I glicosidi del feniletanolo da Cistanche tubulosa sopprimono l'attivazione delle cellule stellate epatiche e bloccano la conduzione delle vie di segnalazione nel TGF-01/smad come potenziali agenti anti-fibrosi epatica
Mar 05, 2022
Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang e Tao Liu
Astratto: Cistanche tubuloseè una medicina tradizionale cinese a base di erbe ampiamente utilizzata per regolare l'immunità eglicosidi feniletanoidi(CPhGs) sono tra le componenti primarie responsabili di questa attività. Precedenti studi hanno indicato gli effetti preventivi e terapeutici dei CPhG sulla fibrosi epatica indotta da albumina sierica bovina (BSA) nei ratti. Lo scopo dello studio era di valutare l'effetto della fibrosi epatica dei CPhG e dei monomeriechinacosideeacteosideinibendo l'attivazione delle cellule stellate epatiche (HSC), bloccando la conduzione delle vie di segnalazione nella trasformazione del fattore di crescita-p1 (TGF-p1)/smad e determinando che sono attività epatoprotettiva in vitro. La proliferazione delle HSC è stata ovviamente inibita dopo trattamento con CPhGs (100,50 ^g/mL)/echinacoside (500,250,125 ^g/mL)/acteoside (6, 3 ^g/mL), con valori di IC50 di 119.125.520.345 e 6.999 g/ ml, rispettivamente, nel test MTT. Diverse concentrazioni di CPhG/echinacoside/acteosidenon ha influenzato la tossicità cellulare sulle HSC secondo le misurazioni della lattato deidrogenasi (LDH). Diverse concentrazioni di CPhG/echinacoside/acteosideaumentato il livello di mRNA e l'espressione proteica di smad7 e diminuito i livelli di mRNA di smad2, smad3 e l'espressione proteica di smad2, phospho-smad2 (p-smad2), smad3, phospho-smad3 (p-smad3) in HSC. In sintesi, questi risultati dimostrano che i CPhG/echinacoside/acteosidepuò bloccare la conduzione delle vie di segnalazione in TGF-p1/smad e inibire l'attivazione di HSC, suggerendo cheC. tubulosapuò quindi essere un potenziale medicinale a base di erbe per il trattamento della fibrosi epatica.
Parole chiave: Cistanche tubulose; feniletanolo glicosidi daCistanche(CPHG);echinacoside; acteoside; cellule stellate epatiche (HSC); TGF-p1/smad
1. Introduzione
diventano proliferativi e fibrogeni, successivamente accumulano ECM e infine si differenziano in cellule fibrogene simili a miofibroblasti. Il fattore di crescita trasformante-.1 (TGF-p 1) è considerato il principale mediatore profibrogenico. La via di segnalazione correlata a TGF-&1 è un importante meccanismo di fibrosi epatica e include principalmente la segnalazione smad-dipendente e indipendente da smad, e si pensa che la via di trasduzione della segnalazione smad-dipendente sia un canale importante di segnalazione di TGF-p1 . Pertanto, il blocco della via di segnalazione TGF-p1/smad può sopprimere la produzione di collagene e infine alleviare la fibrosi epatica, che negli ultimi anni ha reso questa via un obiettivo importante nella ricerca sui farmaci anti-fibrosi epatica.
Nonostante l'elevata incidenza mondiale di fibrosi epatica, non è disponibile alcuna terapia antifibrogenica generalmente accettata [2-4]. Le medicine a base di erbe tradizionali cinesi (TCHM) sono di grande interesse per il trattamento dei disturbi del fegato perché alcuni possono essere utilizzati farmaci terapeutici nella gestione e prevenzione della fibrosi epatica. Attualmente, molti studi si concentrano su potenziali farmaci anti-fibrogenici che sono stati usati come TCHM per migliaia di anni [5].
