Caratterizzazione di proantocianidine naturali e alcaline ossidate in estratti vegetali mediante UHPLC-MS/MS ad altissima risoluzione

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Astratto: In questo studio, abbiamo analizzato la composizione di proantocianidina (PA) di 55 estratti vegetali prima e dopo alcalinoossidazioneda UHPLC-MS/MS ad altissima risoluzione. Abbiamo caratterizzato in dettaglio le strutture PA naturali e studiato i sofisticati cambiamenti nelle strutture PA modificate e gli schemi e modelli tipici di reazioni all'interno di diverse classi di PA dovute all'ossidazione. Le PA naturali erano PC di tipo A e B, PD e miscele PC/PD. Inoltre, abbiamo rilevato PA galloilati. I PC di tipo B in diversi estratti vegetali erano piuttosto stabili e non mostravano alcuna o minore modifica a causa delossidazione alcalina. Per alcuni campioni, abbiamo rilevato le reazioni intramolecolari dei PC che producono legami eterei di tipo A. Anche i PC di tipo A erano piuttosto stabili senza modifiche o lievi modifiche, ma in alcune piante la formazione di etere aggiuntivocollegamentiè stato rilevato. Le PA contenenti unità PD erano più reattive. Dopo l'ossidazione alcalina, questi PA o i loro prodotti di ossidazione non sono più stati rilevati dalla SM anche se un tipo diverso e/o una gobba di PA ritardata è stata ancora rilevata dai raggi UV a 280 nm. I PA galloilati erano piuttosto stabili sotto ossidazione alcalina se fossero basati su PC, ma abbiamo rilevato la conversione intramolecolare dal tipo B al tipo A. I PD galloilati erano più reattivi e reagivano in modo simile ai PD non galloilati.

Parole chiave: spettrometria di massa ad alta risoluzione; orbitrap;ossidazione; tannini; UHPLC-DAD-MS/MS

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1. Introduzione

Proantocianidine(PA, tannini condensati sin.) sono oligomeri e polimeri costituiti da unità monomeriche di flavan{0}}ol (Figura 1). La diversità delle strutture PA deriva principalmente dai loro modelli di idrossilazione, dall'ordine sequenziale delle unità di flavan-3-ol e dal grado di polimerizzazione (DP), oltre alle differenze nella stereochimica a C2 e C3 e alla variazione della posizione e stereochimica dell'interflavonoideobbligazioni [1]. Le PA più comuni sono le procianidine (PC) costituite da (epi) unità di catechina e le prodelfinidine (PD) costituite da (epi) unità di gallocatechina (Figura 1). Le strutture PA presentate in figura hanno i collegamenti C4→C8. Tuttavia, i PA possono anche essere collegati da legami C4 → C6 e non possiamo separare questi due collegamenti l'uno dall'altro mediante spettrometria di massa.

PAs are the most commonly available subgroup of plant tannins, responsible for nearly 90% of the world's overall market for industrial tannins (>più 100-chilotonnellate all'anno) e sono chimicamente ed economicamente più attraenti come biopolimero [2-5]. Attualmente solo poche risorse, come le cortecce o i boschi di canniccio, mimose, quebracho, querce, castagni, mangrovie, sommacchi, mirabolani e tara, sono utilizzate per la loro produzione e principalmente per le esigenze di concia delle pelli, vino, minerali industrie di flottazione e di perforazione petrolifera, per la preparazione di adesivi, oltre all'alimentazione animale [4,6,7]. Tuttavia, anche i rifiuti o i sottoprodotti della manipolazione e della lavorazione di frutta, verdura e risorse forestali derivanti dalle applicazioni industriali sopra elencate potrebbero essere una potenziale fonte di PA naturali [8-11]. Le PA potrebbero anche essere ulteriormente modificate al fine di migliorarne l'usabilità e le bioattività [12,13].

Le proprietà chimiche dei PA possono essere modificate attraverso reazioni di derivatizzazione [12]. Queste reazioni includono, per esempio, O-acilazione mediante una reazione con cloruri acidi o anidridi o alchilazione con alogenuri alchilici. La derivatizzazione modifica le proprietà fisico-chimiche dei PA per le loro applicazioni commerciali e tecnologie di purificazione. Tuttavia, per comprendere veramente le effettive reazioni che si verificano, è necessario regolare diversi parametri, come i reagenti e i solventi utilizzati, la temperatura, il pH e il tempo di reazione [12]. Un modo semplice e rapido per migliorare l'usabilità delle PA vegetali è ossidarle per creare nuove PA con strutture molecolari alterate. Anche se le condizioni di reazione dell'ossidazione sono ben note e sono stati suggeriti diversi meccanismi di reazione, i corrispondenti cambiamenti strutturali sono noti principalmente per le singole PA di piccole dimensioni [14-18]. Ad esempio, le reazioni di ossidazione e riarrangiamento di diversi flavan{5}}oli monomerici e dimerici sono state elegantemente discusse già 30 anni fa, dimostrando che la chimica di questi PA a pH alcalino è regolata dalla formazione di A-e/o Chinone-metidi dell'anello B come intermedi altamente reattivi che causano le reazioni di riarrangiamento e la conversione ossidativa di PA di tipo B in tipo A[15]. Non è invece noto il comportamento delle miscele di PA negli estratti vegetali, e ciò è molto probabilmente dovuto alle difficoltà nell'analisi di PA iniziali strutturalmente differenti, che vengono ulteriormente contestate dopo l'ossidazione. Nel nostro studio precedente, abbiamo testato se diversi tipi di PA naturali potessero essere modificati chimicamente per produrre nuovi tipi di PA e studiato gli effetti dell'ossidazione alcalina non specifica imitando il processo di estrazione alcalina spesso utilizzato per i rifiuti di corteccia [19-23] su 102 estratti vegetali contenenti PA [13]. I risultati hanno indicato diverse reattività per PC e PD. Il risultato ha suggerito che le PA delle piante potrebbero essere modificate a pH elevato e la presenza di gruppi di PD ha aumentato significativamente la probabilità di reazioni di modifica. La principale via di reazione è stata considerata intramolecolare, ma per PA ricchi di PD e gallovlati sono state indicate sia reazioni intra che intermolecolari [13]. Inoltre, altri studi hanno dimostrato che l'ossidazione dei PA include reazioni sia intramolecolari che intermolecolari [14,15,24,25].

