Parte 2: Composti bioattivi da Ephedra Fragilis: ottimizzazione dell'estrazione, caratterizzazione chimica, attività antiossidanti e antiglicazione
Mar 26, 2022
Per maggiori informazioni. contattotina.xiang@wecistanche.com
2.7.Attività antiglicazione
2.7.1.Analisi UV-Visibile
Lo spettro UV-vis è una tecnica veloce, coerente e semplice comunemente usata per rilevare i cambiamenti conformazionali delle proteine e la formazione complessa. Gli spettri di assorbimento della BSA nativa e glicata incubati per 15 giorni in presenza o assenza di CEE/frazioni nonchéquercetina(controllo positivo) sono presentati nella Figura 3A.
È stato chiaramente dimostrato che la BSA nativa mostra un picco caratteristico a 入2s0 nm, dovuto principalmente agli amminoacidi aromatici, tra cui tirosina, triptofano e fenilalanina [47].
Dopo la modifica con il glucosio, l'assorbanza a λ280 nm era del 60,57% più ipercromica rispetto alla BSA nativa. L'aumentata intensità di assorbimento a 入2s0 nm può essere attribuita al dispiegamento indotto dalla glicazione dell'elica proteica, che può influenzare la sua normale funzione fisiologica.
Treatment with CEE/fractions reduced significantly the absorbance at入2so nm compared to glycated BSA, and this reduction varied markedly between fractions according to the solvent polarity. Overall, descending antiglycation activity was portrayed as EAF>WBF>DMF>CCE>WF>HE, che erano 1.82, 1.71, 1.57, 1.35, 1.28 e 1.13-più basso della BSA glicata. Tuttavia, questa attività è stata notevolmente inferiore a quella diquercetinautilizzato come controllo positivo (2.24-volte inferiore rispetto alla BSA glicata). Quindi, dagli studi di assorbimento si può concludere chiaramente che l'EAF di E.fragilis possiede un effetto protettivo contro lo sviluppo della BSA indotto dalla glicazione proteica.
2.7.2. Inibizione della glicazione proteica nel modello BSA-Glu
Gli AGE sono un gruppo eterogeneo di composti con caratteristiche di fluorescenza a λ440 nm quando eccitati a 入370 nm. La capacità di CEE e delle sue varie frazioni di E. fragilis di inibire la formazione di AGE è stata valutata utilizzando il test BSA-glucosio e i risultati sono presentati nella Figura 3B.
Come evidenziato dalla Figura 3B, il tasso di inibizione degli AGE di tutti i campioni testati ha mostrato una tendenza al rialzo con l'aumento delle concentrazioni. A 1 mg/mL, CCE, HE, DME EAE, WBF, WF e quercetina hanno inibito la formazione di AGE di 53,26,39,83,54,82,76,68,69.09,48,83 e 97,84%, rispettivamente, dopo l'incubazione per 15 giorni. L'EAF(ICs =0.375±0.034 mg/mL) è stato l'inibitore degli AGE più efficace tra tutte le frazioni, seguito da WBF, DMF, CCE e WF con IC5 0 valori di 0,595 ± {{30}}.047, 0,857 ± 0,018, 0,951 ± 0,099 e 1,044± 0,032 mg/mL, rispettivamente. HF ha mostrato l'attività più debole con il valore ICso di 1,212±0,063 mg/mL.
L'altoantiglicazioneil potenziale di EAF potrebbe essere dovuto all'elevata quantità di contenuti fenolici e flavonoidi, che sono stati descritti come ottimi inibitori della formazione di AGEs [48]. Zhang et al. [31] rispetto a quello delle sue frazioni di diclorometano, n-butanolo e acqua.
