I glicosidi del feniletanolo di Herba Cistanche migliorano il microambiente del tumore ipossico e potenziano gli effetti dell'oxaliplatino

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LIMEI WEN1,2*, JUNPING HU1*, JIAWEI ZHANG1 e JIANHUA YANG1,2

Astratto.Il cancro del fegato è uno dei tipi più comuni di tumore maligno ed è caratterizzato da elevata malignità, rapida progressione, elevata morbilità e mortalità. È stato riportato che l'oxaliplatino (OXA) ha una marcata efficacia contro il cancro del fegato avanzato con tossicità tollerabile. Nei tumori solidi, il microambiente ipossico promuove la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT), che può anche indurre la farmacoresistenza del cancro del fegato ai farmaci platino. Herba Cistanche (Cistanche tubulosa) è stata usata frequentemente nella medicina tradizionale cinese e i glicosidi feniletanolo da Herba Cistanche (CPhGs) sono i principali componenti attivi. Il presente studio mirava a studiare gli effetti dei CPhG sulla vitalità, l'apoptosi, la migrazione e l'invasione delle cellule di cancro al fegato. Le cellule di cancro al fegato HepG2 sono state divise nei gruppi di controllo, DMSO, CoCl2, OXA, OXA più CoCl2 e CPhG più OXA più CoCl2. Successivamente, sono state eseguite la PCR quantitativa della trascrizione inversa e l'analisi western blot per determinare i livelli di espressione del fattore 1 inducibile dall'ipossia (HIF-1 ), della lisil ossidasi-like 2 (LOXL2) e dei geni e delle proteine ​​​​correlati all'EMT (cioè, E ‑caderina e Twist), al fine di studiare gli effetti dei CPhG sul cancro del fegato. I risultati hanno dimostrato che i CPhG potrebbero aumentare gli effetti dell'OXA sul cancro al fegato e inibire la migrazione, l'invasione e il tasso di apoptosi delle cellule tumorali del fegato. Inoltre, il trattamento con CPhG ha indotto efficacemente una sottoregolazione di HIF‑1, LOXL2 e Twist e una sovraregolazione di E‑caderina. I risultati attuali hanno indicato che i CPhG hanno innescato un aumento significativo della sensibilità all'OXA e la soppressione dell'EMT indotta dall'ipossia nel cancro del fegato inibendo la via di segnalazione HIF-1. Pertanto, i CPhG possono essere considerati un efficace sensibilizzante dei farmaci al platino, che potrebbe migliorare l'efficacia chemioterapica nei pazienti con cancro al fegato.

sistanoPotevomigliorare l'efficacia chemioterapicanei pazienti con cancro al fegato.

introduzione

Liver cancer is a malignant tumor that usually involves the digestive system, and consists of primary and secondary types. Primary liver cancer is divided into hepatocellular carcinoma and intrahepatic cholangiocarcinoma (1,2). Notably, liver cancer is associated with a high incidence and mortality rate worldwide (3). According to the World Health Organization, it is predicted that there will be >1,000,{2}} decessi correlati al cancro al fegato entro il 2030 e dei casi confermati di recente, quelli nella Cina continentale rappresenteranno il 46,6%.

È stato riportato che l'oxaliplatino (OXA) esercita effetti inibitori sulla crescita del cancro del fegato con tossicità tollerabile in ambito clinico. Tuttavia, l'efficienza complessiva della terapia farmacologica a base di platino è ostacolata dalla resistenza delle cellule tumorali (4). È ben noto che il cancro del fegato mostra una minore sensibilità alla chemioterapia rispetto ad altri tipi di cancro. La resistenza multifarmaco del cancro del fegato ha contribuito alla sua resistenza a numerosi agenti terapeutici (5). In uno studio precedente, Xie e Zhong (6) hanno riportato che le cellule HepG2 mostravano una scarsa sensibilità all'adriamicina, al 5‑fluorouracile e al cisplatino in condizioni ipossiche. Nonostante il fatto che gli agenti chemioterapici a base di platino siano le principali opzioni di trattamento per il cancro, la resistenza a questi farmaci esiste tra i pazienti. Inoltre, la prognosi dei pazienti con cancro al fegato rimane infausta (7,8). Ad oggi, sono stati compiuti ampi sforzi per studiare la resistenza ai farmaci e per migliorare la sensibilità ai farmaci nei pazienti con cancro al fegato.