La caratterizzazione dettagliata e la comprensione delle PA naturali e ossidate è impegnativa, ma i recenti progressi nella strumentazione cromatografica liquida ad altissime prestazioni per spettrometria di massa tandem (UHPLC-MS/MS) con analizzatori di massa ad alta risoluzione hanno consentito la caratterizzazione di molti diversi PA delle piante [18,{5}}]. Gli analizzatori di massa popolari per la caratterizzazione degli AP sono stati orbitrap [27,28] e quadrupole

time-of-flight(OTOF)[29,30] a causa delle loro proprietà ad alta risoluzione, che consentono la determinazione delle masse esatte e delle corrispondenti formule molecolari delle PA studiate negli estratti vegetali. I PA che si trovano in natura di solito contengono una miscela di diverse strutture oligo-polimeriche, che producono ioni a carica multipla nella ionizzazione elettrospray, espandendo l'intervallo di massa utilizzato [30-32]. Inoltre, le PA hanno modelli di frammentazione caratteristici ben noti, che possono essere utilizzati per la loro identificazione: questi includono la scissione chinone-metide (QM), la fissione dell'anello eterociclico (HRF) e la frammentazione retro-Diels-Alder (RDA) [27, 31-33]. Gli stessi modelli di frammentazione sono solitamente presenti sia per gli PA di tipo A che per quelli di tipo B, e i valori m/z osservati per gli PA di tipo A con un collegamento etere differiscono di 2 Da dai corrispondenti PA di tipo B [26,{{ 19}}].

In questo studio, abbiamo utilizzato UHPLC combinato con spettrometria di massa tandem ad altissima risoluzione per (a) studiare in dettaglio le strutture PA naturali in 55 campioni vegetali ricchi di PA, (b) per vedere i sofisticati cambiamenti nelle strutture PA modificate dopo l'ossidazione aerea in condizioni alcaline e (c) riconoscere i modelli tipici di reazione all'interno di diverse classi di PA dovute all'ossidazione.

2. Risultati e discussione

Abbiamo selezionato 55 campioni vegetali ricchi di PA contenenti miscele interessanti ma complesse di PA naturali sulla base del nostro studio precedente [13]. Questi campioni vegetali sono stati ossidati in modo simile dall'ossidazione aerea in condizioni alcaline come in [13] e dopo l'ossidazione, i PA erano ancora più complessi. Questi PA naturali e modificati sono stati studiati qui da UHPLC-DAD collegato a Q-orbitrap MS/MS ad altissima risoluzione al fine di rilevare i sofisticati cambiamenti nelle strutture PA. I PA sono stati identificati in base ai loro ioni a carica singola e/o multipla con le corrispondenti masse esatte e formula molecolare. Le analisi sono state eseguite mediante LC a fase inversa e, pertanto, i PA oligomerici e polimerici erano presenti principalmente come gobbe irrisolte nei cromatogrammi UV a 280 nm, vedere l'estratto di foglie di Ruprechtia salicifolia nella Figura 2A per un esempio. Nel cromatogramma ionico totale, la ionizzazione di altri composti fenolici era più intensa di quella dei PA e, pertanto, la gobba PA non era così evidente (Figura 2B). Tuttavia, l'accuratezza dell'orbitrap facilita l'interpretazione dei risultati della SM poiché i modelli isotopici degli ioni a carica multipla sono chiaramente definiti e la possibile sovrapposizione dei picchi può essere rilevata, consentendo così la determinazione delle masse esatte e delle formule molecolari di diversi oligo- e PA polimerici. Ad esempio, catechina galloilata (epi) a m/z 441, PCat dimerico galloilato m/z729 e PC trimerico galloilato a m/z 1017 mostrano picchi ben separati nei cromatogrammi ionici estratti (EIC) nella Figura 2C-E, e loro possono essere facilmente rilevati in base ai loro spettri UV e di massa, comprese le masse esatte e la corrispondente formula molecolare. I risultati qui ottenuti erano coerenti con i risultati precedenti ottenuti da MS/MS, dimostrando che le foglie di Ruprechtia salicifolia contenevano 24 mg/g di PA, di cui solo il 3% erano PA contenenti PD, alcune di esse erano galloilate ed è stato trovato l'mDP avere 7 anni [13].

2.1.PC di tipo B negli estratti vegetali iniziali non ossidati

I PC di tipo B negli estratti vegetali sono stati rilevati in base ai loro ioni molecolari a carica singola e multipla oltre ai caratteristici modelli di frammentazione. Ad esempio, i PC nella pergola della Begonia sono estratti "Nigra" che hanno mostrato una serie distinta di ioni [MH] separati da 288 Da da m/z289 a m/z 1729 corrispondenti a PC di tipo B da monomero a esamero e di [M{{ 6}}H]' ioni separati da 144 Da da m/z 1008 a m/z 1296 corrispondenti per PC di tipo B da eptameri a nonameri (Tabella S1). Gli spettri di massa dei PC monomerici, cioè flavan-3-oli catechina ed epicatechina, hanno mostrato un caratteristico frammento ionico a m/z 245 come riportato in precedenza [3132,36].