Come indicato nella Tabella 5, l'inibizione degli AGE era fortemente correlata in modo positivo a entrambi TF(r=0.950;p<0.01)and tp(r=""><0.01)contents, which="" were="" in="" line="" with="" previously="" reported="" studies="" [2,29].="" the="" ages="" inhibition="" was="" also="" correlated="" in="" a="" positive="" way="" to="" dpph",abts,h2o2,reducing="" power,="" tac,andβ-carotene="" assays="" withr="">
r=0.914,r=0.983, r=0.975,r=0.923 e r=0.963 (p<0.01),respectively. these="" reflected="" that="" ages="" inhibition="" is="" linked="" to="" the="" efficiency="" of="" primary="" antioxidants="" [6].="" kaewseejan="" and="" siriamornpun="" [29]="" also="" reported="" that="" phenolic="" compounds="" prevented="" the="" formation="" of="" ages="" through="" its="">scavenging dei radicali liberieantiossidantecapacità.
2.7.3. Effetti sull'ossidazione delle proteine indotta dalla glicazione
La glicazione delle proteine (reazione di Maillard) è una reazione iniziata dall'attaccamento covalente dello zucchero riducente ad un gruppo amminico di proteine (principalmente residui di lisina e arginina), che porta a produrre un prodotto instabile e reversibile cioè la base di Schiff che subisce ulteriormente il riarrangiamento di Amadori per formare prodotti Amadori di ketamina più stabili. Successivamente, i prodotti Amadori subiscono una reazione endiolo per produrre proteine carbonilate [48]. La degradazione di questa ketamina potrebbe generarei radicali libericome i radicali superossido, che vengono ulteriormente convertiti nella reazione di HO·via Fenton, causando danno ossidativo e cellulare [49].
Protein oxidation is accompanied by carbonyl protein formation and loss of protein thiols, which are often employed as protein oxidation indicators[50]. As given in Figure 3C, the level of carbonyl content in native BSA was 1.16±0.04 nmol/mg protein, which was increased to more than 3.62-fold (4.21 ± 0.10 nmol/mg protein) upon glycation. The treatment with CEE and its various fractions reduced the level of carbonyl content with the increase of samples concentrations ranging from 0.1 to 1 mg/mL. Furthermore, the inhibition effect of quercetin on the formation of carbonyl proteins was stronger than that of all fractions at every concentration point. When the concentration was 1 mg/mL, CEE, HF, DMF, EAF, WBF, WF, and quercetin decreased the level of carbonyl content by 42.29, 17.37,58.68,73.44,69.17,28.84,and 98.68%, respectively, compared to native BSA. Overall descending, the inhibition of carbonyl content formation was portrayed as Q>EAF>WBF >DMF > CCE> WF >HF.
Gli effetti di CEE/frazioni sull'ossidazione dei tioli proteici indotta dalla glicazione sono presentati nella Figura 3D. Nella BSA nativa, il livello di proteina tiolo era 1.06± 0.086nmol/mg di proteina, che era diminuita di oltre tre volte(0 .34± 0,021 nmol/mg di proteine) nella proteina glicata. In presenza di CEE/frazioni, il livello del gruppo tiolo è stato significativamente aumentato in modo dose-dipendente compreso tra 0,1 e 1 mg/mL. Inoltre, il livello di tiolo proteico è aumentato nel seguente ordine: HF<><><><>
Risultati simili sono stati osservati nella pianta Teucrium polium poiché l'EAF era più efficace delle altre frazioni (etere dietilico e frazioni acquose) contro l'ossidazione delle proteine mediata dalla glicazione[51]. Nel loro studio, Golshahi e Bahramikia [52] hanno anche riportato risultati simili quando hanno utilizzato diversi solventi con polarità crescente (etere dietilico e acqua) nella scissione di una pianta medicinale Trachyspermum copticum. Secondo questi autori, l'EAF ha il più potente effetto protettivo contro l'ossidazione delle proteine mediata dalla glicazione, seguita a distanza da quella dell'etere dietilico e dell'acqua. Ciò dimostra la presenza nell'EAF di tali composti che potrebbero possedere un effetto preventivo contro i danni ossidativi alle proteine indotti dall'iperglicemia, che si ritiene si verifichi nei processi di glicoossidazione riducendo la formazione di carbonile proteico e proteggendo i tioli proteici dall'ossidazione come suggerito dai dati.