Cistanche tubulosa W (famiglia Orobanchaceae)fa pianta parassitaria, è ampiamente coltivata nella regione meridionale dello Xinjiang in Cina [6]. Le persone lo usano per rinvigorire i reni, nutrire il sangue, rilassare l'intestino e ritardare la senescenza senza effetti collaterali, ed è ufficialmente elencato nella farmacopea cinese [7]. C. tubulosa contiene una varietà di componenti attivi, inclusi glicosidi feniletanoidi (CPhG), iridoidi e polisaccaridi. Tra i numerosi componenti attivi di C. tubulous, i CPhG, che presentano numerose bioattività (antiossidante, antifatica, radioresistenza, ecc.) sono i principali componenti caratteristici di questa pianta di Pie. Negli ultimi anni, è stato riferito che i CPhGis hanno effetti epatoprotettivi Hent in eccesso e possono eliminare i radicali degli alberi, proteggere le membrane epatiche e mostrare effetti immunoregolatori, inibizione dell'apoptosi, inibizione dell'espressione dell'antigene di superficie dell'epatite B (HBs Ag) e dell'epatite B e attività di replicazione del DNA dell'antigene (HBeAg) e del virus dell'epatite B (HBV), ecc. Il livello di DNA dell'HBV è l'indice più affidabile che riflette direttamente l'attività di replicazione virale, che è il fattore chiave nel determinare la storia naturale delle infezioni croniche da HBV, monitorare l'effetto della terapia antivirale oP e valutare la prognosi delle infezioni acute e croniche da HBV. Gli indici di rilevamento sierologico dell'HBV includono principalmente HBsAg, HBeAg, ecc. [8-11]. Tuttavia, ci sono pochi rapporti in letteratura sugli effetti della fibrosi antiepatica dei CPhG. Precedenti studi hanno indicato gli effetti preventivi e terapeutici dei CPhG sulla fibrosi epatica indotta dall'albumina sierica bovina (BSA) nei ratti, ma l'attività antifibrogenica dei CPhG e dei suoi principali monomeri (echinacoside e acteoside, Figura 1) non sono mai stati valutati in vitro.
Cistanche tubulosa biologica
2. Risultati
2.1. Determinazione quantitativa dei CPhG
CphG dentroC. tubulosacontengono IDue glicosidi dell'alcol feniletilico: echinacoside e acteo side, e il loro contenuto nei CPhG è stato rilevato dall'analisi HPLC (Figura 1) per essere del 42,71% 土 0,42% e 14,27% 土 0.18 per cento, rispettivamente.
2.2. Attività inibitorie di CPhGs, Echinacoside e Acteoside su HSC-T6
I CPhG, l'echinacoside e l'acteoside (62.5-500 卩g/mL) hanno inibito la vitalità cellulare dell'HSC in modo dipendente dalla concentrazione. CPhG e acteoside hanno mostrato una notevole attività inibitoria sulle cellule HSC, con valori di inibizione dell'attività di crescita cellulare (IC50) del 50% rispettivamente di 119,125 昭/mL e 6,999 昭/mL. L'echinacoside ha mostrato un'attività inibitoria moderata (IC50,520,345 昭/mL; Tabella 1 e Figura 2).
2.3. Tossicità cellulare di CPhG, Echin acoside e Acteorida su HSC
La lattato deidrogenasi (LDH), un enzima citoplasmatico stabile presente in tutte le cellule, viene rapidamente rilasciato nel supernatante della coltura cellulare in caso di danno alla membrana plasmatica. L'attività enzimatica nel supernatante di coltura è correlata alla proporzione di celf lisati [12]. Come mostrato nella Tabella 2, quando trattati con differenti: concentrazioni di C PhGs, echinacoside e acteoside, sebbene l'attività LDH mostrasse un leggero aumento rispetto al gruppo del coirtrol cellulare, la differenza non era statisticamente significativa (p > 0.05 ), indicando che la maggior parte delle membrane cellulari ha mantenuto la propria integrità e che l'inibizione di CPhG, echinacoside e acteoside sulle HSC non è dovuta a tossicità cellulare aspecifica.