In generale, la MS/MS dei dimeri PC di tipo B ha mostrato i caratteristici modelli di frammentazione che producono ioni a m/z 287 e 289 (clivaggio QM), m/z 425 e 407 (frammentazione RDA ed eliminazione sequenziale dell'acqua) e m /z 451(HRF; Figura 3). La frammentazione RDA è considerata il modello di frammentazione più importante per la caratterizzazione dei dimeri PC di tipo B e si ritiene che la frammentazione sull'unità di estensione sia energeticamente più favorevole in quanto produce ioni frammento con un sistema iperconiugato π-π più grande rispetto al Frammentazione RDA sull'unità terminale [31-33].

2.2. PC di tipo A negli estratti vegetali non ossidati iniziali

La presenza di PA di tipo A negli estratti vegetali iniziali è stata confermata dai loro caratteristici modelli di frammentazione simili alle PA di tipo B. A titolo di esempio, vengono mostrati e discussi in dettaglio i percorsi di frammentazione caratteristici e i dati MS/MS del dimero e del trimero PC di tipo A con un collegamento di tipo A (Figure 4 e 5). La frammentazione del dimero PC di tipo A ha prodotto quattro ioni frammento (Figura 4). La frammentazione RDA dell'unità terminale ha prodotto uno ione a m/z 423, che conferma la presenza di un collegamento di tipo A [26,34,35]. Inoltre, suggeriamo che la frammentazione RDA dell'unità di estensione e la perdita sequenziale di acqua potrebbero produrre lo ione a m/z 407. Lo ione a m/z 449 è la produzione di HRF, cioè il risultato della perdita di l'unità del floroglucinolo [26]. Gli ioni a m/z 285 e 289 corrispondevano alla scissione QM. Allo stesso modo, il trimero PC di tipo A ha mostrato uno ione molecolare a m/z 863 e ioni frammento caratteristici in MS/MS a m/z 711.693.573.559.451.411 e 289 come precedentemente riportato da Sui et al.(2016 )[26]. La frammentazione RDA del trimero PC di tipo A ha prodotto uno ione a m/z 711, che conferma ancora una volta la presenza di un collegamento di tipo A secondo lo studio precedente [26] e suggerisce che il collegamento di tipo A potrebbe trovarsi tra due estensioni unità. Suggeriamo che lo ione a m/z 693 corrisponda alla perdita sequenziale di acqua e supporti la posizione del collegamento di tipo A, come mostrato nella Figura 5. Inoltre, suggeriamo che la RDA aggiuntiva dell'anello a C eterociclico del l'unità terminale flavan-3-ol mostra lo ione a m/z559. Questo ione era minore nei nostri studi. Gli ioni a m/z573 e 289 corrispondevano alla scissione QM del legame interflavanoide inferiore [26]. Abbiamo anche rilevato ioni a m/z 575 e 287. Proponiamo che gli ioni a m/z 451 e 411 potrebbero corrispondere all'HRF dell'anello C eterociclico dell'unità flavan-3-ol media che supporta la posizione di Collegamento di tipo A tra le unità di estensione secondo la Figura 5.

2.3. Modifiche dei PC di tipo B negli estratti vegetali a causa dell'ossidazione alcalina

Dopo l'ossidazione, i PC di tipo B in diversi estratti vegetali sono stati modificati in modo diverso. Alcuni dei campioni hanno mostrato nessuna o modifiche minori; vedere la Figura 6A, B, ad esempio, per oligomeri PC di tipo B più corti nell'estratto di foglie di pergola di Begonia sono "Nigra" prima e dopo l'ossidazione. Quando questi tipi di estratti vegetali sono stati ossidati, gli spettri di massa totale degli estratti vegetali iniziali e ossidati erano simili. Tuttavia, sono state rilevate piccole differenze nei dati spettrometrici di massa dettagliati. Ad esempio, il dimero PC a m/z 577 è stato associato a m/z575 e il trimer PC a m/z865 con m/z 863, rispettivamente. Quando le quantità di PC erano basse prima dell'ossidazione, dopo l'ossidazione i loro segnali sono quasi scomparsi dagli spettri di massa, suggerendo che si erano convertiti in non identificabili o degradati a causa dell'ossidazione. Questo fenomeno è stato osservato, ad esempio, per gli estratti fogliari di Combretum Indicum ed Euphorbia characias contenenti basse quantità di pochi oligomeri PC corti e supportato dai precedenti dati MS/MS che hanno mostrato che il contenuto di PA è diminuito da 4 mg/mL a 1 mg /mL e da 7 mg/mL a 1 mg/mL, rispettivamente, a causa dell'ossidazione [13]. Questo fenomeno potrebbe essere correlato alle condizioni sperimentali utilizzate, il che significa che erano più gravi quando i contenuti iniziali di PA erano bassi. In alcuni campioni, una parte dei PC di tipo B è stata modificata maggiormente, vedere la Figura 6C, D, ad esempio, per PColigomeri di tipo B più brevi nell'estratto di foglietto di Cyperus owoaii prima e dopo l'ossidazione. Quando questi tipi di estratti vegetali sono stati ossidati, sono state rilevate differenze visibili negli spettri di massa totale che mostrano la differenza di massa di 2 Da rispetto ai PC iniziali (Figura 6C, D, Tabella S2).