In condizioni ipossiche, la rivascolarizzazione si verifica nelle cellule tumorali, che può portare alla transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e al mimetismo vascolare (VM). EMT e VM possono successivamente promuovere l'invasione e metastasi a distanza. Inoltre, è stato ipotizzato che l'EMT svolga un ruolo come forza trainante per la progressione del cancro (9). Inoltre, i fattori inducibili dall'ipossia (HIF) sono coinvolti nella formazione di neovasi, nel metabolismo energetico, nella proliferazione cellulare, nell'invasione e nella metastasi (10).

La proteina simile alla lisil ossidasi (LOX) 2 (LOXL2) è un membro della famiglia LOX ed è strettamente correlata alla reticolazione covalente di collagene ed elastina, che può provocare fibrosi ed è fondamentale per l'integrità della matrice extracellulare ( 11). In uno studio precedente, LOXL2 era considerato strettamente correlato alla metastasi delle cellule tumorali (12). Inoltre, LOXL2 ha dimostrato di modulare la patogenesi e la progressione di numerosi tipi di cancro maligno attraverso vie extra e intracellulari, che erano indici importanti per la valutazione della prognosi sfavorevole (13,14).

Herba Cistanche è un'erba tonica comunemente distribuita nelle regioni desertiche, che è stata usata frequentemente nella medicina tradizionale cinese (15,16). Cistanche tubulosa (C. tubulosa) è una medicina erboristica naturale comunemente piantata nella regione autonoma dello Xinjiang. I glicosidi del feniletanolo di Herba Cistanche (CPhGs) sono uno dei principali componenti attivi di Herba Cistanche. In precedenza, Hu et al (17) hanno indicato che i CPhG potrebbero attenuare il danno epatico nei topi portatori di tumore H22 e inibire la crescita delle cellule tumorali. È stato suggerito che il meccanismo sottostante potrebbe essere correlato a una riduzione della ‑fetoproteina sierica e potrebbe aumentare l'immunità nei topi.

Nel presente studio, un modello ipossico di cellule di cancro al fegato HepG2 è stato indotto utilizzando CoCl2. Su questa base, il presente studio mirava a studiare gli effetti di OXA sulla proliferazione, apoptosi, migrazione e invasione delle cellule tumorali in presenza di CPhG in condizioni ipossiche. Inoltre, sono stati rilevati i livelli di mRNA e di espressione proteica di HIF‑1, LOXL2, E‑caderina e Twist. Inoltre, sono stati studiati i meccanismi esatti alla base degli effetti dei CPhG sulla patogenesi del cancro al fegato.

Materiali e metodi

Linea cellulare.

La linea cellulare di cancro al fegato HepG2, identificata utilizzando il metodo STR, è stata fornita dall'istituto di ricerca clinica, primo ospedale affiliato della Xinjiang Medical University (Urumqi, Cina). Le cellule sono state coltivate in DMEM ad alto contenuto di glucosio (HyClone; Cytiva) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS; Hyclone; Cytiva) a 37˚C in un'incubatrice contenente il 5% di CO2.

Preparazione di CPhG.

C. tubulosa extraction (CPhGs) was obtained from Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. The content of CPhGs was >80 per cento, tra cui il contenuto di echinacoside e verbascose era rispettivamente del 44,5 e del 16,1 per cento. I gambi di C. tubulosa (Schrenk) Wight sono stati raccolti nell'ottobre 2016 dallo Xinjiang, in Cina. La pianta è stata identificata dal dottor Junping Hu. Tutti questi campioni di voucher (n. 201610) sono stati depositati presso il Plant Herbarium, School of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Xinjiang, Cina.

costaestrattodaHetian Dichen Biotech Co., Ltd.

