame della colchicina (simile alla combretastatina A-4, Figura7) [164,165].

3.1. Calconi naturali con proprietà antitumorali 3.1.1.Licochalcones (AD)

Radici e rizomi di alcune specie di Glycyrrhiza sono usati nella medicina tradizionale per il trattamento di ulcere gastriche, asma e infiammazioni. Sono stati isolati più di 600 composti dalla liquirizia, i principali costituenti biologicamente attivi sono saponine eflavonoidi. Tra i flavonoidi, sono state identificate una serie di retrocalconi, licochalcones A, B, C, D, E e G e schematizzare. Esistono numerosi studi sugli effetti biologici dei composti attivi della liquirizia, il più importante dei qualiantinfiammatorio, proprietà antimicrobiche, antiossidanti, antiulcera, citoprotettive e citotossiche [166,167].

3.1.2. Licochalcone A

Il licocalcone A (LA, tabelle S1 e S2, composto 1) è un flavonoide isolato da Glycyrrhiza urakensis, G.glabra e G.inflata (Fabaceae). Esso haantitumorale, proprietà antinfiammatorie, antimicrobiche, antiparassitarie, antiobesità, antiossidanti e antiosteoporosi,Anticancrol'effetto di LA è stato dimostrato per diversi tipi di cellule tumorali, comprese le cellule tumorali gastriche BCG-823, HepG2, OVCAR-3 e SK-OV-3 (cellule tumorali ovariche) MCF{{ 5}} e A549 [168-171]. Gli studi dimostrano che LA induce l'apoptosi delle cellule di glioma U87, delle cellule tumorali nasofaringee, delle cellule del carcinoma ovarico epiteliale e delle cellule tumorali della vescica. Il calcone ha anche la capacità di aumentare l'autofagia e bloccare il ciclo cellulare nelle cellule del cancro al seno. Inoltre, induce l'apoptosi sopprimendo la specifica proteina 1 nel cancro al seno [172]. LA ha una bassa citotossicità sulle cellule di fibroblasti polmonari embrionali. Inoltre, ha la capacità di inibire la crescita del tumore e di attenuare la tossicità indotta dal cis-platino[173]. I meccanismi mediante i quali i flavonoidi agiscono come agenti antitumorali includono l'inibizione dell'attività di Akt mediante la soppressione della glicolisi tumorale mediata dall'esochinasi-2-nel cancro gastrico, la downregulation dell'espressione della metalloproteinasi 2 e l'induzione dell'apoptosi nelle cellule tumorali orali, aumento della capacità di miR{{16} }p per indurre stress nel reticolo endoplasmatico e indurre apoptosi nelle cellule polmonari umane, ridotta attivazione di PI3K/Akt/mTor e ridotta autofagia nel cancro al seno, blocco della fase G2/M del ciclo cellulare, repressione dell'invasione cellulare da parte di MEK/ERKand ADAM9 segnala le vie nelle cellule di glioma umano e induce l'apoptosi caspasi-dipendente nelle cellule epatiche umane [174]. Un altro meccanismo mediante il quale LA mostra un forte effetto citotossico è l'apoptosi indotta da ROS. Ad esempio, il calcone induce stress ossidativo e, di conseguenza, apoptosi delle cellule T24 (linee cellulari derivate dal carcinoma della vescica urinaria umana) attraverso vie mitocondriali-dipendenti e inducendo processi ossidativi nel reticolo endoplasmatico [175]. Un altro studio sulla citotossicità e genotossicità di LA è stato sviluppato da Bortolotto et al. LA è stata confrontata con il trans-calcone (tabelle S1 e S2, composto 2). La citotossicità dei calconi naturali (LA e trans-calcone) su MCF-7 e 3T3 (linee cellulari di fibroblasti embrionali) è stata determinata a 24 e 48 h. I risultati indicano una marcata attività citotossica dopo 48 h di trattamento. Un test di citotossicità MTT(3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl]-2,5-difenil tetrazolio bromuro) ha mostrato una risposta dose-dipendente sull'MCF{ {45}} cellule trattate con trans-calcone e LA. Per i composti analizzati, la genotossicità è risultata migliore sulle cellule MCF-7 rispetto alle cellule 3T3. La distorsione del DNA provoca ilsistema immuneattivarsi per eliminare le cellule distrutte. Tuttavia, l'attivazione del sistema immunitario per ridurre le cellule del DNA degradate contribuisce a un processo infiammatorio cronico. Inoltre, la risposta cellulare al DNA degradato può essere corretta inducendo una via apoptotica intrinseca. La fase G1 è uno stato che precede la replicazione del DNA, in cui fattori come le condizioni cellulari (metabolismo, segnalazione e dimensione cellulare) influenzano la progressione del ciclo cellulare, provocando la ricostruzione del DNA nelle cellule o avviando il processo di apoptosi.IC50 di LA è 60,46 um. Il trans-calcone induce il blocco del ciclo cellulare nella fase G1 e intensifica l'apoptosi cellulare. È stato proposto che il trattamento con LA e trans-calcone induca l'apoptosi attraverso la via mitocondriale, considerando che l'induzione di geni cruciali di questa via avviene dopo 24 h, come il fattore 1 dell'attivatore della proteasi dell'apoptosi proteica e la proteina X associata a Bcl{{ 9}}. Sebbene sia noto che le linee cellulari MCF-7 hanno un deficit di caspasi 3, uno studio ha dimostrato che il trattamento con questi calconi induce la scissione della poli(ADP-ribosio) polimerasi (PARP), una polimerasi la cui scissione in due frammenti è un indicatore di apoptosi. Repressione