È noto che l'ossidazione degli o-diidrossipolifenoli, cioè l'anello B del catecolo dei PC, produce tipicamente o-chinoni con una differenza di massa di 2 Da. Abbiamo infatti notato che questo tipo di ossidazione può verificarsi anche nelle analisi spettrometriche di massa. Possono esserci segnali minori negli spettri di massa aventi i valori m/z 2 Da inferiori ai valori m/z dei PC corrispondenti alla possibile ossidazione o formazione di forme chinone dei PC durante la ionizzazione (dati non pubblicati). È possibile che qui nell'ossidazione alcalina gli o-diidrossipolifenoli formino i primi o-chinoni. Tuttavia, le 0-forme chinoniche formate sono instabili e molto probabilmente reagiscono ulteriormente rapidamente. Un possibile risultato potrebbe essere la conversione ossidativa di PC di tipo B in PC di tipo A, come precedentemente riportato in letteratura [15]. La trasformazione di PC di tipo B in PC di tipo A comporta la rimozione ossidativa dello ione idruro in C2 dell'anello C come passaggio iniziale: le condizioni di base prevalenti inducono l'ossidazione della funzionalità o-diidrossi dell'anello B ad un o-chinone, che successivamente funge da anossidanteper la conversione del dimero di procianidina di tipo B in uno di tipo A [15] (Figura 7). Questo meccanismo del chinone metide è stato evidenziato anche a diverse temperature, pH e condizioni catalitiche [37], mediante ossidazione radicalica utilizzando radicali 1,1-difenil{7}}picrylidrazil in condizioni neutre [38] e dalla laccasi ( EC1.10.3.2) [39].

Quando abbiamo studiato i PC modificati con la differenza di massa di 2 Da negli estratti ossidati e le loro produzioni ottenute da MS/MS, si è concluso che erano simili ai PC di tipo A e ai loro ioni frammento (come discusso sopra nella Sezione 2.2), mostrando i caratteristici modelli di frammentazione che producono ioni a m/z 285 e 289 (clivaggio QM), m/z 423 (frammentazione RDA) e m/z449 (HRF). A titolo di esempio, mostriamo la conversione dei dimeri PC di tipo B dell'estratto di foglietto di Microgramma Mauritania in dimeri PC di tipo A nella Figura 8. Nelnon ossidatoestratto, abbiamo rilevato quattro dimeri PC di tipo B con valori m/z 577 (Figura 8A) ma nessun dimeri PC di tipo A con valori m/z 575 (Figura 8B). I piccoli picchi nell'EIC a m/z575 corrispondevano presumibilmente all'ossidazione dei PC di tipo B nella sorgente ionica poiché i tempi di ritenzione sono esattamente gli stessi dei PC di tipo B. Nell'estratto ossidato, abbiamo rilevato solo tracce dei PC di tipo B iniziali a m/z 577 (Figura 8C), ma invece, abbiamo rilevato picchi intensi nei tempi di ritenzione successivi corrispondenti ai PC di tipo A a m/z 575 (Figura 575). 8D). I piccoli picchi nell'EIC a m/z577 aventi gli stessi tempi di ritenzione corrispondevano ai segnali isotopici di m/z 575. Va notato che questo studio era qualitativo, il che significa che le abbondanze degli ioni non possono essere paragonato come tale. Inoltre, va notato che la conversione di PC di tipo B in PC di tipo A non è stata sempre completa come in questo esempio e che tutti i PC di tipo B non sono stati convertiti in PC di tipo A; approssimativamente le abbondanze degli ioni degli oligomeri PC di tipo A e di tipo B erano uguali. In alcuni campioni, invece, abbiamo rilevato differenze maggiori di 2 Da; per esempio, l'eptamero PC a m/z 2017 potrebbe essere accompagnato da ioni a m/z2015 e 2013, suggerendo rispettivamente la formazione di uno e due collegamenti di tipo A.

Anche se la conversione dei PC di tipo B in tipo A sembrava essere il principale meccanismo di reazione, non possiamo escludere completamente altre reazioni di modifica. I PA erano presenti come miscele complesse negli estratti iniziali non ossidati e queste miscele erano ancora più complesse dopo l'ossidazione alcalina producendo un'enorme quantità di dati MS. Ad esempio, studi precedenti sulle reazioni di ossidazione e riarrangiamento catalizzate da basi di PA hanno dimostrato che i dimeri PC possono conversare in diversi prodotti di isomerizzazione dell'anello C, inclusi i tetraidrossipiranocromeni, noti anche come florotannini [15]. Questi prodotti mostrerebbero valori m/z molto simili a 577 ma diversi tempi di ritenzione in LC e diversi modelli di frammentazione nella SM. Sulla base degli EIC a m/z 577, non abbiamo rilevato riarrangiamenti di questo tipo nelle condizioni di reazione utilizzate. I riarrangiamenti e l'apertura dell'anello C eterociclico potrebbero anche produrre altri prodotti tramite regio-isomerizzazione, epimerizzazione o 13-migrazione arilica [15]. L'epimerizzazione è stata principalmente correlata ai processi di produzione e, ad esempio, le alte temperature legate alla tostatura del cacao portano a perdite di flavan-3-ol, ma anche all'epimerizzazione di flavan-3-ol monomeri, dimeri e trimeri [40]. Inoltre, è stato riportato che la polifenolo ossidasi nella polpa del frutto della banana ha causato l'epimerizzazione della (-)-epigallocatechina a (-)-gallocatechina[41]. Abbiamo esaminato la possibile epimerizzazione dei flavani-3-oli utilizzando EIC a m/z289 e, in generale, non abbiamo rilevato epimerizzazione significativa causata dall'ossidazione alcalina utilizzata. Tuttavia, non possiamo escludere completamente l'epimerizzazione poiché abbiamo rilevato quantità maggiori di (più)-catechina in relazione a (-)-epicatechina nell'estratto ossidato di fiori di cavolfiore Pavonia rispetto all'estratto non ossidato iniziale (Figura S1). Va anche notato che gli estratti ossidati sono stati neutralizzati prima dell'UHPLC-MS/MS, che potrebbe aver causato reazioni redox. Nelle forme ossidate, i chinoni sono elettrofili che possono reagire con l'acqua nucleofila presente e ciò potrebbe semplicemente comportare la reazione di riduzione che produce PC di tipo B, il che potrebbe anche spiegare perché alcuni PC di tipo B sembravano non essere interessati.