Design sperimentale.

Le cellule HepG2 (5x104/ml) sono state trattate con varie concentrazioni di CPhG (5, 25, 50, 100, 200 e 500 µg/ml) per 48 ore a 37˚C (24 ore dopo la semina) per screening della dose di CPhGs‑L/M/H. Le cellule HepG2 (5x104/ml) sono state suddivise nei seguenti gruppi: i) gruppo di controllo, coltivato in DMEM ad alto contenuto di glucosio; ii) gruppo DMSO, coltivato in 0,1% DMSO (v/v); iii) gruppo CoCl2 (gruppo modello ipossia), coltivato in DMEM privo di siero contenente 100 µM di CoCl2; iv) gruppo OXA (gruppo di controllo positivo), coltivato in OXA 5 µM (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.); v) gruppo OXA più CoCl2, coltivato in 5 µM OXA combinato con 100 µM CoCl2; e vi) gruppi CPhGs, trattati con CPhGs‑L/M/H (25, 50 e 100 µg/ml, rispettivamente) combinati con 5 µM OXA e 100 µM CoCl2.

Test di vitalità cellulare.

La vitalità cellulare è stata determinata utilizzando un test Cell Counting Kit‑8 (CCK‑8) secondo le istruzioni del produttore (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) e come descritto in precedenza (18). Le cellule (2.{4}}x103 cellule/pozzetto) sono state seminate in piastre da 96 pozzetti. Successivamente, circa 24 ore dopo la semina, le cellule sono state trattate per 48 ore in base alle condizioni di trattamento in ciascun gruppo. Il mezzo è stato quindi sostituito con 100 µl di DMEM ad alto contenuto di glucosio, seguito dall'aggiunta di 10 µl di reagente CCK‑8; le cellule sono state incubate per 1 ora a 37˚C. La densità ottica è stata misurata utilizzando un lettore di micropiastre a rilevamento multiplo (Thermo Fisher Scientific, Inc.) a 450 nm. Sono stati preparati sei replicati per ciascuna condizione.

Determinazione del tasso apoptotico.

Il tasso apoptotico è stato determinato utilizzando un kit di rilevamento apoptotico di annessina V/PI (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.). Le cellule HepG2 (5x105) sono state inoculate in piastre da 6 pozzetti a 37˚C con il 5% di CO2. Successivamente, circa 24 ore dopo il trattamento, le cellule sono state coltivate in DMEM privo di siero per 4 ore. Le cellule sono state quindi digerite utilizzando lo 0,25% di tripsinizzazione (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), seguito da almeno tre lavaggi con PBS preraffreddato. Dopo centrifugazione a 167,7 xg per 5 minuti a 4˚C, le cellule sono state risospese con tampone legante 1X e la concentrazione è stata regolata a 1~5x106/ml, quindi colorate con 5 µl di annessina V‑FITC e 5 µl di PI per 15 minuti a temperatura ambiente. Le cellule sono state quindi sottoposte a citometria a flusso utilizzando un citometro a flusso BD LSRFortessa (BD Biosciences) e il software FlowJo 10.6.2 (Tree Star, Inc.).

Tabella I. Sequenze di primer

Saggio di guarigione delle ferite.

Gli effetti inibitori dei CPhG sulla migrazione cellulare sono stati esaminati mediante un test di guarigione delle ferite (19). Le cellule sono state seminate in piastre da 6 pozzetti fino a ottenere un monostrato confluente dell'100 percento. Successivamente, le cellule sono state ferite utilizzando un puntale di pipetta da 200 µl, lavate con PBS e incubate con trattamenti in un mezzo privo di siero. Dopo il trattamento farmacologico, la velocità di guarigione della ferita è stata misurata rispettivamente a 0, 12, 24 e 48 h. Le immagini della ferita sono state ottenute utilizzando un microscopio a fluorescenza (Nikon Ti‑S, Giappone) con un ingrandimento di x10. La chiusura della ferita è stata misurata dalla distanza della ferita in ciascun periodo ed espressa come percentuale della distanza iniziale della ferita a 0 h.

