Proprietà fotoprotettive e anti-melanogeniche di diversi estratti di Kadsura Coccinea

Contatto:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

La radiazione solare ultravioletta (UV), caratterizzata da UVA (320–400 nm), UVB (280–320 nm) e UVC (100–280 nm), è il fattore ambientale più critico che causa il cancro della pelle e il fotoinvecchiamento derivante da citotossicità e genotossicità , e fototossicità. In particolare, le radiazioni UVA e UVB rappresentano rispettivamente oltre il 95% e il 3% dell'irradiazione UV giornaliera [8]. L'irradiazione UVA e UVB può indurre specie reattive dell'ossigeno (ROS) indirettamente o direttamente penetrando negli strati epidermici e/o dermici della pelle, provocando danno ossidativo e morte cellulare. Negli ultimi decenni, le radiazioni UV sono diventate un serio problema per la salute della pelle e si stanno ancora diffondendo pericolosamente in tutto il mondo [9-11]. L'irradiazione UV è uno stimolante diretto e costante dei cheratinociti, che rappresentano circa il 95% della massa cellulare dell'epidermide della pelle. I cheratinociti agiscono come la prima barriera contro i rischi microbici, chimici e fisici e aiutano a difendersi dai raggi UVA e UVB. Quando i cheratinociti sono esposti a UVA e UVB, vengono generati ROS intracellulari, innescando così l'apoptosi [12-14].

I melanociti sono responsabili della produzione e quantità dei pigmenti melanici, che sono attori importanti nella difesa biologica dell'epidermide cutanea; la loro disregolazione può causare iperpigmentazione o disturbi dell'ipopigmentazione [15,16]. I melanociti sono distribuiti nello strato basale dell'epidermide cutanea, che è anche influenzato dall'esposizione alla luce solare, dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS) e dagli ormoni stimolanti i melanociti (-MSH) [17,18]. La tirosinasi, un membro della famiglia delle proteine ​​del rame di tipo{7}}, è una metalloproteina evolutivamente conservata che svolge un ruolo cruciale nella melanogenesi e nelle attività della monofenolo monossigenasi, delle catecolasi e dei difenoli. La downregulation della tirosinasi, della proteina correlata alla tirosinasi-1 (TRP-1) e della proteina correlata alla tirosinasi-2 (TRP-2) ha effetti catalitici distinti. Il TRP-1 è un'ossidasi dell'acido 5,6-diidrossiindolo-2-carbossilico e il TRP-2 è una tautomerasi DOPAcromo [19,20]. Inoltre, il fattore di trascrizione correlato alla mioftalmosi (MITF) e la proteina legante gli elementi responsivi al cAMP (CREB) sono fattori di trascrizione che regolano principalmente la melanogenesi e codificano le informazioni sulla modalità e l'intensità della stimolazione [17,21]. Numerosi studi hanno affermato che i percorsi MITF e CREB regolano la melanogenesi. MITF è un fattore chiave nella trascrizione degli enzimi correlati alla melanogenesi e il regolatore centrale della melanogenesi. -MSH porta all'espressione di MITF attraverso un meccanismo di segnalazione che coinvolge la proteina legante cAMP-correlata (CREB). Quindi, MITF entra nel nucleo con la sequenza M-box (AGTCATGTGCT) per promuovere la trascrizione di geni ed enzimi melanogenici specifici. È anche noto che il CREB fosforilato è stimolato da -MSH, che si lega all'elemento di consenso CRE nel promotore di Mitf per sovraregolare la trascrizione di Mitf [21–24].

In questo studio, gli estratti di radice KC (KCR), gambo (KCS), foglia (KCL) e frutta (KCF) sono stati confrontati in modo completo e sono state eseguite valutazioni multiple delle loro proprietà fotoprotettive e anti-melanogeniche.

2. Materiali e metodi

2.1. Preparazione di estratti di KC

Una pianta KC 15 di tre anni è stata coltivata in un vaso di plastica da 9 litri nel campus di Miryang della Pusan ​​National University. KC è stato identificato dal professor Young Whan Choi, l'autore di questo studio. Questi campioni sono stati depositati come campioni di voucher (numero di adesione KC-PDRL-1) presso l'erbario del Dipartimento di bioscienze orticole, College of Natural Resources and Life Science, Pusan ​​National University. Le piante sono state sufficientemente annaffiate utilizzando una soluzione nutritiva completa con un livello di conducibilità di 1.0 mS·cm−1 e contenente i seguenti elementi (in me·L−1): NO3-N, 16; NH4-N, 1,34; P, 4; K, 8; Ca, 8; e S, 4. L'abito KC nel porto è stato raccolto a dicembre 2020 classificando radici, steli, foglie e frutti (Figura 1A). I campioni raccolti sono stati immediatamente liofilizzati in un liofilizzatore e conservati in sacchetti di vinile a 20 ◦C fino all'analisi. Le radici essiccate, i gambi, le foglie e i frutti di KC (20 g) sono stati macinati fino a ottenere una polvere fine ed estratti a temperatura ambiente con alcol etilico. In breve, la filtrazione e l'evaporazione degli estratti EtOH di KC sono state eseguite a pressione ridotta a 45 ◦C seguite da liofilizzazione. Infine, l'estratto solido (50 mg/mL) è stato sciolto in dimetilsolfossido (DMSO) per ulteriori esperimenti.