2.8.Composti fenolici identificati nell'EAF
L'EAF, che ha mostrato la più alta attività biologica da altre frazioni, è stato selezionato per l'identificazione dei suoi principali composti bioattivi mediante RP-HPLC. Un numero totale di sei composti è stato identificato confrontando il loro tempo di ritenzione con quello degli standard di riferimento. I composti fenolici identificati sono presentati nella Figura 4. Gli acidi gallico, vanillico, caffeico e ferulico sono stati identificati come acidi fenolici, mentre solo due composti, vale a dire la rutina e la quercetina, sono stati identificati come flavonoidi. Secondo uno studio di Soumaya et al. [53], acido ferulico, luteolina-7-O-glucoside, miricetina e kaempferol 3-O-rutinoside sono stati identificati come presenti nell'EAF di parti aeree di E.fragilis tunisino, mentre la presenza di rutina , quercetina, acido gallico e acido caffeina sono stati rilevati solo per la prima volta nel nostro studio. La disparità nella composizione chimica dell'EAF ottenuto dalla stessa specie vegetale può differire in diverse parti di una pianta, lo stadio di sviluppo della pianta, le condizioni di crescita (ad esempio, suolo, luce, temperatura, acqua, umidità e fertilizzanti), tempo di raccolta, il sistema di essiccazione e la procedura di estrazione [54]. I risultati ottenuti dal profilo fitochimico dell'impronta digitale hanno mostrato una buona ricchezza di E.fragilis che aveva diversi composti fenolici che sono considerati i principali contributori allo scavenging dei radicali liberi e alle attività antiossidanti [55]. Inoltre, questi composti sono noti per le loro potenti capacità antiglicative [48]. Diversi studi hanno messo in luce il collegamento diretto tra le attività antiossidanti dei composti fenolici e le loro capacità antiglicative.
2.9. Studio di Docking Molecolare di Composti Identificati
Per visualizzare chiaramente il meccanismo dettagliato mediante il quale i composti identificati nell'EAF di E. fragilis si legano con BSA e RAGE, abbiamo eseguito uno studio di docking molecolare. I risultati di ancoraggio sono presentati nella Tabella 6, mentre le interazioni tra il composto più attivo e i target sono mostrate nella Figura 5. I risultati hanno mostrato che la quercetina si adattava perfettamente al sito di legame, situato nella cavità idrofobica del sottodominio IB di BSA con l'energia di legame più bassa di { {2}}.7 kcal/mol (Figura 5A). Al contrario, è stata ottenuta una minore energia di legame con acido ferulico, acido vanillico, acido caffeico, acido gallico e rutina (-6.35,{{7} }.05, -5.84,-5.25 e-4.41 kcal/mol, rispettivamente). Di solito, un alto grado di negatività dell'energia di legame è più efficace e il composto verrebbe utilizzato per controllare i processi di glicazione. Dalla Figura 5B, è chiaro che la quercetina forma otto legami idrogeno con SER109, ASP111, LEU112, LEU115, ARG144, ARG185 e ARG458 di BSA e quattro interazioni idrofobiche mediate dagli amminoacidi alifatici (PRO110, PRO113, LYS114 e ARG144) . Inoltre, quattro amminoacidi (ASP108, HIS145, LEU189 e LEU462) che circondano la quercetina hanno interagito tramite le forze di van der Waal. È stato riportato che lisina e arginina sono i principali residui di amminoacidi coinvolti nel processo di glicazione [56]. Pertanto, il mascheramento della quercetina ai residui di lisina e arginina potrebbe essere uno dei possibili meccanismi di E. fragilis per inibire la glicazione proteica in una fase iniziale.
![. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively. Engagement of AGEs products with RAGE are known to trigger, through ROS formation via NADPH oxidase and mitochondria [57], the activation of multiple intracellular signaling pathways (including JAK/STAT, phosphoinositol-3 kinase, rho GTPases, SAPK/JNK MAP kinases, p38 and erk1/2 (p44/p42) MAP kinases), and culminating in the activation of the NF-κB transcription factors [58], leading to the pathogenesis of diabetes and aging-associated disorders [5]. Therefore, blocking the AGEs–RAGE interactions can repress stress-provoking signals transduction, which is considered a therapeutic strategy of inhibiting glycation at a later stage. Docking results with RAGE, as shown in Table 6, proved that gallic acid has the highest docking score (ΔG= −6.8 kcal/mol) in comparison to those of vanillic acid, ferulic acid, caffeic acid, quercetin, and rutin (−6.68, −5.94, −5.89, −5.58 and −4.89 kcal/mol, respectively). Moreover, 2D modeling of gallic acid and RAGE showed that gallic acid formed five conventional hydrogen bonds with CYS38, GLY40, ALA41, LYS43, and SER83 of RAGE (Figure 5C,D). Also, LYS37 and LYS43 were responsible for the hydrophobic interactions of gallic acid with RAGE. Five amino acids surrounding gallic acid (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81, and GLY82) were attached by van der Waal's forces, thereby stabilizing the gallic acid-RAGE complex by providing a strong cohesive environment. In summary, the current study has shown the efficient interaction of certain bioactive compounds in the EAF of E. fragilis with the target proteins of BSA and RAGE. E. fragilis could be a source of potential competitors to glucose and AGEs, which might resist their binding towards BSA and RAGE, respectively, and therefore reducing the subsequent development of oxidative stress and inflammation (Figure 6). Figure 5. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively](/Content/uploads/2022842169/202203241046127d567c69ab264671b6814abd1b4544c7.png ". The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively. Engagement of AGEs products with RAGE are known to trigger, through ROS formation via NADPH oxidase and mitochondria [57], the activation of multiple intracellular signaling pathways (including JAK/STAT, phosphoinositol-3 kinase, rho GTPases, SAPK/JNK MAP kinases, p38 and erk1/2 (p44/p42) MAP kinases), and culminating in the activation of the NF-κB transcription factors [58], leading to the pathogenesis of diabetes and aging-associated disorders [5]. Therefore, blocking the AGEs–RAGE interactions can repress stress-provoking signals transduction, which is considered a therapeutic strategy of inhibiting glycation at a later stage. Docking results with RAGE, as shown in Table 6, proved that gallic acid has the highest docking score (ΔG= −6.8 kcal/mol) in comparison to those of vanillic acid, ferulic acid, caffeic acid, quercetin, and rutin (−6.68, −5.94, −5.89, −5.58 and −4.89 kcal/mol, respectively). Moreover, 2D modeling of gallic acid and RAGE showed that gallic acid formed five conventional hydrogen bonds with CYS38, GLY40, ALA41, LYS43, and SER83 of RAGE (Figure 5C,D). Also, LYS37 and LYS43 were responsible for the hydrophobic interactions of gallic acid with RAGE. Five amino acids surrounding gallic acid (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81, and GLY82) were attached by van der Waal's forces, thereby stabilizing the gallic acid-RAGE complex by providing a strong cohesive environment. In summary, the current study has shown the efficient interaction of certain bioactive compounds in the EAF of E. fragilis with the target proteins of BSA and RAGE. E. fragilis could be a source of potential competitors to glucose and AGEs, which might resist their binding towards BSA and RAGE, respectively, and therefore reducing the subsequent development of oxidative stress and inflammation (Figure 6). Figure 5. The 3D view of the binding mode between quercetin (A) and gallic acid (C) with BSA and RAGE, respectively. The 2D detailed view showed the interaction between quercetin (B) and gallic acid (D) with neighboring residues of BSA and RAGE, respectively")