Saggi di Transwell.

L'invasione cellulare è stata valutata mediante saggi Transwell. Le cellule (1x105 cellule/ml) sono state sospese in 200 µl di DMEM ad alto contenuto di glucosio senza FBS. Le cellule sono state quindi seminate su pozzetti superiori rivestiti con Matrigel ricoperti da una membrana filtrante in polietilene tereftalato (dimensione dei pori, 8,0 µm). Un totale di 500 µl di DMEM ad alto contenuto di glucosio contenente il 10 percento di FBS è stato collocato nella camera inferiore. Sono stati utilizzati tamponi di cotone per rimuovere le cellule sulla superficie superiore del filtro dopo 48 ore a 37°C. Le cellule che hanno invaso la membrana sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 30 minuti. Successivamente, le cellule sono state colorate con cristalvioletto allo 0,1% per 15 minuti a temperatura ambiente. Le cellule invadenti sono state osservate al microscopio a fluorescenza (Nikon Ti‑S) con un ingrandimento di x100.

Figura 1. Effetti di diverse concentrazioni di CPhG sulla vitalità cellulare HepG2 dopo 48 h.

PCR quantitativa a trascrizione inversa (RT‑qPCR).

L'RNA totale è stato estratto dalle cellule HepG2 utilizzando il reagente TRIzol® (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) e la sintesi del cDNA è stata eseguita utilizzando il kit di reagenti PrimeScript RT (Takara Bio, Inc.) secondo il protocollo del produttore. La qPCR è stata eseguita su un sistema 7500 Real-Time PCR (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.) utilizzando TB green™ Premix Ex Taq™ (Takara Bio, Inc.) secondo il protocollo del produttore. I primer utilizzati per qPCR sono elencati nella Tabella I. Le condizioni di PCR consistevano in denaturazione a 95˚C per 30 secondi, seguita da 40 cicli di denaturazione a 95˚C per 5 secondi e ricottura a 60˚C per 30 secondi. Infine, i risultati dell'amplificazione sono stati analizzati utilizzando il metodo 2‑ΔΔCq (20).

Analisi Western blot.

Le proteine ​​sono state estratte dalle cellule trattate per 48 ore mediante omogeneizzazione in tampone di lisi RIPA (Thermo Fisher Scientific, Inc.) contenente inibitori della proteasi e della fosfatasi. Il contenuto proteico cellulare è stato determinato utilizzando il metodo BCA. Le proteine ​​(40 µg) sono state quindi separate mediante SDS‑PAGE su un gel al 10% e trasferite su una membrana PVDF. La membrana è stata bloccata in latte scremato al 5% per 1 ora a 4˚C e incubata con i seguenti anticorpi primari: ‑actina (1:5,{8}}; cat. n. bs‑0061R; BIOSS), HIF ‑1 (1:1,000; cat. n. ab179483; Abcam), LOXL2 (1:500; cat. n. ab179810; Abcam), E-caderina (1:1,000 ; cat. n. bs‑10009R; BIOSS) e Twist1 (1:500; cat. n. bs‑2441R; BIOSS) durante la notte a 4˚C. La membrana è stata quindi incubata con anticorpi secondari IgG H&L di capra anti-coniglio (1:2.000; cat. n. ab205718; Abcam) per 4 ore a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con TBS‑0,05% Tween‑20, le macchie sono state visualizzate utilizzando il sistema di chemiluminescenza potenziata (Amersham; Cytiva). L'intensità relativa delle bande è stata semiquantificata mediante analisi densitometrica utilizzando il software ImageJ2x (versione 2.1.4.7; Rawak Software Inc.) e i grafici densitometrici dei risultati sono stati normalizzati all'intensità di ‑actina.