del gene Bcl-2 da LA e trans-calcone in un'analisi sperimentale della PCR ha mostrato, a livello proteico, una somministrazione dose-dipendente alle cellule MCF-7 e una mediazione della via intrinseca. La ciclina D1 è un'altra proteina soppressa sulle linee cellulari MCF-7 in presenza di calconi. Questa proteina è cruciale per la progressione dalla fase G1 alla fase S ed è un importante biomarcatore per alcuni tumori, incluso il cancro al seno. Per questi motivi, la degradazione della ciclina D1 è un bersaglio interessante per l'identificazione di nuovi agenti antitumorali ed è correlata al blocco del ciclo cellulare [176].

Qui et al. ha anche esaminato l'effetto di LA sulle cellule tumorali del polmone in vitro. Il trattamento con flavonoidi ha ridotto significativamente la vitalità delle cellule A549 e H460 (carcinoma polmonare umano non a piccole cellule), questo cambiamento è fortemente influenzato dalla dose. Un totale di 40 μM di licocalcone sopprime la crescita delle cellule tumorali del polmone del 45-80 percento dopo 24 o 48 h di trattamento. Inoltre, il composto mostra una bassa citotossicità sulle cellule epiteliali polmonari umane normali. Per evidenziare se uno dei meccanismi di inibizione della crescita cellulare del cancro del polmone da parte di LA è il blocco del ciclo cellulare, le linee cellulari sono state trattate con differenti concentrazioni del composto per 16 ore, quindi il ciclo cellulare è stato analizzato mediante citometria a flusso.I risultati mostrano che, a seconda della dose, il calcone blocca la fase G2/M sulle cellule A549 e H460. Successivamente, è stato valutato il ruolo dell'induzione dell'apoptosi della LAin utilizzando un'annessina /metodo colorimetrico allo ioduro di propidio. I risultati mostrano che c'è un accumulo di cellule apoptotiche nel gruppo trattato con LA, che dipende dalla concentrazione utilizzata. Inoltre, i livelli di proteine ​​assoc iated con apoptosi sono stati esaminati con il metodo Western blot. I livelli di PARP scisso e caspasi 3 scisso sono elevati e le proteine ​​antiapoptotiche pre-caspasi 3, PARP, Bcl-xL e Bcl-2 sono diminuite 20 h dopo il trattamento con calcone. Questi risultati suggeriscono che l'apoptosi indotta da LA è associata alla via PARP/Bcl-2[177]. I modelli molecolari hanno mostrato che LA era ancorata nelle tasche di legame dell'ATP dell'EGFR, inclusa la mutazione della delezione dell'esone 19, la mutazione a sito singolo L858R, la doppia mutazione L858R/T790M e il tipo selvaggio. Nelle mutazioni L858R/790M, LA ha la capacità di interagire con Lys745 attraverso l'interazione del catione II. I legami idrogeno si formano tra WT EGFR e licochalcone su Met793, Lvs745 e Asp 855. L'eliminazione dell'esone 19 ha la capacità di cambiare la forma della tasca in cui si ritiene che si verifichi l'interazione con il licochalcone, formando legami idrogeno con Met793, Thr790 e Glu762 . I dati ottenuti dalle analisi in silico di LA sono un punto importante per l'identificazione di nuovi inibitori selettivi dell'EGFR su diversi tipi di mutazioni [178].

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3.1.3. Licocalcone B

Anticancrogli effetti del licocalcone B (LB, tabelle S1 e S2, composto 3) sono stati dimostrati mediante analisi su diverse linee cellulari, comprese cellule umane di cancro alla vescica T24 ed EJ, cellule di cancro orale HN22 e HSC4, MCF-7, A375 (una linea cellulare di melanoma umano) e A431 (carcinoma a cellule squamose). Gli studi hanno dimostrato che LB influenza la crescita delle cellule tumorali, inibisce la formazione di metastasi, blocca il ciclo cellulare e induce l'apoptosi[161]. Kang et al. hanno studiato il meccanismo molecolare mediante il quale LB induce l'apoptosi nel melanoma umano e nelle cellule dei carcinomi a cellule squamose. È stato dimostrato che il licocalcone induce l'apoptosi delle cellule A375 e A431 sia per via intrinseca che estrinseca. In caso di test dell'effetto antiproliferativo del calcone con colorazione con blu trypan, è stato osservato che LB induce una significativa diminuzione della vitalità cellulare, questa diminuzione è correlata alla concentrazione Dopo l'aggiunta di LB, sono stati osservati cambiamenti significativi nelle caratteristiche cellulari, tra cui contrazione cellulare, rottura delle membrane cellulari e aumento della percentuale di cellule del nucleo frammentato. Sono state anche notate percentuali aumentate di cellule di fase pre-G1- e cellule apoptotiche [38]. Un altro studio ha mostrato che LB blocca significativamente il ciclo cellulare nella fase G2/M nel caso di linee cellulari di cancro di tipo HepG2- e, nel caso di cellule tumorali della vescica e della mammella, il composto blocca la fase S [179]. Song et al. hanno evidenziato l'effetto soppressivo di LB sulla crescita delle cellule squamose del carcinoma esofageo di tipo JAK2-. Gli studi di docking sono stati eseguiti con il software Autodock Vina, utilizzato per prevedere la modalità di rilegatura. La struttura del recettore JAK2 con potenziale inibitorio è disponibile in Protein Data Bank (file PDB 2B7A, residui 840-1.132). IAK2 svolge un ruolo importante, essendo un mediatore intracellulare della segnalazione delle citochine, ed è una proteina tirosin-chinasi della famiglia JAK. L'ATP si lega fortemente a