È noto che il coinvolgimento dei prodotti AGEs con RAGE innesca, attraverso la formazione di ROS tramite NADPH ossidasi e mitocondri [57], l'attivazione di molteplici vie di segnalazione intracellulare (tra cui JAK/STAT, fosfoinositolo-3 chinasi, rho GTPases, SAPK/INK MAP chinasi, p38 ed erk1/2 (p44/p42) MAP chinasi) e culminano nell'attivazione dei fattori di trascrizione NF-kB [58], portando alla patogenesi del diabete e dei disturbi associati all'invecchiamento [5]. Pertanto, il blocco delle interazioni AGEs-RAGE può reprimere la trasduzione dei segnali che provocano stress, che è considerata una strategia terapeutica per inibire la glicazione in una fase successiva. I risultati di docking con RAGE, come mostrato nella Tabella 6, hanno dimostrato che l'acido gallico ha il punteggio di docking più alto (G=-6.8 kcal/mol) rispetto a quelli di acido vanillico, acido ferulico, acido caffeico, quercetina e rutin(-6.68,-5.94,-5.89,-5.58 e -4.89 kcal/mol, rispettivamente). Inoltre, la modellazione 2D di acido gallico e RAGE ha mostrato che l'acido gallico formava cinque legami idrogeno convenzionali con CYS38, GLY40, ALA41, LYS43 e SER83 di RAGE (Figura 5C, D). Inoltre, LYS37 e LYS43 erano responsabili delle interazioni idrofobiche dell'acido gallico con RAGE. Cinque amminoacidi che circondano l'acido gallico (GLU32, LYS39, PRO42, ASN81 e GLY82) sono stati attaccati dalle forze di van der Waal, stabilizzando così il complesso acido gallico-RAGE fornendo un forte ambiente coeso. In sintesi, il presente studio ha mostrato l'interazione efficiente di alcuni composti bioattivi nell'EAF di E. fragilis con le proteine bersaglio di BSA e RAGE.E.fragilis potrebbe essere una fonte di potenziali concorrenti del glucosio e degli AGE, che potrebbero resistere al loro legandosi rispettivamente a BSA e RAGE e quindi riducendo il successivo sviluppo di stress ossidativo e infiammazione (Figura 6).
3. Materiali e metodi
3.1. Sostanze chimiche e reagenti
22-azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-acido solfonico)(ABTS), idrossi-toluene butilato (BHT), sodio azide, guanidina cloridrato, tween-40,1,{ {7}}difenil-2-picrylidrazil (DPPH), reattivo Folin Ciocalteau, -carotene, acido linoleico, glucosio, 2,4-dinitrofenilidrazina(DNPH),5,5'-ditiobis-({{16 }}Gli standard di acido nitrobenzoico) (DTNB), molibdato di ammonio e polifenoli sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Il perossido di idrogeno (H2O2) è stato acquistato da Fluka (Basilea, Svizzera). Il cloruro di alluminio (AICl3), il carbonato di sodio (NazCO3), il cloruro ferrico (FeCl3), il persolfato di potassio (K2S2Os), il ferricianuro di potassio (K3Fe(CN)6), l'acido solforico e tutti i solventi sono stati ottenuti da Merck Life Science (Darmstadt, Germania ). L'acido ascorbico e l'acido tricloroacetico (TCA) sono stati ottenuti da Scharlau (Barcellona, Spagna).
3.2.Materiali vegetali
E. fragilis (parti aeree) è stato raccolto da Dour Lagfifat, Oulad Teima, Taroudant, Marocco(latitudine, 30 gradi 24'0"N; longitudine,9 gradi 12'36"W) nel mese di maggio 2019. Esso è stato identificato dal professor Najat ELKHIATI, botanico del nostro istituto, dove è stata depositata una collezione di campioni di voucher. La pianta è stata risciacquata con acqua distillata, asciugata all'aria, polverizzata in un frullatore e conservata a 49°C fino al momento dell'uso.