Figura 2. Effetti dei CPhG combinati con OXA sulla vitalità delle cellule HepG2 a 48 h.

Analisi statistica.

Il software SPSS 19.0 (SPSS, Inc.) è stato utilizzato per l'analisi dei dati. I dati sono presentati come media ± deviazione standard e sono stati analizzati mediante ANOVA unidirezionale seguito dal test post hoc di Tukey. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="" difference.="" all="" experiments="" were="" performed="" at="" least="" in="">

Risultati

Effetti dei CPhG sulla vitalità cellulare.

Le cellule HepG2 sono state trattate con varie concentrazioni di CPhG (5, 25, 50, 100, 200 e 500 µ g/ml) per 48 ore (24 ore dopo la semina). Come mostrato in Fig. 1, si è verificato un calo significativo della vitalità delle cellule trattate con CPhG da 200 e 500 µg/ml rispetto a quella del gruppo di controllo (P<0.05). these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" could="" modulate="" cell="" viability="" in="" a="" dose‑dependent="">

I CPhG potenziano gli effetti di OXA sul cancro al fegato.

Successivamente sono stati valutati gli effetti dei CPhG sulla vitalità cellulare HepG2 modulata con OXA (Fig. 2). Dopo circa 48 ore, la combinazione di CPhG e OXA ha ridotto significativamente la vitalità delle cellule HepG2 rispetto a quella del gruppo OXA più CoCl2. In particolare, CPhGs‑M più OXA più CoCl2 e CPhGs‑H più OXA più CoCl2 hanno inibito significativamente la vitalità delle cellule HepG2 rispetto al gruppo OXA più CoCl2 (P<0.05 and=""><0.01,>

Figura 3. Effetti inibitori dei CPhG combinati con OXA sulla migrazione e l'invasione delle cellule HepG2 a 48 h.

I CPhG inibiscono la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali del fegato.

Per studiare ulteriormente il potenziale invasivo e la capacità migratoria delle cellule tumorali del fegato dopo il trattamento con CPhG e OXA, sono stati eseguiti saggi di guarigione delle ferite e Transwell. Il test di guarigione della ferita ha indicato che, rispetto a quello del gruppo DMSO, la migrazione delle cellule HepG2 era ridotta dopo il trattamento con CoCl2, OXA e CPhG (200 o 500 µg/ml) (P<0.05; fig.="" 3a="" and="" b).="" for="" the="" transwell="" assay,="" the="" invasive="" ability="" of="" cells="" was="" markedly="" inhibited="" in="" the="" co-treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2)="" compared="" with="" that="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 3c="" and="" d).="" conversely,="" in="" the="" co‑treatment="" groups="" (cphgs="" +="" oxa="" +="" cocl2),="" the="" invasive="" potential="" and="" migratory="" ability="" of="" cells="" were="" markedly="">

Effetti di CPhG e OXA sull'apoptosi.

Dopo il trattamento con la combinazione di CPhG e OXA per 48 ore, le cellule HepG2 sono state colorate con annessina V‑FITC e PI, seguite da citometria a flusso per determinare l'apoptosi cellulare. Come mostrato in Fig. 4A, i gruppi di co-trattamento (CPhGs‑L/M/H più OXA più CoCl2) hanno mostrato un aumento graduale della proporzione di cellule apoptotiche con l'aumento della concentrazione di CPhG. La maggior parte delle cellule trattate con CPhG e OXA erano localizzate nella regione Q4, il che indicava che la combinazione di CPhG e OXA induceva l'apoptosi nella fase iniziale. Rispetto al gruppo OXA più CoCl2, è stato rilevato un aumento significativo del tasso apoptotico delle cellule nei gruppi trattati con OXA, CoCl2 e dosi moderate o elevate di CPhG (P<0.01; fig.="" 4b).="" these="" findings="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" oxa="" and="" cphgs="" may="" contribute="" to="" the="" apoptosis="" of="" hepg2="">

Livelli di espressione dell'mRNA di HIF‑1, LOXL2, E‑caderina e Twist in seguito alla co-incubazione di CPhG e OXA.