ioni magnesio nel dominio catalitico delle tirosin-chinasi. Nel parametro di aggancio, la dimensione dello spazio studiato include il sito di legame dell'ATP caratterizzato da residui 855-863 e 822, dove l'ATP è stato calcolato con vari potenziali inibitori di JAK2. Nelle previsioni fatte, il ligando LB è stato realizzato con il software Marvin Sketch. Dopo l'aggancio, sono state raccolte le tre migliori varianti di legame possibili, che hanno affinità simili. Le conclusioni delle previsioni erano favorevoli per quanto riguarda l'interazione di LB con la tasca di legame dell'ATP a JAK2[180,181].

3.1.4.Licocalcone C

È noto che il licocalcone C (LC, tabelle S1 e S2, composto 4) diminuisce la risposta infiammatoria sulle linee cellulari dei monociti. Ciò è dovuto a una riduzione dell'espressione di iNOS e al ripristino dell'attività della rete antiossidante di superossido dismutasi, catalasi e glutatione perossidasi. Kwak et al. ha condotto uno studio per descrivere la relazione tra ROS, c-Jun NH2 terminal kinase (INK) e p38mitogen-activated protein kinase (MAPK) e ha stabilito l'impatto di LC nell'indurre l'apoptosi sulle linee cellulari di cancro esofageo KYSE 30 e KYSE450. Studi precedenti hanno determinato i valori di IC50 per il trattamento con LC (45 ug/mL) dopo 24 h per inibire la proliferazione delle linee cellulari A549, MCF-7 e T24. Per tre linee cellulari sono state ottenute inibizioni del 40,47 e del 68%. Kwak et al. ottenuto un'inibizione in vitro dipendente dalla dose e dal tempo della proliferazione delle cellule tumorali esofagee. Dai cinque tipi cellulari analizzati, KYSE30 e KYSE450, che hanno un supporto genetico comune, hanno avuto una risposta simile al trattamento con LC. In un'analisi della crescita indipendente dall'ancoraggio in agar morbido, i risultati indicano una significativa riduzione della capacità delle cellule KYSE30 e KYSE450 di formare colonie. A seconda della concentrazione, i calconi hanno indotto l'apoptosi in entrambe le linee cellulari. Il composto ha anche indotto una regolazione verso l'alto di p24 e p27 (regolatori di transizione negativa nelle fasi G1 e S del ciclo cellulare) e ha regolato la ciclina D a valle. LC ha anche aumentato la generazione di ROS nelle cellule KYSE30 e KYSE450. I ROS attivano la via della protein chinasi attivata dal mitogeno (MAPK) e induconoapoptosi cellulare. Inoltre, il composto ha aumentato il livello di fosforilazione di JNK, c-Jun e p38 e ha attivato le vie apoptotiche [182]. Simile allo studio sull'attracco di Song et al. per LB[180], Oh et al. hanno evidenziato le interazioni di legame tra LC e cellule JAK2 umane. La simulazione dell'attracco è stata eseguita utilizzando Autodock Vina. Per avviare lo studio di docking, la struttura del recettore JAK2, che è stata risolta da un esperimento a raggi X, è stata ottenuta dalla Protein Data Bank (file PDB 2B7A). La struttura del ligando LC è stata modellata dal software Marvin Sketch e ottimizzata dal software Chimera. Il sito catalitico di JAK2 era correlato con una regione cerniera (residui 929-935), un DFGloop (residui 994-996) e un Ploop (residui 858-865). La regione della cerniera a forma di anello è essenziale per il riconoscimento dell'ATP e forma legami idrogeno con le sostanze. DFGloop contiene tre aminoacidi (acido aspartico, fenilalanina e glicina) ed è associato al legame di un metallo necessario per la fosforilazione catalitica. Ploop è utile per stabilizzare e formare interazioni con i ligandi. Come si può notare, la previsione di un possibile legame è stata fatta in tre sedi funzionali. Lo studio di Docking ha mostrato che LC interagisce con il sito di legame dell'ATP a JAK2 e ha indicato che JAK2 ne è un bersaglio diretto. Il calcone ha anche soppresso l'autofosforilazione di JAK2 legandosi alla tasca di ATP di p-JAK2 [183,184].

3.1.5. Licochalcone D

Il licocalcone D(LD, tabelle S1 e S2, composto 5) è un flavonoide attivo isolato da Glycyrrhiza inflata. È stato condotto uno studio per valutare la capacità della LD di inibire la proliferazione cellulare da parte di due bersagli per le cellule del cancro del polmone (EGFR e MET) utilizzando cellule umane sensibili e resistenti al gefitinib. Per comprendere il legame diretto del calcone con EGFR e MET, sono state utilizzate linee cellulari sensibili al gefitinib (HCC827) e linee cellulari resistenti al gefitinib (HCC827GR). I risultati delle valutazioni mostrano che il flavonoide si lega a due recettori, sopprimendo l'attività delle chinasi EGFR e MET come inibitore competitivo dell'ATP. Nel complesso EGFR, il calcone ha due legami idrogeno formati da Met793 come punto principale e angolo laterale di Asp855 nell'anello DFG.4-Idrossi-3-(3-metil ma{{13} Il gruppo }enil)fenile e il gruppo 3,4-diidrossi{16}}metossifenile sono fissati sullo stesso piano e bloccati tra i residui idrofobici Leu718, Val726 e Ala743 del ciclo P e Leu 844. Nel complesso Met, il cheto