2.4. Modifiche dei PC di tipo A negli estratti vegetali a causa dell'ossidazione alcalina

I PC di tipo A in diversi estratti vegetali hanno reagito in modo diverso a causa dell'ossidazione alcalina. Alcuni dei campioni hanno mostrato nessuna o modifiche minori. Quando questi tipi di estratti vegetali sono stati sottoposti ad ossidazione alcalina, non sono state rilevate differenze significative negli spettri di massa totale (ad esempio, vedere la tabella S3 per i principali ioni osservati nell'estratto fogliare di Aglaonema commutatum var. maculatum prima e dopo l'ossidazione). Tuttavia, piccole differenze potrebbero essere rilevate nei dati spettrometrici di massa dettagliati aventi la differenza di massa di 2 Da e suggerendo che potrebbero essere formati ulteriori collegamenti eterei di tipo A. Questo fenomeno era più evidente per alcuni dei campioni con PC di tipo A; questi PC di tipo A sono stati notati per formare ulteriori collegamenti eterei di tipo A a causa dell'ossidazione alcalina (Figura 9). Quando questi tipi di estratti vegetali sono stati ossidati, sono state rilevate differenze distinte negli spettri di massa totali che mostrano la differenza di massa di 2 Da rispetto ai PC di tipo A iniziali. Lo ione [MH] a m/z 863 corrispondeva per un trimero PC con un legame etereo di tipo A e lo ione a m/z 861 per un trimero PC con due collegamenti eterei (Figura 9A ). Allo stesso modo, i PC tetramerici aventi uno, due e tre legami eterei sono stati rilevati dagli ioni [M -H] a m/z 1151, 1149 e 1147, rispettivamente (Figura 9B). In proporzione, i PC pentamerici ed examerici aventi uno , due e tre legami eterei sono stati rilevati dagli ioni [M -H]- rispettivamente a m/z 1439, 1437 e 1435 e a m/z 1727,1725 e 1723 (Figura 9C, D; tuttavia, il [M -2H]2-ione a m/z 861 di un esamero PC era esplicitamente più abbondante dello ione [MH] a m/z 1723 e quindi, mostrato nella figura).

La formazione di ulteriori collegamenti di tipo A ha influenzato anche i tempi di ritenzione di questi oligomeri. Il numero di collegamenti eterei aggiuntivi sembrava in una certa misura aumentare con l'aumento dei gradi di polimerizzazione dei PC, il che è previsto poiché ci sono più posizioni per i legami aggiuntivi. Tuttavia, va anche notato che possono esserci segnali minori con la differenza di massa di 2 Da corrispondente alla possibile ossidazione o formazione di forme chinone di PC durante la ionizzazione, come discusso sopra. Questi picchi sono visibili anche negli spettri di massa nella Figura 9 prima dei picchi principali corrispondenti ai PC di tipo A. L'abbondanza degli ioni, le forme dei modelli isotopici e i caratteristici frammenti di ioni ottenuti da MS/MS hanno confermato l'osservazione di ulteriori legami eterei di tipo A. È anche importante notare che queste reazioni intramolecolari osservate non sembrano influenzare il grado medio di polimerizzazione poiché gli oligomeri o polimeri PA più elevati non sono stati rilevati negli estratti ossidati rispetto agli estratti non ossidati. L'osservazione è supportata da Mouls e Fulcrand (2012) [14].