There were no statistical differences in the mRNA expression levels of HIF‑1α, LOXL2, E‑cadherin and Twist between the control and DMSO groups (P>0.05; Fig. 5A-D). Al contrario, CoCl2 ha indotto un aumento significativo dei livelli di espressione di mRNA di LOXL2, HIF-1 e Twist rispetto a quelli del gruppo DMSO (P<0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group,="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" loxl2,="" hif‑1α="" and="" twist="" were="" significantly="" enhanced="" in="" the="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups=""><0.01; fig.="" 5a,="" b="" and="" d).="" by="" contrast,="" cocl2="" induced="" a="" significant="" downregulation="" in="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" dmso="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" all="" concentrations="" of="" cphgs="" combined="" with="" oxa="" and="" cocl2="" were="" able="" to="" upregulate="" the="" mrna="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 5c).="" these="" results="" indicated="" that="" the="" combination="" of="" cphgs="" and="" oxa="" effectively="" inhibited="" the="" emt="" under="" hypoxic="">

Figura 4. Effetto dei CPhG combinati con OXA sulla percentuale di cellule HepG2 apoptotiche a 48 ore, come determinato dalla doppia colorazione dell'annessina-V/PI.

Livelli di espressione proteica di HIF‑1 , LOXL2, E‑caderina e Twist dopo la co-incubazione di CPhG e OXA. I risultati del western blotting hanno rivelato che i livelli di espressione proteica di HIF-1, LOXL2 e Twist erano sovraregolati in condizioni ipossiche rispetto a quelli del gruppo DMSO. Al contrario, i livelli di espressione proteica della E-caderina erano sottoregolati in condizioni ipossiche (P<0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" notably,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" were="" significantly="" decreased="" in="" the="" cphgs‑m="" +="" oxa="" +="" cocl2="" or="" cphgs‑h="" +="" oxa="" +="" cocl2="" groups="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6a="" and="" b).="" compared="" with="" the="" dmso="" group,="" the="" cocl2="" treatment="" significantly="" decreased="" the="" expression="" level="" of="" e‑cadherin.="" in="" the="" cphgs="" groups,="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" e‑cadherin="" were="" significantly="" increased="" compared="" with="" those="" in="" the="" oxa="" +="" cocl2="" group=""><0.01; fig.="" 6b).="" these="" findings="" indicated="" that="" cphgs="" treatment="" could="" effectively="" inhibit="" the="" downregulation="" of="" e‑cadherin,="" and="" the="" upregulation="" of="" hif‑1α,="" loxl2,="" and="" twist="" induced="" by="">

le cistanze riducono il colesterolo

Discussione

L'ipossia è una caratteristica comune nel microambiente del cancro; ciò è principalmente associato al fatto che la proliferazione delle cellule tumorali è più rapida rispetto alla formazione vascolare di neovasi aberranti. Inoltre, altri processi biologici, tra cui proliferazione, metastasi e sensibilità ai farmaci, sono influenzati dall'ipossia (21). Il microambiente ipossico tumorale è cruciale per la patogenesi e la progressione del cancro, ed è anche importante nella resistenza ai farmaci e nella vascolarizzazione del cancro del fegato (22).