3.3. Progettazione sperimentale
3.3.1.Selezione delle variabili
È noto che molti parametri hanno effetti significativi sull'estrazione dei composti fenolici, come il tipo di solvente, la concentrazione del solvente, il tempo di estrazione e la temperatura di estrazione [59]. Diversi solventi come acetone, metanolo ed etanolo sono adatti per l'estrazione di diversi composti fenolici [16], ma l'etanolo è stato selezionato come solvente in questo studio, a causa della sua sicurezza alimentare e della produzione ecologica [60]. Pertanto, tutti i fattori, inclusa la concentrazione di etanolo (X), la temperatura di estrazione (X2) e il tempo di estrazione (X3) sono stati selezionati come variabili.
3.3.2. BBD per l'ottimizzazione dell'estrazione
È stata sviluppata una procedura di ottimizzazione utilizzando RSM per determinare gli effetti dei fattori di estrazione e scegliere le condizioni sperimentali ottimali di estrazione del composto fenolico di E. fragilis. È stato intrapreso un BBD a tre livelli e tre fattori per studiare l'impatto di tre fattori indipendenti tra cui X1 (concentrazione di etanolo, percentuale), X, (temperatura di estrazione, grado) e X3 (tempo di estrazione, h) sui contenuti di TP e TF di E, estratti fragilis [17]. A fini di ottimizzazione, sono stati eseguiti in modo casuale un numero totale di 15 prove, inclusi tre punti centrali (Tabella 1). Sulla base del nostro esperimento preliminare a fattore singolo (dati non mostrati), tutte le variabili sono state impostate su tre livelli (-1,0 e più 1), con X,(40,60 e 80 percento), X ,(25,42,5 e 60 gradi) e X3(6, 15 e 24 h)(Tabella 1). La seguente equazione polinomiale del secondo ordine (Equazione (1)) è stata utilizzata per adattare le variabili di risposta:
dove Y è la risposta prevista; o, ; Io e ; sono i coefficienti di regressione rispettivamente per i termini di intercetta, lineare, quadratico e di interazione; e X; e X; sono le variabili indipendenti (i ≠ j).
3.3.3. Procedura di estrazione
Il campione in polvere (10 g) è stato estratto mediante metodo di macerazione in una concentrazione di etanolo progettata (40-80 percento; 1:10, p/v), a temperature variabili (25-60 gradi) per vari periodi ({ {5}} h) su un incubatore con agitatore orbitale (160 giri/min). Garza e carta da filtro Whatman n. 1 sono state utilizzate per rimuovere la massa insolubile. Il filtrato è stato quindi essiccato a 40 gradi a bassa pressione utilizzando R-3 Rotavapor(Büchi) per produrre l'estratto etanolico grezzo (CEE).
3.4. Frazionamento della CEE ottenuto in condizioni ottimali
Il CEE ottenuto in condizioni ottimali è stato solubilizzato in acqua distillata (100 mL) e l'estrazione liquido-liquido è stata eseguita con vari solventi di polarità crescente per ottenere una frazione di esano (HF,3×100 mL), frazione di diclorometano (DMF, 3×100 mL), frazione di acetato di etile (EAF.3 × 100 mL), una frazione di n-butanolo satura di acqua (WBF, 3 × 100 mL),
e la restante frazione di acqua (WF). Queste frazioni sono state quindi filtrate ed essiccate come descritto sopra e la resa di estrazione è stata registrata secondo l'equazione (2):
Dove Wo e W sono il peso delle frazioni CEE essiccate e il peso iniziale della polvere di E.fragilis; rispettivamente.