2.5 Estratti di piante con PA aventi sia subunità PC che PD e loro modifiche dovute all'ossidazione acalina

Molti dei campioni contenevano PA con unità sia (epi)catechina che (epi)gallocatechina, cioè le PA erano miscele PC/PD. Il destino di queste miscele PC/PD a causa della modifica tramite ossidazione alcalina era diverso rispetto ai PC. Le miscele PC/PD sono state chiaramente rilevate negli estratti vegetali prima dell'ossidazione sia da UV che da MS; vedere, ad esempio, i piccoli oligomeri PA nell'estratto fogliare iniziale di Podocarpus macrophyllus (Figura 10A e Tabella S4). Dopo l'ossidazione, le PA modificate sono state ancora rilevate da UVat 280 nm come un tipo diverso e/o gobba ritardata (Figura S2), ma non sono state più rilevate da MS, si veda, ad esempio, gli oligomeri PA mancanti nella foglia ossidata estratto di Podocarpus microphallus (Figura 10B e Tabella S4). Non abbiamo rilevato nessun altro segnale che potesse corrispondere alle miscele PC/PD modificate né ai loro possibili prodotti di degradazione. Ad esempio, per il dimero PC a m/z 577, potremmo rilevare il corrispondente dimero PC di tipo A a m/z 575 nell'estratto ossidato, ma non è stato possibile effettuare osservazioni distinte simili per dimeri o trimeri PC/PD (Figura 10B). Il motivo della perdita di oligomeri PC/PD rilevabili in ESI-MS può essere, ad esempio, reazioni intermolecolari tra PA [13-15,24,25]. È noto che le reazioni intermolecolari determinano la formazione di PA modificati mediante la connessione di due distinte catene oligomeriche e, tipicamente, portano ad un aumento del grado medio di polimerizzazione [14]. Ad esempio, Vernhet et al. (2014) hanno notato da esperimenti di scattering di raggi X a piccolo angolo che se i PA sono ossidati in soluzioni concentrate, i PA modificati sono polimeri ad alto contenuto con lunghe catene lineari o ramificate [25]. Un'ulteriore ossidazione può anche portare alla ciclizzazione tra gli anelli A e B di diversi PA [24]. Inoltre, è stato notato che questi nuovi legami e strutture sono resistenti alla scissione catalizzata da acido, e quindi l'aumento del grado medio di polimerizzazione può essere stimato solo con metodi non depolimerizzanti [14,24. Tuttavia, i nostri risultati hanno mostrato che questi PA modificati non vengono rilevati nemmeno nelle condizioni ESI-MS standard utilizzate per i PA (Figura 10). Nel nostro studio precedente, abbiamo utilizzato un metodo basato sul monitoraggio della reazione selezionato mediante triplo quadrupolo per rilevare i PA in campioni non ossidati e ossidati e abbiamo notato che la composizione della subunità è cambiata a causa dell'ossidazione alcalina, quindi il metodo non era più in grado di rilevare le PA modificate [13]. Gli attuali risultati della MS ad alta risoluzione supportano le nostre precedenti osservazioni per triplo quadrupolo secondo cui le PA modificate negli estratti ossidati sono molto più complesse delle PA iniziali negli estratti non ossidati e che non vengono rilevate in condizioni UPLC-MS/MS simili [13].

I metodi utilizzati per l'ossidazione dei PA in letteratura sono piuttosto diversi dal nostro metodo e, pertanto, i risultati potrebbero non essere direttamente confrontabili [14,24,25]. In studi precedenti l'ossidazione è stata eseguita in acqua acidificata con acido trifluoroacetico a pH 3,5 per imitare il pH del vino, e l'ossidazione vera e propria è stata ottenuta agitando il campione in presenza di aria per diversi giorni [14,24, 25]. Abbiamo usato l'ossidazione alcalina mediante tampone carbonato a pH 10 solo per un'ora.

La maggior parte degli estratti vegetali riguardava PA con subunità PC e PD e solo in due campioni le PA potevano essere considerate quasi pure PD. Questi due campioni erano estratti di Callisia gentlei varelegans e Pellaea ooata. I PD di tipo B sono stati rilevati nella Callisia gentile var. Estratto di Elegans prima dell'ossidazione; si veda, ad esempio, i piccoli oligomeri PD nella Tabella S5, ma dopo l'ossidazione, questi PD non sono stati più rilevati dalla SM. Non abbiamo rilevato nessun altro segnale che potesse corrispondere alle PD modificate né ai loro possibili prodotti di degradazione. Tuttavia, alcuni dei PA modificati sono stati ancora rilevati da UV a 280 nm come una gobba inferiore e ritardata (Figura S3). È interessante notare che prima dell'ossidazione, nell'estratto di dati di Pellaea sono state rilevate PD trimeriche di tipo A e, dopo l'ossidazione, questi segnali erano ancora presenti, ma le loro intensità erano sostanzialmente inferiori

da MS e, inoltre, sono stati rilevati valori m/z corrispondenti alla formazione di ulteriori collegamenti di tipo A nei trimeri PD in modo simile ai PC di tipo A (Tabella S6). Ciò può indicare che oltre alle reazioni intermolecolari osservate per i PD omo ed eterogene di tipo B, i PD di tipo A potrebbero anche avere reazioni intramolecolari simili che sono state rilevate per i PC di tipo A.

2.6. PA Galloulated in estratti vegetali e loro modifiche a causa dell'ossidazione alcalina

Alcune delle piante contenevano PA galloilati. La presenza di PC, PD e PC/PD allocati negli estratti vegetali è stata confermata dai loro caratteristici modelli di frammentazione. In generale, la frammentazione delle PA gallovlate nell'analisi della SM si è verificata in modo simile tramite i meccanismi RDA., HRF e QM come discusso sopra [31-33]. Ad esempio, vengono mostrati e discussi in dettaglio la caratteristica via di frammentazione e i dati MS/MS di un dimero PC galloilato nell'estratto fogliare di Ruprechtia salicifolia (Figura 11). La posizione del gruppo galloile è solo indicativa e potrebbe essere collegato a qualsiasi altro gruppo ossidrile libero nell'unità terminale. Lo ione a m/z603 è la produzione HRF. Gli ioni a m/z 287 e 441 corrispondevano alla scissione QM. Inoltre, abbiamo rilevato la scissione del gruppo galloile risultante nello ione corrispondente al dimero PC a m/z577 e la successiva frammentazione RDA con uno ione a m/z425 e l'ulteriore scissione dell'acqua con uno ione a m/z 407. L'HRF di m/z 577 ha prodotto lo ione frammento a m/z 451. Inoltre, abbiamo rilevato piccoli frammenti di ioni a m/z 109,123 e 125, corrispondenti agli anelli aromatici. I PA galloilati potrebbero contenere diversi gruppi galloile nelle loro strutture (Tabella S7).