Nel presente studio, le cellule HepG2 sono state trattate con varie concentrazioni di CPhG, tra cui i CPhG (200 µg/ml) potrebbero indurre significativamente una diminuzione della vitalità cellulare. In particolare, i CPhG potrebbero modulare la vitalità cellulare in modo dose-dipendente. In condizioni ipossiche, la combinazione di OXA e CPhG (50 o 100 µg/ml) ha inibito significativamente la vitalità delle cellule HepG2 rispetto al solo trattamento con OXA. Una tendenza dose-dipendente simile è stata osservata nei test di migrazione e invasione delle cellule tumorali del fegato. Attualmente sono stati condotti studi approfonditi per indagare i ruoli dell'apoptosi delle cellule tumorali nella patogenesi delle malattie del fegato (23-26). Diverse strategie sono state sviluppate per il trattamento del cancro del fegato promuovendo l'apoptosi (27-29); pertanto, l'interferenza nell'apoptosi delle cellule HepG2 può servire come candidato promettente per la prevenzione e il trattamento del cancro al fegato. L'apoptosi delle cellule HepG2 è stata significativamente migliorata dopo il trattamento con la combinazione di CPhGs‑M/‑H e OXA rispetto a quella delle cellule trattate con OXA da solo. Pertanto, è stato indicato che i CPhG potrebbero aumentare significativamente gli effetti antitumorali di OXA.

HIF‑1 può sovraregolare i livelli di espressione di E‑caderina, N‑caderina e Vimentina, nonché di alcuni fattori di trascrizione, come Snail1/2, Zeb1 e Twist1. Successivamente, ciò potrebbe portare a una perdita di polarità cellulare, allentamento delle giunzioni cellula-cellula, alterazioni della proteina citoscheletrica e la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali, che potrebbero comportare la traslocazione delle cellule tumorali nel sistema circolatorio attraverso la membrana basilare e successive metastasi (30). Nel presente studio, CoCl2 è stato utilizzato per indurre un modello di ipossia, che ha innescato un aumento della vitalità delle cellule HepG2, nonché la migrazione e l'invasione cellulare. Inoltre, i livelli di espressione di mRNA e proteine ​​di HIF-1 sono stati significativamente aumentati, indicando che CoCl2 ha indotto la generazione di un microambiente ipossico. Il trattamento con la combinazione di CPhG e OXA ha notevolmente inibito i livelli di espressione di mRNA e proteine ​​di HIF-1 indotti dall'ipossia. Questi risultati hanno suggerito che i CPhG potrebbero attenuare il microambiente del cancro del fegato in modo dose-dipendente.

La caderina elettronica è una molecola di adesione Ca2 plus-dipendente, che ha un ruolo chiave nell'adesione cellula-cellula, nel mantenimento dell'integrità della struttura dei tessuti e nella trasmissione del segnale. In caso di downregulation o addirittura di perdita della funzione di adesione, le cellule tumorali possono mostrare proliferazione e dedifferenziazione incontrollate, che possono promuovere una maggiore invasione delle cellule tumorali e la successiva metastasi(31). Inoltre, la E-caderina è fondamentale per inibire l'EMT delle cellule tumorali, che è strettamente associata alla differenziazione, all'invasione, alla metastasi e alla prognosi di più neoplasie epiteliali. I fattori di trascrizione che inducono EMT (EMT-TF), come Twist, Snail e Zeb, sono fondamentali per l'EMT. È stato segnalato che l'ipossia attiva vie di segnalazione che inducono l'espressione di EMT‑TF; in particolare, potrebbe promuovere direttamente l'EMT attraverso l'attivazione trascrizionale di questi fattori (32). La torsione è un fattore di trascrizione elica-anello-elica altamente conservato che è stato recentemente identificato. L'espressione di High Twist è stata rilevata in numerosi tipi di cellule tumorali(33). Pertanto, è essenziale studiare l'associazione tra l'espressione di Twist e la migrazione o metastasi delle cellule tumorali, nonché la prevenzione clinica e il trattamento delle metastasi(34). Nel presente studio, è stato rivelato che i livelli di espressione di mRNA e proteine ​​di E-caderina erano sottoregolati in presenza di ipossia, mentre i livelli di espressione di mRNA e proteine ​​di Twist erano elevati. Questi risultati erano coerenti con i risultati dei test di invasione e migrazione, che implicavano che l'ipossia può contribuire al verificarsi di EMT. Dopo il trattamento con OXA, i livelli di espressione proteica della E-caderina sono stati sottoregolati; ciò indicava che l'OXA mostrava una scarsa efficienza nell'inibire la crescita delle cellule tumorali del fegato, mentre poteva promuovere l'EMT. Tuttavia, in combinazione con CPhG, la sensibilità delle cellule HepG2 all'OXA ha mostrato un netto miglioramento in presenza di ipossia. Inoltre, il cotrattamento con CPhG e OXA potrebbe inibire la vitalità cellulare, la migrazione e l'invasione delle cellule HepG2. Il presente studio ha rilevato solo l'espressione di Twist ed E-caderina; pertanto, gli studi futuri mirano a concentrarsi su più marcatori correlati all'EMT, al fine di valutare l'effetto inibitorio dei CPhG sull'EMT indotto dall'ipossia nel cancro del fegato.