cistanceerba epimedium sagittatumestratto

2.2. Contenuto totale di polifenolici e flavonoidi degli estratti di KC

Come descritto in precedenza [25], il contenuto totale di polifenolici e flavonoidi degli estratti di radice, stelo, foglia e frutta di KC è stato misurato utilizzando i metodi colorimetrici Folin-Ciocalteu (polifenolo totale) e cloruro di alluminio (flavonoide). L'assorbanza è stata misurata a 700 nm (polifenoli totali) utilizzando Ultrospec 6300 Pro (GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, Regno Unito) ea 510 nm (flavonoidi) utilizzando il VICTOR Multilabel Plate Reader (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA). .

Le curve standard sono state costruite utilizzando acido gallico (polifenolo totale) e quercetina (flavonoide) come standard e i risultati sono stati espressi come equivalenti di acido gallico per grammo (GAE/g) di KC estratti di radici, steli, foglie e frutti e equivalenti di quercetina per grammo (QE/g) rispettivamente di estratti di radice, gambo, foglia e frutto di KC.

2.3. Saggio DPPH e ABTS

Le attività di scavenging dei radicali DPPH e ABTS di estratti di radici, steli, foglie e frutti di KC ({0}}.5 mg/mL) sono state misurate secondo un metodo precedentemente descritto [25] con lievi modifiche. Gli estratti di radice, stelo, foglia e frutto di KC (0,5 mg/mL) sono stati miscelati con una soluzione di DPPH (60 µM) in micropiastre. Dopo che i campioni sono stati agitati vigorosamente, sono stati tenuti al buio a 25 ◦C per 0,5 h. Soluzioni madre di 7 mM ABTS e 2,6 persolfato di potassio sono state preparate in acqua distillata a temperatura ambiente al buio per 18 ore. Estratti di radice, stelo, foglia e frutta (0,5 mg/mL) KC sono stati miscelati con la soluzione di lavoro e quindi lasciati riposare per 0,5 ore a temperatura ambiente al buio. L'assorbanza delle miscele campione è stata monitorata a 510 nm (DPPH) o 734 nm (ABTS).

2.4. Coltura cellulare

I cheratinociti aderiti (HaCaT) e i melanociti aderiti (B16F10) sono stati inoculati in una soluzione di coltura DMEM (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) contenente il 10% di FBS (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) e l'1% di penicillina/streptomicina (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) e coltivate a 37 ◦C con il 5% di CO2. La crescita delle cellule HaCaT e B16F10 aderite è stata osservata regolarmente e il mezzo è stato cambiato ogni due o tre giorni. Le cellule della fase di crescita logaritmica sono state utilizzate per esperimenti successivi.

2.5. Irraggiamento UVA e UVB

I cheratinociti sono stati esposti all'irradiazione UVA o UVB (Bio-Link BLX-365, Villber-Lourmat, Eberhardzell, Germania) con tubi 5 8 W che emettono la maggior parte della loro energia a un picco di emissione a 365 nm ( UVA) o 312 nm (UVB). Le dosi di irradiazione UVA erano 20 J/cm2 e le dosi di irradiazione UVB erano 50 mJ/cm2.

2.6. Misurazione della vitalità cellulare e della citotossicità mediante analisi CCK-8 e LDH

Per l'analisi della vitalità cellulare, ai cheratinociti HaCaT è stata aggiunta la soluzione del kit per il conteggio cellulare-8 (CCK-8) del kit del test CCK-8 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e sospensioni cellulari di melanoma B16F10 secondo le istruzioni del produttore e incubate a 37 ◦C per 4 h. In breve, le cellule 2 104 sono state seminate in ciascun pozzetto di una piastra a pozzetti 24- e incubate con il 5% di CO a 37 ◦C per 24 ore. In breve, 2 104 cellule sono state seminate in ciascun pozzetto di una 24-piastra a pozzetti e incubate con il 5% di CO a 37 ◦C per 24 ore. Dopo 24 h di incubazione, a ciascun pozzetto è stato aggiunto il reagente CCK-8 e le cellule sono state ulteriormente incubate per 4 h. Un kit di rilevamento della citotossicità (Roche Applied Science, Svizzera) è stato utilizzato per determinare il rilascio extracellulare di lattato deidrogenasi (LDH) nel mezzo di coltura di cheratinociti HaCaT. L'assorbanza è stata analizzata a 450 nm (CCK-8) e 490 nm (LDH) utilizzando un lettore di piastre multietichetta VICTOR.