gruppo del calcone forma un legame idrogeno con Met1160. Tyr1159 come punto principale e le1084, Vall092, Ala1108 e Lys1110 di Ploop erano coperti in modo simile con un berretto. Luis è anche fortemente supportato dalle catene idrofobiche laterali del punto principale di Met1160 e Leu1140, Met1211 e Ala1221 della tasca inferiore dell'ATP. La posizione di legame dell'EGFR assomiglia molto alla posizione di legame del MET, formando legami idrogeno e interazione idrofobica. Il calcone si trova in modo identico nella regione di legame per i due recettori. La stabilizzazione del complesso può essere aumentata dall'interazione idrofobica. I risultati previsti sono stati confrontati con i dati sperimentali, dimostrando che il flavonoide inibisce in modo competitivo i due recettori [185].

3.1.6. Xantoumolo

I calconi prenilici, a causa della loro diversità strutturale, hanno diverse proprietà biologiche, tra cui attività antinfiammatorie, antitumorali e antimutagene [186]. Gli studi hanno dimostrato che i calconi naturali con gruppi prenilici hanno il potenziale di interferire con p53. Ad esempio, il trattamento delle cellule A549 con prenil calcone xantoumolo (XN, Tabelle S1 e S2, composto 6) induce la morte cellulare apoptotica e blocca il ciclo cellulare nella fase G1. Queste attività sono dovute alla sovraregolazione di p53 e p21 dal ciclo cellulare e alla sottoregolazione della ciclina D1. L'apoptosi è indotta dall'attivazione della caspasi 3 [187].

XN((3'-(3,3-dimetilallil)-2',A',4-triidrossi-6'metossicalcone) è il flavonoide prenilato più abbondante({{7 }}.1-1 percento in peso secco) di infiorescenze femminili di luppolo (Humulus lupulus)[180]. XN è anche un costituente della birra, una delle principali fonti alimentari di prenilatoflavonoidi, dove è presente in concentrazioni superiori a 0.96 mg/L. A causa delle sue attività biologiche uniche e del suo impatto favorevole sulla salute, il prenilcalcone è stato ampiamente studiato di recente [188]. Il composto ha sicurezza terapeutica e varie bioattività, comprese proprietà antitumorali, antidiabetiche, antinfiammatorie, antiossidanti e antibatteriche. Negli ultimi anni, un numero maggiore di studi ha dimostrato un ampio spettro di attività antitumorale dell'XN nel cancro del polmone, carcinoma epatocellulare, cancro al seno, leucemia, cancro alla prostata, cancro del pancreas, cancro del colon, cancro del pancreas e cancro del glioblastoma. L'esposizione delle cellule tumorali all'XN inibisce la loro proliferazione, migrazione e invasione e modula l'autofagia. Il calcone ha anche la capacità di indurre l'apoptosi e bloccare il ciclo cellulare [189-193]. Inoltre, il calcone induce l'apoptosi dipendente e indipendente dall'attività della caspasi e inibisce l'invasione delle cellule tumorali e l'angiogenesi [194]. Le sue proprietà antinfiammatorie, antiossidanti e antitumorali sono correlate all'effetto chemiopreventivo del composto [195]. Il prenilcalcone viene anche metabolizzato in 8-prenilnaringenina, il fitoestrogeno più potente conosciuto fino ad oggi [196].