I diversi PA galloilati si sono comportati in modo diverso durante l'ossidazione aerea in condizioni alcaline. I PC galloilati erano piuttosto stabili e reagivano in modo simile ai PC non galloilati. Ad esempio, non sono state rilevate modifiche degne di nota per i PC galloilati aventi un gruppo galloile nelle loro strutture nell'estratto di foglie ossidate di Nepenthes maxima (Tabella S7). Tuttavia, va notato che le intensità degli ioni per i PC galloilati aventi due o più gruppi galloile erano inferiori nell'estratto ossidato di Nepenthes maxima e, ad esempio, i PC pentameri galloilati con diversi gruppi galea non erano più rilevabili (Tabella S7). I valori m/z interi per alcuni PC galloilati sono simili ai valori m/z per PC/PD e, pertanto, è richiesta la MS ad altissima risoluzione. Ad esempio, m/z 881 corrisponde a un PA trimerico costituito da due unità PC e un'unità PD (C4sH3; O19, mcalcolato 882.20074) e a un dimero PC galloilato avente due gruppi galloile (C44H34O20, mcalcolato, 882.16435). In alcuni campioni, come nell'estratto fogliare ossidato di Coccoloba uvifera, i PC galloilati sono stati convertiti in PC galloilati di tipo A a causa dell'ossidazione, anche se i PA galloilati nell'estratto iniziale sembravano simili a quelli di Nepenthes maxima. Ad esempio, il dimero PC assegnato avente un galloilgruppo ed esibendo uno ione m/z 729 (Tabella S7) era stabile durante l'ossidazione alcalina nell'estratto fogliare di Nepenthes maxima ma parzialmente modificato nell'estratto fogliare di Coccoloba ugifera esibendo ioni entrambi a m /z 727 e 729. Il primo ione corrispondeva a un PCdimer di tipo A galloilato (m/z727.13148, C37H2O16) e mostrava frammenti MS/MS caratteristici che supportano il collegamento di tipo A: m/z601 (prodotto HRF di m/z 727),575(PCdimer di tipo A), 557 (scissione dell'acqua da m/z575),449 (HRF di m/z575, vedere la figura 4),423(RDA di m/z 575, vedere la figura 4),285 (QM di m/z575, vedere la figura 4), 169 (acido gallico), 125 (vedere la figura 11) e 109 (vedere la figura 11). Una delle ragioni di queste differenze in PA simili tra estratti vegetali potrebbero essere gli altri composti presenti negli estratti e che influenzano le reazioni degli PA.

Le miscele PC/PD galloilate e le PD erano reattive e modificate in modo simile alle miscele PC/PD non galloilate e alle PD. Dopo l'ossidazione, questi PA non sono stati rilevati dalla SM anche se erano ancora visibili ai raggi UV a 280 nm. Non abbiamo rilevato nessun altro segnale che potesse corrispondere a questi PA modificati né ai loro possibili prodotti di degradazione. In un campione, in particolare nelle foglie di acacia karroo, i PD galloilati e non galloilati modificati non sono stati rilevati nemmeno dai raggi UV a 280 nm.

Nel nostro studio precedente [13], in cui i PA negli estratti non ossidati e ossidati sono stati analizzati con metodi di monitoraggio della reazione selezionati, abbiamo notato che una chiara gobba di galloile è stata rilevata con il metodo MS/MS specifico del galloile nei campioni ossidati, ma la forma della gobba era cambiata e si è spostata di conseguenza alla gobba osservata nel cromatogramma UV. Gli originali PA galovlati erano stati modificati in modo che il gruppo galloile potesse ancora essere rilevato con il metodo di monitoraggio della reazione selezionato [13]. Precedenti studi su (-)-epigallocatechina gallato e (-)-epigallocatechina hanno dimostrato che l'anello B triidrossifenile è il principale sito di azione dell'ossidazione e che non ci sono prodotti rilevabili risultanti dall'ossidazione della frazione galloile [42]. Tuttavia, le condizioni di reazione utilizzate e i prodotti di ossidazione ottenuti erano abbastanza diversi rispetto al nostro studio poiché l'ossidazione è stata eseguita con radicali perossilici generati dalla termolisi dell'azoiniziatore 2,2'-azobis(2,{13}}dimetilvaleronitrile) [42].

Oltre alle PA galloilate, due campioni, vale a dire Cephalotaxus harrytomia subsp. le foglioline drupacee e le foglie di Laurus nobilis sembravano contenere PC glicosilati aventi un'unità di zucchero attaccata a una struttura di PC. È stato notato che alcuni di questi PC di tipo B glicosilati si convertono in PC di tipo A glicosilati durante l'ossidazione alcalina senza la scissione dell'unità di zucchero. Inoltre, è stata rilevata la formazione di ulteriori collegamenti eterei ai PC di tipo A.