2.7. Valutazione della produzione intracellulare di ROS nei cheratinociti

I livelli intracellulari di ROS sono stati analizzati utilizzando {{0}}(e-6)-clorometil-2′,7′-dicloruro-idrofluoresceina diacetato acetil estere (CM-H2DCFDA; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Tutte le procedure sono state eseguite secondo le istruzioni del produttore. In breve, dopo il trattamento con KC di altri estratti parziali (0.5 mg/mL), i cheratinociti (HaCaT) sono stati lavati con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e incubati con CM-H2DCFDA (5 µM) per 0,5 h in il buio. Successivamente, la generazione di ROS intracellulare è stata visualizzata utilizzando il microscopio a fluorescenza Carl Zeiss; l'intensità della fluorescenza è stata misurata sulla base di un colorante fluorescente (CM-H2DCFDA) utilizzando un citometro a flusso (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, USA).

2.8. Analisi dell'apoptosi

Dopo l'esposizione e il trattamento, i cheratinociti HaCaT sono stati tripsinizzati e centrifugati. Successivamente, l'apoptosi delle cellule ottenute è stata valutata utilizzando l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) Annexin V/Dead CellApoptosis Kit (Invitrogen Life Technologies, Carls-bad, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore. In breve, i cheratinociti sono stati risciacquati due volte con PBS e i cheratinociti nel tampone di legame dell'annessina sono stati ottenuti e miscelati con FITC/Annexin V (componente A) e soluzione di lavoro di ioduro di propidio (PI). Dopo l'incubazione a temperatura ambiente per 15 minuti al buio, è stata misurata l'apoptosi dei cheratinociti ed è stata calcolata la percentuale di cellule apoptotiche utilizzando un citometro a flusso (Fit NXT Flow Cyto, Thermo Fisher Scientific, Pasadena, CA, USA). Sono stati rilevati segnali per i canali FL1 (FITC/Nexin V) e FL3 (PI) e sono stati stabiliti la colorazione del marcatore del quadrante e i tracciati a punti delle cellule colorate.

2.9. Analisi del contenuto di melanina intracellulare e dell'attività della tirosinasi

Il contenuto intracellulare di melanina e i saggi di attività della tirosinasi sono stati misurati spiegando dove differiva la procedura leggermente modificata [24]. I melanociti sono stati trattati con una concentrazione finale di 0,5 µM -MSH e gli altri estratti parziali di 0,5 mg/mL KC per 48 ore. I pellet di melanociti sono stati lisati con 1 N NaOH in 10 percento di DMSO a 80 ◦C per 1 ora. Il contenuto relativo di melanina è stato determinato misurando l'assorbanza a 475 nm utilizzando un lettore di piastre VICTORMultilabel. L'attività intracellulare della tirosinasi è stata determinata misurando il tasso di produzione di dopacromo utilizzando L-DOPA. I melanociti sono stati lavati con PBS ghiacciato e lisati in PBS contenente l'1% (p/v) di Triton X-100. Il substrato della tirosinasi L-DOPA (2 mg/mL) è stato preparato nello stesso tampone di lisi del fosfato. Ciascun estratto è stato posto in una 96-piastra a pozzetti e l'analisi enzimatica è stata avviata aggiungendo una soluzione di L-DOPA. Dopo l'incubazione per 1 ora, l'assorbanza è stata misurata a 475 nm utilizzando un lettore di piastre multietichetta VICTOR per analizzare la produzione di dopacromo. Il valore di ciascuna misurazione è stato espresso come percentuale del controllo. Come controllo positivo è stata utilizzata l'arbutina (A, 0,5 mg/mL).

Cistancheechinacosideè un inibitore della tirosinasi.