Akt (chiamato anche protein chinasi B o PKB) è una specifica serina/treonina-protein chinasi e un punto importante nelle vie di segnalazione cellulare. L'attività di Akt è alterata in molti tipi di cancro e coinvolta in vari processi biologici, tra cui proliferazione cellulare, apoptosi, trascrizione, migrazione e invasione. Per confermare la capacità di XN di legarsi ad Akt, è stato eseguito uno studio di docking in silico utilizzando il software Schrodinger Suite 2015. Le molecole d'acqua sono state rimosse e il pH degli atomi di idrogeno considerato era 7. Per lo studio di aggancio è stato generato un sito di legame dell'ATP. XN è stato preparato per l'aggancio in assenza di parametri utilizzando il programma LigPrep. Successivamente, gli studi di docking di XN con Aktl e Akt2 sono stati accompagnati da parametri assenti utilizzando il metodo di precisione aggiuntiva con il programma Glide al fine di ottenere le migliori rappresentazioni strutturali. I risultati dello studio di docking mostrano che XN forma legami idrogeno con Ala230, Glu228, Glu234 e Lys158 di Akt1 e con Glu236, Thr213 e Lvs181 di Akt2. Sono stati identificati modelli di xenotrapianto (PDX) per tradurre gli studi di ricerca di base in applicazioni cliniche. In misura maggiore, le caratteristiche biologiche e genetiche dei pazienti donatori sono considerate preservate dai modelli PDX, che è il principale vantaggio rispetto ai modelli basati su linee cellulari. I modelli PDX sono stati utilizzati per analizzare i biomarcatori e per predire la risposta alla terapia con XN negli studi clinici. Gli effetti chemiopreventivi del prenilcalcone sono stati confrontati in base ai livelli di Akt. I risultati mostrano che i modelli tumorali che esprimono un alto livello di Akt hanno una significativa diminuzione del volume e del peso del tumore quando trattati con XN [197]. Guo et al. ha studiato in vitro e in vivo l'effetto dell'XN nel cancro gastrico, dimostrando che il prenilcalcone induce l'apoptosi attivando le caspasi, regolando Bcl-2 e influenzando la chinasi PI3K/Akt/mTOR. L'XN inibisce la vitalità delle cellule del cancro gastrico in modo dipendente dalla concentrazione. Sulle linee cellulari, il flavonoide esercita l'effetto migliore sulla vitalità delle cellule SGC-7901 e non influenza questo parametro sulle cellule GES-1 a 6, 8 e 10 ug/mL di calcone. Dall'analisi citofluorimetrica, è stato osservato che il prenilchalone aumenta significativamente il numero di cellule apoptotiche nel cancro gastrico. L'effetto di XN sulle proteine ​​​​pro e anti-apoptotiche è stato evidenziato dall'analisi Western blot. I livelli di proteine ​​Bcl-2 e Bcl-XL sono diminuiti dopo la somministrazione di flavonoidi, questa diminuzione è correlata alla concentrazione somministrata. XN ha anche aumentato i livelli di proteine ​​​​Bax e Bid, con la migliore attività osservata per 10 uM/mL di calcone. Inoltre, i livelli di caspasi 3 scissa e proteina PARP scissa sono aumentati significativamente in presenza di calcone. Per questi motivi si può affermare che i flavonoidi influenzano favorevolmente e significativamente i livelli di proteine ​​pro e antiapoptotiche. Un totale di 10 uM/mL di XN induce un'apoptosi significativa delle cellule SGC-7901. Un totale di 8 e 6 uM/mL di calcone induce l'apoptosi rispettivamente del 34±3% di cellule e del 23±2% di cellule. Inoltre, il flavonoide modifica in modo significativo la fosforilazione di PI3K, Akt e mTOR aumenta il livello di p-PTEM e diminuisce il livello di p-Akt (Thr308), p-Akt (Ser473) e m-Tor (Ser2448). I dati risultanti indicano che il prenilcalcone non influenza in modo significativo i livelli di Akt, PTEN, GSK-3 e mTOR. Le determinazioni nei topi xenotrapianti SGC7901 hanno mostrato che il trattamento con XN ha ridotto il volume del tumore in modo relativamente dipendente dalla concentrazione. Per confermare la soppressione della segnalazione PI3K/Akt in vivo, è stata valutata l'espressione fosforilata di Akt e mTOR su tumori xenografici. L'esame patologico delle sezioni di ematossilina ed eosina ha rivelato significative anomalie morfologiche. Tuttavia, XN riduce i livelli di Akt e mTOR fosforilati dipendenti dalla concentrazione. Il trattamento con prenilcalcone ha ridotto significativamente la proliferazione cellulare e aumentato l'apoptosi delle cellule tumorali rispetto alle cellule di controllo [198].