2.4. Effetto di CPhGs, Echinacoside e Acteosde sulla proliferazione di HSC indotta da TGF-^i
La proliferazione, l'attivazione e la differenziazione delle HSC sono regolate da una varietà di fattori. Tra i vari fattori coinvolti nella fibrosi epatica, il TGF{{0}} è considerato il più importante, poiché può attivare l'HSC, promuovere la differenziazione dei miofibroblasti, aumentare la sintesi di ECM e inibire la degradazione dell'ECM e rilasciare chemochine e citochine coinvolte nella fibrosi epatica [13]. In questo studio, ad eccezione del gruppo di controllo, le HSC stazionarie sono state stimolate in vitro con TGF-P1 per simulare la formazione di fibrosi epatica precoce e per studiare l'effetto di CPhG, echinacoside e acteoside sul TGF-p1- proliferazione indotta di HSC. Come mostrato nella Tabella 3, rispetto al gruppo di controllo, il gruppo TGF-61 ha promosso significativamente la proliferazione di HSC (p < 0.01).="" rispetto="" al="" gruppo="" tgf-p1,="" tgf-p1="" più="" cphgs="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf{{18}="" }="" più="" echinacoside="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" µg/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf-p1="" più="" acteoside="" (ta)="" (3,0,="" 6,0="" µg/ml,="" p="">< 0,05)="" hanno="" tutti="" notevolmente="" inibito="" la="" proliferazione="" di="" hsc="" indotti="" da="" tgf-|3="" 1="" in="" gradi="">
2.5. Espressioni di smad2)smad3 e smad7 mRNA dopo CPhG, intervento di ochmacoside e acteaside su HSC
Smad3 e smad2 sono gli effettori chiave a valle della via di segnalazione TTGF-p [ 14,15] e smad7 è un inibitore della segnalazione smad. Teoricamente, l'aumentata espressione di smad7 o la ridotta espressione di smad2/smad3 può bloccare la conduzione delle vie di segnalazione in TGF-p 1/ smad. Come mostrato nella Figura 3, l'analisi PCR quantitativa in tempo reale ha mostrato che l'espressione di mRNA di smad2 e smad3 indicava un livello più basso, mentre smad7 indicava livelli più alti nel gruppo di controllo, rispetto al gruppo TGF-|31. Nel gruppo TC (25, 50, 75,100 |dg/mL), il livello di mRNA di smad2 (p < 0.{{37="" }}5)="" e="" smad3="" (p=""><0,01) erano="" significativamente="" diminuiti="" rispetto="" al="" gruppo="" tgf-pf,="" ed="" erano="" anche="" simili="" al="" gruppo="" di="" controllo;="" nel="" frattempo,="" il="" livello="" di="" mrna="" di="" smad7="" è="" stato="" significativamente="" aumentato="" nel="" gruppo="" tc="" (50,="" 75.100="" 卩g/ml)="" (p=""><0,05, p=""><0,05, p=""><0,01, rispettivamente).="" tuttavia;="" l'espressione="" smad7="" indicava="" una="" tendenza="" ascendente="" nel="" gruppo="" tc="" 25="" 卩g/ml="" rispetto="" al="" gruppo="" tgf-p1="" (figura="">
Nel frattempo, rispetto al gruppo TGF-p1, l'espressione dell'mRNA smad2 e smad3 era significativamente ridotta nel TE (62,5, 125, 250, 500 卩g /mL) (p < 0.01)="" e="" le="" espressioni="" di="" smad7="" mrna="" erano="" significativamente="" aumentate="" nel="" gruppo="" te="" (125,="" 250.500="" 昭/ml)="" (p="">< 0,01)="" (figura="" 4)="" .="" allo="" stesso="" modo,="" anche="" il="" gruppo="" ta="" (0,75,1,5,="" 3,0,="" 6,0="" ^g/ml)="" ha="" mostrato="" la="" stessa="" tendenza="" (figura="">
2.6. Influenza di CPhGs, Echinacoside e Ac)eosids su T GF-^i/smad Signaling Pathway in HSC
La via di segnalazione TGF-p 1/smad dipende da smad2, smad3, phospho-smad2 (p-smad2), phospho-smad3 (p-smad3) e smad7, dove p-smad2, p-smad3 sono le forme attivate di smad2 e smad3. In questo studio sono stati analizzati i livelli proteici di omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 e smad7. L'analisi Western blot ha rilevato aumenti dei livelli di smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 da parte di TGF-p1 e l'inibizione di questi aumenti da parte di CPhG, ec hinacoside e acteoside; nel frattempo, l'analisi wesiern blot ha rivelato livelli di smad7 up-regolati da CPhG, echinacoside e acteoside. (Figure 6-8).
Come mostrato nella Figura 6, rispetto al gruppo c on2rol (le espressioni proteiche di smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 erano significativamente aumentate e l'espressione della proteina smad7 era diminuita nel gruppo TGF-p1. Nel TC (25 , 50, 75, 100 昭/mL) gruppi di farmaci, smad/ (Figura 6A), p-smad2 (Figura 6B), smad 3 (Figura 6C), p -smad3 (Figura 6D) le espressioni erano significativamente inferiori a quelle del gruppo TGF-p1 (卩 <0,01) e l'espressione della proteina smad7 (Figura 6E) era superiore a quella del gruppo TGF-S1 (p <0,01) (Figura 6).