3. Materiali e metodi

La raccolta dei materiali vegetali, la loro lavorazione ed estrazione, oltre all'ossidazione a pH 1{{10}}, è stata eseguita come precedentemente riportato [13]. Lo studio iniziale conteneva 102 campioni, di cui abbiamo analizzato altri 55 campioni in tutto (Tabella S8). Per l'ossidazione aerea, 20μL di ciascun estratto sono stati ossidati con 18{{40}}uL di tampone a pH 1{{60}}} per 1 ora a temperatura ambiente. L'ossidazione è stata interrotta aggiungendo 100 ul di HCOOH acquoso allo 0,6%. Inoltre, 280 μL di acqua sono stati aggiunti a 20 μL del non ossidato iniziale prima dell'analisi per ottenere il volume finale di 300 μL sia per i campioni non ossidati che ossidati. L'analisi spettrometrica di massa ad altissima risoluzione è stata eseguita da un UPLC-DAD-ESI-QOrbitrap-MS/MS. Lo strumento consisteva in un sistema Acquity UPLC (Waters Corp., Milford, MA, USA) accoppiato con uno spettrometro di massa quadrupolo-Orbitrap (QExactiveTM, Thermo Fisher Scientific GmbH, Brema, Germania). La colonna utilizzata era una colonna Acquity UPLC BEH Phenyl (2,1 × 100 mm, 1,7 um, Waters Corp., Wexford, Irlanda). Gli eluenti erano A= acetonitrile e B=0,1 percento HCOOH. È stata utilizzata una velocità di flusso di 0,5 mLmin-1 e il profilo di eluizione era il seguente:0-0. 5 min,0,1 percento A in B(isocratico);0.5-5 min,0.{41}} percento A in B (gradiente lineare);5-6min,30 percento {{44} } percentuale A in B (gradiente lineare);6-6.1 min, 35-90 percentuale A in B (gradiente lineare); 6.1-9.5 min, lavaggio in colonna e riequilibrio. Il volume di iniezione era 5μL. I dati UV （λ=190-500nm） e MS sono stati registrati durante l'analisi. La ionizzazione negativa è stata utilizzata in una sorgente ESI riscaldata con una tensione di spruzzatura di -3,0 kV, portata del gas di guaina (N2) di 60, portata del gas ausiliario (N2) di 20, portata del gas di spazzamento di 0, la temperatura capillare di più 380 gradi e la dissociazione indotta da collisione (CID) nella sorgente di 30 eV. Per la MS a scansione completa, l'intervallo di massa dell'orbitrap era m/z150-2250, la risoluzione 35,000 e il controllo automatico del guadagno 3×10*. Per le analisi MS/MS, ovvero dd-MS2(TopN), i parametri erano i seguenti: TopN 3; le energie di collisione normalizzate a gradini 20, 50 e 80 eV, la risoluzione 17.500 e il controllo automatico del guadagno 1×105. La calibrazione è stata eseguita da Pierce ESI Negative Ion Calibration Solution (Thermo Fisher Scentific Inc., Waltham, MA, USA). I dati sono stati elaborati con il software Thermo Xcalibur Oral Browser (versione 3.0.63, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA). Poiché i campioni ossidati sono stati ottenuti utilizzando tampone carbonato di sodio (pH 10), il sodio ha formato ioni cluster con acido formico durante l'analisi UHPLC-MS/MS. Pertanto, all'inizio di ogni cromatogramma ionico totale di campioni ossidati, è stato rilevato un forte picco di cluster di formiato di sodio (Tabella S9). Il pattern è stato facilmente individuato e non ha influenzato l'analisi delle PA. Gli ioni di frammento MS/MS di piccoli oligomeri PA sono presentati nella Tabella S10.

4. Conclusioni

In questo studio, abbiamo analizzato la composizione PA di 55 estratti vegetali prima e dopo l'ossidazione alcalina mediante UHPLC-MS/MS ad altissima risoluzione (Tabella S8). Le strutture PA naturali contenevano PC di tipo A e B, PD e miscele PC/PD oltre a quelle allocate. Le composizioni di PA erano complesse ed era necessaria la MS ad altissima risoluzione per misurare le masse esatte e le corrispondenti formule molecolari di diversi PA. I PC di tipo B in diversi estratti vegetali erano piuttosto stabili e non mostravano modifiche minime o nulle a causa dell'ossidazione alcalina. Per alcuni campioni, abbiamo rilevato le reazioni intramolecolari dei PC che producono legami eterei di tipo A. Anche i PC di tipo A erano piuttosto stabili senza alcuna o minore modifica, ma, in alcune piante, è stata rilevata la formazione di ulteriori legami eterei. Gli estratti vegetali contenenti unità PD in PA (sia PD puri o miscele PC/PD) erano più reattivi. Dopo l'ossidazione alcalina, questi PA o i loro prodotti di ossidazione non sono stati più rilevati da MS anche se un tipo diverso e/o una gobba di PA ritardata è stata ancora rilevata dai raggi UV a 280 nm. Le reazioni intermolecolari tra i PA hanno probabilmente modificato questi PA in modo che non fossero rilevati nelle condizioni standard ESI-MS. Studi precedenti hanno dimostrato che questi PA modificati non possono essere studiati nemmeno con metodi di degradazione. Pertanto, sarebbe necessario un nuovo metodo analitico per la loro identificazione e caratterizzazione. Gli PA galloilati erano relativamente stabili sotto ossidazione alcalina se erano basati su PC, ma si formavano ulteriori legami eterei a supporto della conversione di PA di tipo B galloilati in PA di tipo A galloilati. I PA contenenti due o più gruppi galloile erano più reattivi di quelli contenenti un solo gruppo. Le miscele e le PD gallovlate PC/PD erano più reattive e reagivano in modo simile a quelle non galloilate. Tuttavia, va notato che le reazioni intra e intermolecolari non erano di esclusione e queste reazioni potevano verificarsi contemporaneamente. Inoltre, la matrice vegetale e altri composti presenti hanno influenzato queste interazioni.