L'XN, a concentrazioni superiori a 10 umol/L, inibisce la proliferazione delle cellule tumorali del pancreas in vitro. A concentrazioni inferiori a 5 umol/L, il calcone inibisce l'attività angiogenica NF-kB-dipendente nelle cellule tumorali del pancreas. A questa concentrazione, non è stata osservata citotossicità sulle cellule pancreatiche con il metodo WST-1. Tuttavia, la conclusione dello studio è stata che l'XN influenza l'angiogenesi indotta dal cancro del pancreas sottoregolando la produzione di VEGF e IL{7}} (un'interleuchina), che è specifica e mediata dall'inattivazione di NF-kB [194]. valutare l'attività antitumorale di XN, le linee cellulari HepG2 sono state sottoposte all'analisi MTT per determinare la proliferazione cellulare. Il prenilcalcone ha ridotto la proliferazione cellulare a seconda della concentrazione e del tempo. Zhao et al. ha osservato che l'esposizione delle linee cellulari a 200 μM di XN per un giorno è meno efficace rispetto al trattamento con 100-200 μM di calcone per 2-3 giorni. A 50 uM di calcone, dopo 3 giorni è stata osservata una significativa inibizione della proliferazione delle cellule HepG2. Nello stesso studio, è stato dimostrato che il prenilcalcone provoca un aumento significativo dell'attività della caspasi 3. Inoltre, dall'analisi Western blot, è stato dimostrato che 100-150 uM di XN inibiva significativamente l'espressione della proteina NF-kB sulle linee cellulari. Con questa analisi, è stato anche osservato che il prenilcalcone ha la capacità di aumentare l'espressione della proteina p53 e 20 uM di XN determinano un'intensificazione della segnalazione di Bax, correlata con il tempo [199]. Studi sul profilo di sicurezza dell'XN mostrano che 1000 mg/kg del composto non alterano il funzionamento degli organi vitali e l'omeostasi nei topi. Il prenilcalcone ha la capacità di aumentare la produzione di IL-2 nei linfociti T, il che dimostra la sua capacità di promuovere una risposta immunitaria mediata da The. XN inibisce anche -12. che produce indirettamente la differenziazione delle cellule del sistema immunitario attivando molecole di trascrizione. I linfociti citotossici sono un tipo di effettore cellulare cruciale per l'immunità cellulare e svolgono un ruolo importante nel processo di immunologia antitumorale. I linfociti citotossici CD8 più T esistono come CTL-P, un precursore cellulare inattivo in vivo. Questo precursore viene attivato dall'antigene in presenza di citochine Th1 e quindi si sviluppa in linfociti T citotossici maturi. È stato dimostrato un aumento significativo di CD8 plus /CD25 plus, seguito dalla transizione da Th2 a Th1 nel microclima tumorale. Il rapporto CD8 più /CD25* delle cellule T è notevolmente aumentato quando i linfociti T citotossici sono attivati ​​da CoCl2 sulle linee cellulari 4T1. La funzione delle cellule Th1 e Th2 dipende dalla secrezione di varie citochine. Per studiare gli effetti di XN sulle citochine Th1 e Th2, Zhang et al. determinato i livelli sierici di citochine Th1l e Th2-associate utilizzando kit ELISA. È stato dimostrato che il derivato prenilico aumenta significativamente l'espressione della citochina Th1 (inclusi IL-2 e IFN-y) e diminuisce i livelli di citochina Th2 (inclusi IL-4 e IL{50}}). Questa conclusione è spiegata dal fatto che Th1 e Th2 sono inibitori reciproci. Inoltre, il rapporto Th1/Th2 è stato determinato mediante citometria a flusso, dimostrando che è significativamente aumentato da XN. Studi simili hanno riportato questo risultato per vari tumori. I pazienti con carcinoma a cellule squamose avanzate del collo e della testa hanno bassi livelli di citochine Th1 rispetto ai pazienti che sono meno gravi e hanno livelli elevati di citochine Th2. La terapia di combinazione produce la transizione delle citochine Th2 a Th1 nell'ambiente tumorale. I risultati degli studi indicano un disturbo del rapporto citochine Th1/Th2, questo cambiamento è stato osservato per diversi tipi di tumori, più frequentemente negli stadi terminali del cancro. Per confermare il potenziale meccanismo di XN sul rapporto di citochine Thl/'Th2, è stata determinata l'espressione di fattori chiave nel percorso di differenziazione di Th1 e Th2. Fisiologicamente, le cellule Th0 sono differenziate proporzionalmente in cellule Thl e Th2. Inoltre, l'attivazione delle molecole trascrizionali 4 e 6 gioca un ruolo fondamentale nel differenziare le cellule Th0 a Th1 e Th2. Anche T-bet e GATA-3 svolgono due ruoli fondamentali. CpG-ODN (citosina-fosforotioato-guanina contenente un oligodeossinucleotide), un potente adiuvante Th1, diminuisce l'espressione di GATA-3 e l'attivazione della molecola trascrizionale 6 attivando T-bet e le molecole trascrizionali 1 e 4 nei modelli di cancro del polmone. XN aumenta l'espressione T-bet e diminuisce l'espressione GATA-3. L'attivazione della molecola trascrizionale 4 è aumentata in presenza di XN, ma non influenza l'attivazione della molecola trascrizionale 6. Per tale motivo si può affermare che l'attivazione della molecola trascrizionale 4 gioca un ruolo positivo nella regolazione della citochina Th1/Th2 rapporto di XN [200].

La via di segnalazione del notch gioca un ruolo significativo nel cancro al seno, che è un bersaglio terapeutico per il suo trattamento. È coinvolto nell'inizio e nella progressione del cancro al seno, l'attività aberrante di questo percorso è associata a questa patologia. L'inibizione della via di segnalazione di Notch da parte degli inibitori della gamma-secretasi e dell'anticorpo monoclonale anti-delta-simile 4 è favorevole per il trattamento della leucemia linfoblastica acuta e dei tumori solidi. I meccanismi di questi agenti includono il blocco del ciclo cellulare o l'apoptosi e l'interruzione dell'angiogenesi. Sole et al. ha studiato il potenziale terapeutico dell'XN sulle linee cellulari di cancro al seno, evidenziando la sua capacità di inibire la proliferazione cellulare, bloccare il ciclo cellulare e indurre l'apoptosi in vitro. È stata anche determinata una riduzione della crescita del tumore in vivo. Inoltre, è stata studiata la possibilità del prenilcalcone di inibire la crescita delle cellule di cancro al seno umano mediante la via di segnalazione di Notch. Per determinare se XN prende di mira la via di segnalazione Notch, è stato utilizzato un metodo Notch 1 funzionalizzato, utilizzando un inibitore della gamma-secretasi (DAPT) come controllo. Lo scopo dello studio era di valutare la possibilità che il prenilcalcone riduca l'attività di legame del transgene Notch1 al CBF1. È stato dimostrato che l'XN inibisce la proliferazione e induce l'apoptosi inibendo la via Notch 1. Inoltre, con il metodo MTT e la microscopia ottica, è stato dimostrato che il prenilcalcone inibisce la proliferazione cellulare sulle linee cellulari di cancro al seno. Precedenti studi hanno dimostrato che gli inibitori della via di Notch sono anche inibitori dell'espressione di EGFR, un altro elemento incriminante nel cancro al seno. Inoltre, l'XN agisce sulle proteine ​​associate alle metastasi tumorali e inibisce la migrazione cellulare aumentando l'espressione di queste proteine. Uno studio ha evidenziato il blocco del ciclo cellulare nella fase G0/G1 e l'induzione dell'apoptosi per le cellule MCF-7 e MDA-MB-231 da parte di XN [201].