Allo stesso tempo, le espressioni della proteina smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 e smad7 sono state misurate dopo l'intervento di echinacoside e acteoside su HSC. Come mostrato nelle Figure 7 e 8, i livelli di espressione delle proteine smad2, smad3, p-smad2 e p-smad3 sono stati significativamente inibiti (p < 0.05="" o="" p="">< 0.01="" ),="" il="" livello="" di="" espressione="" della="" proteina="" smad7="" era="" elevato="" (p=""><0,01), rispetto="" al="" gruppo="" tgf-p="" 1="" (figure="" 7="" e="">
3. Discussione
La fibrosi epatica è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo, ma attualmente sono disponibili opzioni terapeutiche molto limitate per questa condizione, pertanto è molto importante per noi cercare potenziali bersagli per l'intervento terapeutico per prevenire lo sviluppo della fibrosi epatica [ 16]. Recentemente, i ricercatori hanno scoperto che vari medicinali a base di erbe hanno effetti epatoprotettivi degli antifibrotici. Molti TCHM come le pillole Fufang Biejia Ruangan [17] e il decotto Xiao-chai-hu (shosaiko in Giappone) [18,19] sono stati ampiamente utilizzati per il trattamento della fibrosi epatica in Cina, Corea e Giappone per migliaia di anni. C. tubulosa contiene una varietà di componenti attivi tra cui CPhG, iridoidi e polisaccaridi. Essendo una delle basi materiali efficaci di C. tubulosa, i CPhG possiedono un'eccellente attività epatoprotettiva, ma ci sono informazioni limitate sugli effetti antifibrotici dei GPhC e dei suoi composti correlati. In questo studio, abbiamo studiato in che modo CPhG, echinacoside e acteoside sopprimono l'attivazione delle HSC e bloccano la condu zione della via di segnalazione nel TGF-p1/snaad come potenziali agenti anti-epatici per la fibrosi in vitro.
Il danno epatico di qualsiasi eziologia porterà alla fine all'attivazione di HSC, che subiscono la transdifferenziazione in cellule fibrogene simili a miofibroblasti [20]. Vale a dire che i miofibroblasti
derivano dall'attivazione e dalla proliferazione di HSCss [21], ed è considerato il mediatore della formazione della fibrosi epatica. Per questo motivo, abbiamo condotto studi in vitro per confrontare i tassi di vitalità cellulare delle HSC esposte a CPhG, echinacoside e acteoside. I risultati hanno mostrato che l'effetto inibitorio dell'acteoside sull'HSC era il più forte e l'effetto dei CPhG era migliore di quello dell'echinacoside. I sieri medicati con CPhG, echinacoside e acteoside hanno tutti inibito la proliferazione delle HSC in modo dose-dipendente.
L'LDH è un enzima citoplasmatico nelle cellule viventi e non può penetrare nella membrana cellulare in circostanze normali. Quando le cellule sono danneggiate, la permeabilità della membrana aumenta e l'LDH viene rilasciato all'esterno delle cellule. Di solito, LDH può rilevare il grado di danno cellulare [{{0}}]. L'indagine ha mostrato che l'attività LDH di CPhG, echinacoside e siero medicato con acteoside ha mostrato solo un leggero aumento rispetto al gruppo di controllo cellulare e la differenza non era statisticamente significativa (p > 0,05), indicando che la maggior parte della membrana cellulare ha mantenuto la propria integrità e l'inibizione delle HSC da parte di CPhG, echinacoside e acteoside non è dovuta a tossicità cellulare aspecifica.
Quando si verifica un danno epatico, gli epatociti attivati possono rilasciare TGF-pi che a sua volta attiva HSC-T6, pertanto, il TGF-pi ha una stretta relazione con la fibrosi [25-27]. In questo studio, CPhG, echinacoside e acteoside potrebbero essere considerati una strategia terapeutica interessante per l'inibizione della proliferazione delle HSC dopo che le HSC sono state stimolate con wTGF-pi in vitro. Ipotizziamo che i CPhG, l'echinacoside e l'acteoside possano essere usati come una sorta di trattamento e/o prevenzione della fibrosi epatica e inibiscono la formazione della fibrosi epatica precoce. La formazione della fibrosi epatica è un complesso processo di coinvolgimento multifattoriale e multicellulare. In questo processo patologico, le interazioni cellula-cellula, cellula-citochine e cellula-matrice costituiscono una rete ingombrante. In questa rete, lo sviluppo della fibrosi epatica può essere regolato da diverse vie e mezzi di segnalazione. Il TGF-pi è un classico attivatore delle HSC e un mediatore chiave nella patogenesi della fibrosi epatica [28]. CPhG, echinacoside e acteoside possono inibire l'espressione dell'mRNA e delle proteine correlate al percorso TGF-pi/smad nelle HSC.