È stato riportato che HIF‑1 promuove l'espressione di LOXL2 e migliora la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali epatiche, che possono essere strettamente correlate alla prognosi infausta del cancro del fegato (30). In uno studio precedente, i livelli di espressione di LOXL2 nei tessuti adiacenti del cancro del fegato erano notevolmente aumentati rispetto a quelli nei tessuti tumorali (35). Inoltre, era strettamente correlato all'invasione e alla metastasi del cancro al fegato. Il silenziamento del gene LOXL2 da parte di piccoli RNA interferenti ha inibito la proliferazione delle cellule HepG2 e SMCC‑7721, provocando l'arresto del ciclo cellulare delle cellule tumorali e un aumento dell'apoptosi (36). Shao et al (35) hanno studiato la correlazione tra LOXL2 in campioni di cancro al fegato, fattori clinicopatologici, VM e prognosi tra 201 casi che hanno ricevuto un intervento chirurgico per il trattamento. È stato ipotizzato che LOXL2 abbia svolto ruoli importanti nella patogenesi e nella progressione del cancro al fegato, che può fungere da bersaglio per lo sviluppo di farmaci. Inoltre, Peng et al (37) hanno dimostrato che LOXL2 potrebbe attivare le vie di segnalazione Snail/E-caderina e chinasi Src/chinasi di adesione focale, che possono contribuire alla patogenesi e alla progressione dell'EMT delle cellule di cancro gastrico. Nel presente studio, in condizioni ipossiche, i livelli di espressione di mRNA e proteine ​​di LOXL2 sono stati aumentati, mentre la sua espressione è stata sottoregolata dopo il trattamento con OXA. Inoltre, il trattamento con una combinazione di CPhG e OXA ha portato a un'evidente downregulation dell'espressione di LOXL2, che può aiutare efficacemente gli effetti antitumorali di OXA sul cancro al fegato.

costaeffettivamentecoadiuva gli effetti antitumoralidiOXA sul cancro al fegato.

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Ci sono alcune limitazioni al presente studio. Il presente studio avrebbe dovuto utilizzare altre due linee cellulari di cancro al fegato, inclusa la linea cellulare SMCC‑7721, ma non è stato possibile utilizzarle poiché non era possibile acquistare queste linee cellulari perché identificate erroneamente e derivavano da cellule HeLa. Inoltre, il presente studio non ha analizzato gli effetti antiossidanti di diverse concentrazioni di CPhG nelle cellule.

In conclusione, i CPhG potrebbero alternare il microambiente tumorale ipossico delle cellule tumorali del fegato modulando la via di segnalazione HIF-1. Inoltre, la sensibilità delle cellule tumorali del fegato all'OXA era significativamente elevata in risposta al trattamento con una combinazione di CPhG e OXA. Questi risultati possono fornire una nuova strategia di trattamento per migliorare la sensibilità del cancro del fegato alla chemioterapia.