3.5. Analisi fitochimica
Le tecniche spettrofotometriche utilizzate per valutare il contenuto fitochimico degli estratti di E. fragilis sono dettagliate nei Materiali Supplementari [61,62].
3.6. Attività Biologiche
I dettagli dei test in vitro sulle attività antiossidanti [43,63-67] e antiglicationi [68-70] sono stati forniti nei materiali supplementari.
3.7. Analisi RP-HPLC di EAF
L'analisi dei composti fenolici nell'EAF è stata eseguita con Agilent 1100(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) dotato di una colonna analitica ZORBAX Eclipse SB-C18 a fase inversa di 100×4 mm e 3,5 um dimensione delle particelle [71]. La temperatura della colonna è stata mantenuta costante a 48 gradi. L'eluizione isocratica con acetonitrile, acido acetico allo 0,1 percento in acqua (12:88, v/v) come fase mobile e una portata di 1 ml/min assicuravano una buona separazione dei polifenoli nell'EAF di E.fragilis. Il volume iniettato era di 10 μL e i cromatogrammi sono stati misurati a 330 nm. I tempi di ritenzione dei composti fenolici nell'EAF sono stati confrontati con quelli di standard puramente disponibili per identificarli.
3.8. Docking molecolare
AutoDock Tools(ADT) versione 1.5.6 è stato utilizzato per eseguire uno studio di aggancio molecolare. Il formato SDF di tutti i composti è stato ottenuto dal database PubChem e quindi convertito in file 3Dpdb utilizzando Open Babel GUI (versione 2.4.1). Le strutture cristalline di BSA (PDB ID: 4ORO) e RAGE (PDB ID: 4LP5) sono state raccolte dalla Protein Data Bank (PDB) di RCSB. In breve, le proteine sono state inizialmente preparate per l'aggancio (i) rimuovendo tutti gli eteroatomi e le molecole d'acqua, (i) aggiungendo atomi di idrogeno polare e (ii) assegnando cariche di Kollman. La dimensione della casella della griglia è stata impostata su x{10}},y=126,z=126 e x=80,y=80.Z{{ 15}} con centro della griglia di×=8.415,y=21.626,z=106.57 andx=37.98,y=-43.581 ,z=9.371 con una spaziatura della griglia di 0,375A creata attorno al sito di legame di BSA e RAGE, rispettivamente. Il software di docking è stato eseguito 100 volte utilizzando l'algoritmo genetico di Lamarckian (LGA) per trovare la migliore posa di rilegatura. Il ligando con il punteggio di energia di legame più basso è stato scelto per ulteriori indagini. Il software Discovery Studio versione 2020 (BIOVIA, San Diego, CA, USA) è stato utilizzato per visualizzare i risultati dell'aggancio.
3.9. Analisi statistica
Per eseguire RSM è stato utilizzato il software Design-Expert versione 119 (Stat-Ease Inc. e Minneapolis, MN, USA). L'analisi dei dati è stata eseguita mediante l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguita dal test post-hoc di Duncan utilizzando SPSS 26.0(IBM Co., USA);p<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" pearson="" correlation="" analysis="" was="" conducted="" to="" investigate="" correlations="" between="" variables="" and="" their="" significance.="" all="" graphics="" were="" constructed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0="" software="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" all="" experiments="" were="" conducted="" in="" triplicate="" and="" presented="" as="" mean="" values="" ±standard="" deviation="">
4. Conclusioni
RSM con un BBD è stato impiegato per impostare i parametri ottimizzati per l'estrazione dei composti bioattivi dall'erba medicinale marocchina E. fragilis. La concentrazione ottimale di etanolo, la temperatura di estrazione e il tempo di estrazione sono stati previsti per il massimo