Il TGF-pi esercita i suoi effetti cellulari attraverso la via di segnalazione smad ed è stato considerato un mediatore chiave nello sviluppo della fibrosi epatica e dell'infiammazione. Dopo il legame del TGF-pi al recettore del TGF-p-tipo II, la chinasi del recettore di tipo II fosforila il dominio GS del recettore del TGF-p di tipo I, portando all'attivazione del recettore di tipo I [29]. Attraverso l'azione di p-smad2 e p-smad3 su due residui di serina nel motivo SSXS del loro terminale C, le reazioni a valle della via di segnalazione smad sono attivate dall'attivazione del recettore di tipo I [30]. P-smad2 e p-smad3 formano complessi oligomerici con smad4, quindi entrano nel nucleo ed esercitano la loro attività di trascrizione biologica. Pertanto, le proteine smad trasmettono segnali direttamente dal recettore chinasi al nucleo [3i]. D'altra parte, smad7 è saldamente combinato con il recettore TGF-pi, portando all'impossibilità di attivare smad 2/3 e all'inibizione delle vie di trasduzione del segnale [32]. Smad7 può agire per inibire p-smad2 e p-smad3, traslocazione nucleare di complessi smad attivati e attivazione di (CAGA) (9)-MLP-Luc, con conseguente diminuzione dell'espressione del collagene I e completa inibizione della trasduzione del segnale TGF-p [33,34]. I nostri risultati hanno mostrato che CPhG, echinacoside e acteoside possono diminuire le espressioni di mRNA di smad2 e smad3 e aumentare l'espressione di mRNA di smad7; inibire le espressioni proteiche smad2, p-smad2, smad3 e p-smad3 e sovraregolare l'espressione proteica smad7, suggerendo che CPhG, echinacoside e acteoside svolgono anche un ruolo nell'inibire l'attivazione delle HSC e quindi inibire la fibrosi epatica, evidenziando un potenziale anti-fibrotico meccanismo.
È stato dimostrato che la sequenza degli effetti epatoprotettivi dei tre agenti di prova è acteoside > CPhG > echinacoside. Al fine di chiarire ulteriormente le ragioni delle differenze nel meccanismo con cui CPhG, echinacoside e acteoside proteggono dalla fibrosi epatica, sono state analizzate le loro strutture chimiche. La frazione glicosidica dell'alcol fenetilico sembra essere una struttura essenziale per l'effetto epatoprotettivo [35]. L'acteoside (C29H36Oi5) è un doppio glicoside e l'echinacoside (C35H46O20) è un triglicoside, cioè l'echinacoside ha un glicoside in più nella sua struttura rispetto all'acteoside, che porta ad un aumento della sua dimensione spaziale. L'attività epatoprotettiva o l'inibizione dell'attività HSC dell'acteoside è migliore di quella dell'echinacoside, il che può essere dovuto all'esistenza dell'impedimento sterico.
proteggere il fegato: estratto di cistanche
4. Sezione Sperimentale
4.1. Sostanze chimiche e reagenti
TGF-pi è stato acquistato da Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA). La linea cellulare HSC-T6 è stata acquistata da Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Wuhan, Cina). Il dimetilsolfossido (DMSO) è stato acquistato da Sigma Inc. (St. Louis, MO, USA). I primer Smad2, smad3 e smad7 sono stati prodotti dalla Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Shanghai, Cina). Il kit di sintesi del cDNA del primo filamento Revert Aid è stato acquistato da Thermo Scientific (Shanghai, Cina). Il kit Quantifast SYBR green PCR è stato acquistato da QIAGEN GmbH (Hilden, Germania). L'anticorpo p-smad2 (ser465/467), il mAb di coniglio Smad3 (C67H9) e il mAb di coniglio p-smad3 (ser423/425) sono stati acquistati da Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA). L'anticorpo Smad7 è stato acquistato da Boster (Wuhan, Cina). L'anticorpo policlonale Smad2 e l'anticorpo monoclonale p-actina sono stati acquistati da Proteintech (Wuhan, Cina). Il rilevamento dell'anticorpo primario è stato effettuato utilizzando una soluzione di anticorpi a 2 gradi (Alk-Phos. Coniugato, anti-coniglio) e una soluzione di anticorpi a 2 gradi (Alk-Phos. Coniugato, anti-topo) acquistati da Invitrogen™ (Carlsbad, CA, USA). Il kit per il test della lattato deidrogenasi proveniva dal Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Cina).