3.1.7.Panduretina A

Anticancroè stata studiata l'attività del pandurato A (PA, tabelle S1 e S2, composto 7), un cicloesanilcalcone isolato da Boesenbergia pandurato. La pianta contiene calconi prenilici e altri flavonoidi come principali molecole bioattive, descritte in letteratura come dotate di proprietà citotossiche preferenziali sulla linea cellulare pancreatica umana PANC-1. [202,203] L'AP è attivo nel melanoma, nell'adenocarcinoma del colon e nel cancro alla prostata. Le analisi proteomiche mostrano che la PA ha citotossicità sulle cellule di melanoma che dipende dalla denaturazione del processo di fosforilazione ossidativa mitocondriale, con l'attività della via secretoria e l'apoptosi indotta dai processi ossidativi. A questo proposito, è stato dimostrato che lo stress ossidativo può essere il risultato della stimolazione dell'autofagia come risposta secondaria a ROS elevati [204]. La letteratura indica che una concentrazione di 9 ug/mL di PA inibisce completamente la crescita delle cellule MCF-7 e delle cellule HT-29 (una linea cellulare di cancro del colon umano)[205]. Il calcone ha proprietà antitumorali su vari tipi cellulari, inclusi melanoma, adenocarcinoma del colon e cancro alla prostata [204]. Liu et al. ha evidenziato l'effetto citotossico del calcone sulle linee cellulari MCF-7, T47D (cancro al seno umano) e MCF-10A (cellule mammarie non tumorali). I valori IC50 di PA sulle cellule MCF-7 erano 15 μM a 24 ore e 11,5 μM a 48 ore. Nel caso delle cellule T47D, l'IC50 era 17,5 μM a 24 ore e 14,5 μM a 48 ore. La PA non influenza la proliferazione delle cellule MCF-10A. Per identificare i meccanismi mediante i quali il calcone induce il blocco del ciclo cellulare nelle cellule MCF-7 nella fase GO/G1, è stata utilizzata l'analisi Western blot, che mirava a valutare la modulazione delle proteine ​​regolatrici nel ciclo cellulare. I risultati mostrano che il trattamento con PA induce una diminuzione dell'espressione della ciclina D1 e CDK4 e aumenta l'espressione di p21Cip1 e p27, spiegando così il blocco nella fase G0/Gl. La PA isolata da Kaempferia pandurate induce il blocco del ciclo cellulare nelle cellule PC{41}} indipendenti dagli androgeni (adenocarcinoma prostatico) e nelle cellule umane DU145 (una linea cellulare di cancro alla prostata umana). La frammentazione del DNA internucleosomale è un marker di apoptosi. Poiché i frammenti di DNA a basso peso molecolare vengono estratti colorando le cellule in soluzioni acquose, le cellule apoptotiche possono essere identificate mediante istogrammi di frequenza del contenuto di DNA sotto forma di cellule con contenuto di DNA frazionato. È stata analizzata una popolazione cellulare MCF di fase sub-G1-7. Il contenuto di fase G1 delle cellule era 1,17 ± 0,11 e nelle cellule trattate con PA (10,15 e 20 μM) era 1,84 ± 0,18,2,62 ± 0,21 e 4,52 ± 0,28, rispettivamente. L'aumento del trattamento con calcone era dovuto all'intensificazione della frammentazione del DNA sulle linee MCF-7, un fatto confermato dalla popolazione cellulare della fase sub-G1 [206].

Tra le proteine ​​chiave dell'invasione e della metastasi delle cellule tumorali, l'induzione è rappresentata dalle metalloproteinasi della matrice. Degradano i componenti della matrice extracellulare e facilitano l'invasione e la migrazione delle cellule. Inoltre, la sovraespressione delle metalloproteinasi può indurre la transizione epiteliale-mesenchimale. La PA sopprime la secrezione e l'attivazione della metalloproteinasi 2, causando l'inibizione della migrazione, dell'invasione e della morfogenesi delle cellule endoteliali sulle cellule delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). Inoltre, dosi subtossiche di calconi sono sufficienti per sottoregolare la metalloproteinasi 2 nelle cellule tumorali del polmone [207].

3.1.8. Cardamonina

Cardamon(CD, Tabelle S1 e S2, composto 8), un calcone di Campomanesia adamantium(Myrtaceae), aumenta la frammentazione del DNA e diminuisce l'attività di NF-kB nelle cellule PC-3. Questi risultati indicano il potenziale terapeutico del calcone nel trattamento del cancro alla prostata [20]. Il CD è considerato uno dei composti antitumorali più attivi in ​​cui è coinvolta l'attivazione del virus di Epstein-Barr [208]. Gli effetti antitumorali del CD sono correlati con l'induzione dell'apoptosi, l'inibizione della proliferazione e migrazione cellulare e un'influenza sul ciclo cellulare. Il calcone ha anche la capacità di ridurre la resistenza delle cellule tumorali alla terapia. In combinazione con 5-fluorouracile o cis-platino, si ottiene un aumento delle attività antitumorali. Ad esempio, il CD ha la capacità di inibire significativamente la resistenza alla chemioterapia delle cellule tumorali del colon, induce l'apoptosi, attiva le caspasi 3 e 9, facilita l'espressione della proteina Bax, inibisce significativamente c-myc e trasporta 50 e NF-kB specifici [209 ]. Hou et al. ha studiato il potenziale terapeutico e i meccanismi molecolari della MC su 5-cellule di cancro gastrico resistenti al fluorouracile. La sensibilità del BGC-823/5-fluorouracile al 5-fluorouracile è stata confermata aumentando l'apoptosi e bloccando il ciclo cellulare in presenza di CD. Il calcone aumenta la sensibilità delle cellule tumorali al 5-fluorouracile sopprimendo la via di segnalazione Wnt/-catenina (che svolge un ruolo significativo nella tumorigenesi) e le mutazioni attivate nei geni Wnt/-catenina sono associate alla resistenza alla terapia antitumorale . Inibisce l'espressione della glicoproteina P, della catenina e del TCF-4. Inoltre, CD blocca in modo specifico la formazione del complesso -catenina/TCF-4, causando così una segnalazione aberrante di Wnt/ -catenina [210]. Camera da letto et al. studiato gli effetti antiproliferativi e apoptotici del CD sulle cellule HepG2. L'azione inibitoria di