resa di estrazione di composti fenolici e ha mostrato di essere rispettivamente del 61,93 percento, 44,43 gradi C e 15,84 h. I CEE ottenuti in condizioni di estrazione ottimali e le sue varie frazioni sono stati analizzati per il loro contenuto di TP e TF, nonché per il loroantiossidantee attività antiglicazione. La frazione EAF mostra i più alti contenuti di TP e TF e le più forti attività antiossidanti rispetto ad altre frazioni. Inoltre, la valutazione di diversi biomarcatori come lo spettro di assorbimento UV-vis, la fluorescenza di AGE specifici, il contenuto di carbonile e il gruppo di tioli liberi, ha mostrato il maggiore effetto protettivo dell'EAF contro la glicazione mediata dal glucosio. Inoltre, è stata osservata una relazione positiva significativa tra le capacità antiossidanti dei composti fenolici e le loro attività antiglicative. Ciò indica che i composti fenolici possono essere i principali componenti predominanti responsabili sia dell'attività antiossidante che di quella antiglicationica. I composti bioattivi nell'EAF sono stati caratterizzati mediante analisi RP-HPLC e sono stati identificati un numero totale di sei composti. L'analisi dell'aggancio molecolare in silico ha anche mostrato un'interazione efficace tra quercetina e acido gallico con BSA e RAGE rispettivamente come proteine bersaglio. Collettivamente, questo studio suggerisce che E.fragilis potrebbe essere una potenziale fonte di composti bioattivi naturali con potenti attività antiossidanti e antiglicationi e dovrebbe essere applicato nel trattamento e nella prevenzione dell'invecchiamento e delle complicanze associate alla glicazione. Ulteriori studi sull'isolamento dei composti bioattivi e sullo screening farmacologico (cioè lo studio di citotossicità) devono essere condotti per esplorare la fitochimica ei meccanismi d'azione delle proprietà farmacologiche di E. fragilis.
Riferimenti
1. Martins, N.; Barros, L.; Santos-Buelga, C.; Silva, S.; Henriques, M.; Ferreira, Decotto ICFR, Infuso ed Estratto Idroalcolico di Timo Coltivato: Attività Antiossidanti, Antibatteriche e Caratterizzazione Fenolica. Chimica alimentare. 2015, 167, 131–137. [Rif incrociato]
2. Deetae, P.; Parichanon, P.; Trakunleewatthana, P.; Chanseetis, C.; Lertsiri, S. Proprietà antiossidanti e anti-glicazione delle tisane tailandesi rispetto ai tè convenzionali. Chimica alimentare. 2012, 133, 953–959. [Rif incrociato]
3. Yao, Q.; Liang, Y.; Shao, Y.; Bianco, W.; Fu, H.; Xu, J.; Sui, L.; Yao, B.; Li, M. Concentrazioni avanzate del prodotto finale della glicazione nel liquido follicolare delle donne sottoposte a fecondazione in vitro / ICSI con un protocollo agonista del GnRH. Riprod. Biomed. In linea 2018, 36, 20–25. [CrossRef] [PubMed]
4. Grimm, S.; Ott, C.; Hörlacher, M.; Weber, D.; Hohn, A.; Grune, T. Formazione di immunoproteasomi indotta dal prodotto finale della glicazione avanzata: coinvolgimento di RAGE e Jak2/STAT1. Biochimica. J. 2012, 448, 127–139. [Rif incrociato]
5. Menatchi, P.; Purushothaman, A.; Maneemegalai, S. Antiossidanti, Antiglicationi e Proprietà Insulinotrofiche di Coccinia Grandis (L.) in Vitro: Possibile Ruolo nella Prevenzione delle Complicazioni Diabetiche. J.Tradit. Complemento. Med. 2017, 7, 54–64. [CrossRef] [PubMed]
6. Nakagawa, T.; Yokozawa, T.; Terasawa, K.; Shu, S.; Juneja, LR Attività protettiva del tè verde contro i danni proteici dei radicali liberi e del glucosio. J. Agric. Chimica alimentare. 2002, 50, 2418–2422. [CrossRef] [PubMed]