4.2. Materiale vegetale
C. tubulosa è stata raccolta a Tulufan, nella regione cinese autonoma dello Xinjiang Uirghur, nel maggio 2006. I materiali vegetali sono stati identificati come C. tubulosa da Jiang He, Istituto di Materia Medica dello Xinjiang. Un esemplare di voucher è stato depositato presso l'Istituto di Materia Medica dello Xinjiang in Cina.
4.3. Isolamento e purificazione di CPhG e suoi composti
Rizomi secchi e affettati di C. tubulosa (6,0 kg) sono stati estratti consecutivamente tre volte a riflusso con 70 percento di etanolo (4,8 L) e il solvente è stato quindi rimosso dagli estratti combinati per per dare l'estratto di etanolo (1,146 kg). Gli estratti di etanolo sono stati purificati mediante resina AB-8 per ottenere l'estratto grezzo di feniletanolo glicosidi (CPhG s). Dopo la dissoluzione in acqua, l'atto estratto è stato purificato mediante cromatografia su resina macroporosa ad adsorbimento AB-8 per ottenere i lati glicodici di feniletanolo totale da C. tubulosa (CPhGs, 210 g). I CPhG sono stati applicati su una colonna ODS OP{{10}} ed eluiti successivamente con miscele di MeOH—H?.(0:1 -^1:0). Gli eluati sono stati combinati in cinque sottofrazioni secondo il comportamento delle TLC usando il sistema solvente CHCh-MeOH-H?.(6:4:0,5). I punti sono stati visualizzati dopo la spruzzatura con FeCih all'1%. Varie frazioni sono state ripetutamente purificate mediante cromatografia su colonna Sephadex LH-20 con metanolo come eluente e due glicosidi feniletanolo sono stati isolati dai CPhG. Le loro strutture sono state confermate come echinacoside (C35H46O20) e acteoside (C29H36O15) utilizzando MS, 1H- e MC-NMR [35], le cui purezza sono state determinate rispettivamente come 99,17% e 98,92% mediante UV-HPLC. Le strutture di echinacoside e acteoside sono mostrate in Figura 9.
4.5. Determinazione quantitativa dei CPhG
La cromatografia liquida (HPLC) (LC{{0}}Uno strumento HPLC, Shimadzu Co., Kyoto, Giappone) è stata utilizzata per analizzare il contenuto di echina coside e un cteoside nei CPhG. È stata utilizzata una colonna Phenomenex Gemini ODS (250 x 4,6 mm, 5 |^m) a 30 gradi. Una fase mobile isocratica costituita da metanolo-acetonitrile{7}} percentuale di acido acetico (15:10:75, v/v/v) è stata utilizzata per una corsa di 40 minuti, a una velocità di flusso di 0,6 mL/min, con UV rilevamento a 334 nm.
4.6. Coltura cellulare
Le cellule HSC sono state coltivate nel mezzo Eagle's modificato (High Glucose) di Dulbecco (DMEM, Pechino, Cina) integrato con l'10 percento di siero bovino fetale (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), 10 0 IU/mL di penicillina e 100 ^g/mL di streptomicina (HyClone, Logan, UT, USA) in un'incubatrice umidificata a 37 gradi con il 5% di CO2. Queste cellule sono state regolarmente subcoltivate con una soluzione di tripsina allo 0,25 percento (1x) (HyClone, Logan, UT, USA) e il mezzo è stato cambiato ogni 2 giorni. Inizialmente, le cellule sono state coltivate con DMEM contenente il 10% di FBS per 48 ore. Il mezzo è stato quindi sostituito con DMEM senza FBS per far morire di fame le cellule per 12 ore. Queste cellule sono state propagate per 48 ore e dopo 48 ore, il siero è stato affamato con FBS allo 0,5% per 12 ore prima di aggiungere 5 ng/mL di TGF-&1,
4.7. Determinazione dei valori IC50
Dopo un'incubazione notturna in un mezzo di fame contenente {{0}},5 percento di FBS, le cellule HSC sono state seminate in una piastra a 96-pozzetti a una densità di 5 x 104 cellule/mL per 24 ore. Le cellule HSC sono state trattate con CPhG, echinacoside e acteoside a diverse concentrazioni (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250 e 500 ^ g/mL) per 48 ore. Ogni concentrazione aveva quattro pozzi. Al termine del trattamento, 20 卩L MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro] (Sigma; 5 mg/mL) sono stati aggiunti e le cellule sono state incubate per altre 4 ore. DMSO (200 rL) è stato aggiunto a ciascun pozzetto dopo aver rimosso il supernatante. Dopo aver agitato la piastra per 10 minuti su uno shaker, i valori IC50 sono stati ottenuti misurando l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 490 nm utilizzando uno strumento di etichettatura enzimatica (Benchmark PLUS, Hercules, CA, USA), questo test è stato eseguito in triplicato. I valori IC50 di CPhGs, echinacoside e acteoside erano rispettivamente 119,125, 520,345 e 6,999 Rg/mL.