il calcone sulla proliferazione delle cellule HepG2 era significativo dopo 72 ore, la citotossicità era simile a quella del 5-fluorouracile. I valori determinati per altri agenti chemioterapici usati come standard (p. es., sorafenib) erano molto più bassi. Inoltre, l'effetto citotossico del composto è selettivo sulle cellule tumorali e non influenza negativamente le cellule normali, il che è un vantaggio del CD rispetto al 5-fluorouracile. L'accumulo di CD nella fase G1 del ciclo cellulare è stato osservato dopo 72 ore e indica l'inibizione della crescita cellulare HepG2 prevenendo la divisione cellulare [211].

Studi comparativi sull'aggancio di CD e{0}}fluorouracile e la sua interazione con BaxBH3 mostrano che 5-fluorouracile ha un'energia di legame maggiore di un CD. Il calcone forma tre legami idrogeno (Phe30, Val50 e Gln52). L'interazione tra CD e Bcl è ottenuta da tre legami idrogeno (Asp15, Gln18 e Ser28) e nel caso del 5-fluorouracile è ottenuta da quattro legami. Inoltre, nel caso di questa interazione, l'energia di legame del CD è inferiore rispetto al caso del 5-fluorouracile. Ciò può essere attribuito a residui aromatici nella struttura del calcone, che sono coinvolti in II legami, che hanno la capacità di stabilizzare la tasca attiva e causare una diminuzione dell'energia di legame. I risultati di studi in silico mostrano che 5-il fluorouracile ha energie di legame più elevate rispetto alla caspasi 3 rispetto a CD. CD mostra due legami idrogeno nell'interazione con la caspasi 3 (Cys163 e Arg64). Il calcone ha anche legami II-II con TYR204. L'energia di legame libera del 5-fluorouracile è superiore a quella del CD, il che si spiega con la stabilizzazione della tasca attiva da parte di due residui aromatici nella struttura del calcone [212].

3.1.9. Lonchocarpino

Il Lonchocarpin (Tabelle S1 e S2, composto 9) è un calcone naturale estratto dal Lonchiocarpus sericeus. Gli effetti citotossici di questo calcone sono stati descritti su linee cellulari di neuroblastoma e leucemia. È noto che 24 ore dopo il trattamento con lonchocarpin 50 uM sulle linee di neuroblastoma SK-N-SH, avviene l'induzione della fosforilazione dell'AMPK, che aumenta l'assorbimento del glucosio e inibisce la sintesi proteica. Il calcone ha anche la capacità di ridurre la vitalità cellulare. Sulle linee cellulari di cancro del colon-retto HCT116, SW480 e DLD, la loncocarpina riduce la vitalità cellulare di 20 μM. Gli studi dimostrano che la loncocarpina ha la capacità di inibire le cellule tumorali del polmone H292 in vitro mediante la morte cellulare-3-indotta dalla caspasi che precede l'apoptosi. Inoltre, è stato osservato che la lonchocarpina inibisce la segnalazione di Wnt/-catenina in vivo in modelli embrionali di Xenopus laevis. L'iniezione del calcone in un modello di recettore specifico Wnt8-co-iniettato (SO1234) ha comportato una soppressione dell'82% dell'attivazione del gene del recettore di segnalazione Wnt/-catenina [213].

In uno studio di Chen et al., i risultati dell'analisi 3D-QSAR indicano un idrofobo C-4, C-5, C-11, C-1/ e C -2 interazione in lonchocarpin. Questa interazione aumenta la capacità citotossica di questo composto, avendo un contributo del 23 percento nel modello. Gli studi di ancoraggio per lonchocarpin hanno prodotto gli stessi risultati del modello idrofobo 3D-QSAR, con la superficie idrofobica in C-4, C-5, C-11, C-1' e C-2'regioni di loncocarpina che interagiscono con il complesso Bcl-2. Il ciclo idrofobico della proteina Bcl-2 forma un complesso con il peptide BaxBH3, che può essere interrotto da composti sintetici di navitoclax o lonchocarpin. Ciò mostra che il ciclo idrofobico dei membri della famiglia Bcl-2 è un bersaglio per l'apoptosi indotta da loncocarpina sulle cellule H292 e quindi per l'attivazione della caspasi 3 [214].

Altri calconi naturali con proprietà antitumorali sono buteina (tabelle S1 e S2 composto 10), isoliquiritigenina (tabelle S1 e S2, composto 11), flavokawaina (tabelle S1 e S2, composto 12) e isobavachalcone (tabelle S1 e S2, composto 13) [155].

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