4.8. Gli effetti dell'inibizione proliferativa cellulare e la vitalità cellulare
Le cellule HSC sono state esposte a diverse concentrazioni di CPhG (25.50.100 Rg/mL), echinacoside (125.250.500 Rg/mL) e acteoside (1,5,3, 6 Rg/mL). Diverse concentrazioni di CPhG, echinacoside e acteoside sono state applicate sulla piastra in quattro pozzetti consecutivi e incubate per 48 ore. Gli effetti di inibizione della proliferazione cellulare e il livello di vitalità cellulare (basato sulla misurazione dell'attività LDH rilasciata dalle cellule danneggiate nel surnatante [36]) sono stati determinati mediante un test MTT. Il tasso di inibizione è stato calcolato utilizzando la seguente formula [37]:
Tasso di inibizione ( percentuale ) " [1 — (assorbanza media del gruppo sperimentale/assorbanza media del gruppo di controllo in bianco)] x 100 percento
Secondo le istruzioni del kit,
LDH (U/L) {{0}} (OD misurata — OD di controllo)/(OD standard — OD vuota) x 0,2 mmol/L x 1000
Il nostro studio preliminare ha mostrato che CPhG, echinacoside e acteoside non hanno influenzato la vitalità cellulare.
4.9. Attività antiproliferative di TGF-^1
L'HSC attivato dal TGF-p1 è stato a lungo considerato associato alla fibrosi epatica e l'inibizione della crescita dell'HSC è stata proposta come metodo per il trattamento della fibrosi epatica [36,38]. Gli effetti anti-proliferativi di CPhG, echinacoside e acteoside sulle HSC attivate dal TGF-p1 sono stati determinati mediante un test MTT [39]. Utilizzando le procedure e le concentrazioni di farmaco descritte, il
i gruppi sperimentali includevano il gruppo di controllo, il gruppo TGF-pi, il TGF-pi più diversi gruppi di farmaci a concentrazione. Tutti i gruppi cellulari tranne il gruppo di controllo sono stati coltivati con DMEM contenente 5.0 ng/mL TGF-p1 (senza FBS) per 24 ore. L'attività inibitoria sulla proliferazione cellulare è stata calcolata come 100 x (assorbimento del composto trattato — assorbimento della luce di fondo)/(assorbimento del modello — assorbimento della luce di fondo).
4.10. Reazione a catena della trascrizione inversa-polimerasi (RT-PCR)
Il livello di espressione dell'mRNA di smad2, smad3 e smad7 è stato determinato mediante PCR in tempo reale. Per determinare l'espressione dell'mRNA nelle cellule HSC, le cellule (5 x 104 cellule) sono state seminate in piastre a sei pozzetti con 3.{31}} ml di DMEM con il 10% di FBS e incubate per una notte a 37 gradi e 5 per cento di CO2. Dopo che il terreno di coltura è stato cambiato in DMEM privo di siero, ai pozzetti sono stati aggiunti CPhG (100,50,25 卩g/mL), echinacoside (500.250.125 昭/mL) e acteoside (6, 3,1,5 ^ g/mL). Dopo incubazione per 48 ore con CPhG e composizioni di monomeri, l'RNA totale è stato estratto utilizzando il reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) e agitato vigorosamente con cloroformio per 15 s. Dopo aver lasciato riposare a temperatura ambiente per 3 minuti, il lisato è stato centrifugato a 12,{28}} xg per 15 minuti a 4 gradi. L'RNA nella fase acquosa è stato precipitato con isopropanolo e la fase acquosa superiore è stata trasferita in una nuova provetta per microcentrifuga. L'RNA è stato precipitato aggiungendo 0,75 percento di etanolo, dopodiché la provetta per microcentrifuga e centrifugata a 12,{34}} xg a 4 gradi per non più di 5 minuti. Il supernatante è stato rimosso e l'RNA è stato essiccato a temperatura ambiente per 5-10 min. I primer (Sangon) sono stati progettati utilizzando Batch Primer 3 e sono elencati nella Tabella 4. I risultati sono stati normalizzati all'mRNA del gene housekeeping p-actin come controllo interno e sono presentati come livelli di mRNA relativi. Le reazioni sono state eseguite con 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 coppia di primer pM, 8,5 acqua distillata e 2,5 rL di cDNA.
Ciascuna reazione a catena della polimerasi è stata eseguita nelle seguenti condizioni: 95 gradi per 3 minuti, quindi 40 cicli di 10 s a 95 gradi, 30 s a 55 gradi e 10 s a 55 gradi -95 gradi per l'estensione, seguiti da una singola misura di fluorescenza. I risultati finali sono stati descritti con i relativi valori ({10}}AACt). Il calcolo e l'analisi sono stati eseguiti dal sistema di rilevamento PCR in tempo reale iQ5.
4.11. Analisi Western Blot
Gli estratti di cellule intere sono stati preparati utilizzando il tampone del test di radioimmunoprecipitazione (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) con l'1% di inibitore della proteasi Halt e l'1% di cocktail di inibitori della fosfatasi Halt (Thermo Fisher Scientific, Inc.). La proteina totale è stata utilizzata per il rilevamento di smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 e smad7. La concentrazione proteica è stata misurata e quantificata con il metodo Bradford. La proteina (10-30 Rg) è stata separata su un gel SDS-PAGE all'10 percento e trasferita su membrane di fluoruro di polivinilidene (PVDF) (Millipore, Boston, MA, USA). Le membrane sono state bloccate per 1 ora a temperatura ambiente con albumina sierica bovina al 5% e gli anticorpi primari (anticorpo policlonale smad2, anticorpo p-smad2, mAb di coniglio smad3 e mAb di coniglio p-smad3, diluizione 1:1000; mAb di coniglio di smad7, 1 :200 diluizione, anticorpo monoclonale p-actina, diluizione 1:5000) sono stati incubati a 4 gradi durante la notte. Il corrispondente Alk-Phos. gli anticorpi secondari coniugati sono stati incubati a temperatura ambiente. Infine, le membrane sono state lavate tre volte con 1 x soluzione salina Tris-HCl con 0,1 percento di Tween 20 e i segnali sono stati scansionati e visualizzati da un sistema di imaging GEL DOC XR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). L'analisi densitometrica è stata eseguita sulle proteine di interesse e normalizzate in p-actina dal software GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). p-actin è stato utilizzato come controllo interno.
4.12. Analisi statistica
I dati sono stati espressi come media 土 deviazione standard (SD). Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software SPSS 16.0 (Xinjiang Medical University). L'analisi Probit è stata utilizzata per analizzare i valori IC50. La significatività della differenza è stata calcolata mediante il test ANOVA a una via e i valori con p <0,05 sono="" stati="" considerati="" statisticamente="">
5. Conclusioni
In conclusione, i CPhG di C. tubulosa e i suoi componenti echinacoside e acteoside mostrano significativi effetti antifibrotici. Tra questi, l'attività dell'acteoside è la più potente, mentre l'attività dei CPhG è tra i due composti. L'inibizione dell'attivazione della segnalazione di TGF-p1/Smad può essere il meccanismo alla base con cui i CPhG proteggono dalla malattia epatica cronica associata alla fibrosi e l'echinacoside e l'acteoside sono l'efficace base del materiale antifibrotico di C. tubulosa.
Ringraziamenti:Questa ricerca è stata supportata dalla National Natural Science Foundation of China (81260624). Gli autori desiderano esprimere i loro sinceri ringraziamenti al professor Tao Liu per il miglioramento della scrittura in questo articolo.
Contributi dell'autore:TL, JZ, S.-PY, LM e S.-LZ hanno ideato e progettato gli esperimenti. S.-PY, TL e JZ hanno analizzato i dati. S.-PY e JZ hanno scritto il manoscritto. TL, LM e JZ hanno esaminato il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.
Conflitto di interessi:Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.
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