2.10. PCR quantitativa in tempo reale

L'RNA totale è stato isolato da ciascun gruppo di melanociti utilizzando il RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germania). La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando il kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA), secondo le istruzioni del produttore, per ottenere il primo filamento di cDNA. I filamenti sono stati quindi utilizzati come modelli per la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) utilizzando uno strumento Bio-Rad Chromo4TM e il master mix SYBR Green qPCR (Thermo Fisher Scientific, Miami, OK, USA). La PCR è stata eseguita in pre-denaturazione a 95 ◦C per 5 minuti, denaturazione a 95 ◦C per 15 s e ricottura a 55–58 ◦C per 30 s. L'mRNA di GAPDH è stato utilizzato come riferimento interno per l'mRNA di tirosinasi, TRP-1 e TRP-2. Il valore relativo dell'espressione del gene bersaglio=2−∆∆CT. Le sequenze di primer erano le seguenti: tirosinasi-sense (5′-ggccagctttcaggcagaggt-3′), tirosinasi-anti-senso (5′-tggtgcttcatgggc aaaatc-3′), TRP-1-sense (5 ′-agccccaactctgtctttc-3′), TRP-1-antisenso (5′-ggtctccctacatttccagc-3′), TRP-2-senso (5′- tccagaagtttgacagccc-3 ′), TRP-2-antisenso (5′-ggaaggagtgagccaagttatg-3′), GAPDH-sense (5′-aggtggtctcctctgacttc-3′) e GAPDH-antisenso (5′-taccaggaaatgagcttgac -3′).

2.11. macchia occidentale

I melanociti sono stati raccolti e lisati utilizzando un reagente di estrazione proteica di mammiferi (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Tutte le procedure sono state eseguite secondo le istruzioni del produttore. Tutte le concentrazioni proteiche sono state determinate utilizzando un kit di analisi proteica Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Quindi, il tampone di caricamento è stato aggiunto al surnatante proteico e miscelato. La miscela è stata fatta bollire per 10 minuti e le proteine ​​​​sono state separate utilizzando gel prefabbricati Mini-PROTEAN (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) e trasferite su una membrana di polivinilidene difluoruro Hybond (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA). L'immunorilevamento è stato eseguito utilizzando tirosinasi (1:1000), TRP-1 (1:1000), TRP-2 (1:1000), MITF (1:1000), CREB fosforilato(p-CREB 1: 1000), CREB(1:1000) e -tubulin (1:1000) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) utilizzando il kit SignalBoost Immunoreaction Enhancer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). La membrana è stata incubata per una notte con gli anticorpi primari a 4 ◦C. L'anticorpo secondario di capra anti-coniglio (IgG) (1:5000, Cell Signaling Technology) è stato aggiunto alla membrana e incubato a temperatura ambiente per 1 ora. Le bande proteiche sono state osservate utilizzando un substrato di western blotting Pierce ECL potenziato (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) e quantificate come rapporto tra l'intensità della banda proteica target e l'intensità della banda della tubulina.

2.12. Analisi statistica

Tutti i test sono stati ripetuti indipendentemente almeno tre volte. Tutti i parametri statistici sono presentati come l'errore standard medio della media (SEM). Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA), seguita dal test post-hoc di Dunn. Un valore di p < 0.01="" o="" p="">< 0,05="" è="" stato="" considerato="">

test per i flavonoidi

3. Risultati

3.1. Confronto delle proprietà antiossidanti di diversi estratti parziali di KC

The total polyphenol and flavonoid contents and ABTS and DPPH scavenging activities were compared to determine the potential effects of KCR, KCS, KCL, and KCF extracts on antioxidant capacity. As shown in Figure 1B, the KCR extract(197.6 27.2 mg GAE/g) exhibited the highest phenol content, followed by KCL (153.7 6.7 mg GAE/g) and KCS (88.1 7.8 mg GAE/g); the KCF (21.8 4.8 mg GAE/g) extract had the lowest phenol content. Moreover, the results of flavonoid content analyses showed that KCL (94.5 6.3 mg QE/g) had the highest flavonoid content followed by KCR (79.6 4.2 mg QE/g); the KCS (14.9 1.3 mg QE/g) and KCF (6.4 2.0 mg QE/g) extracts had the lowest flavonoid content (Figure 1C). To further investigate the antioxidant properties of KCR, KCS, KCL, and KCF, ABTS and DPPHradical scavenging assays were performed. As shown in Figure 1D, KCL (94.7 ± 2.9%) and KCR (82.8 ± 5.9%) exhibited the highest ABTS radical scavenging activity, followed by the KCS (29.7 ± 2.0%) and KCF extract (15.9 ± 2.0%). DPPH radical scavenging activity was also shown in the order of KCL (99.9 ± 0.1%) > KCR (95.5 ± 3.6%) >KCS (25,7 ± 2,1 percento) > KCF (8,7 ± 1,1 percento) (Figura 1E).

3.2. Confronto di cheratinociti vitali e danneggiati trattati con diversi estratti parziali di KC in presenza di UVA, UVB o non irradiazione

Abbiamo condotto i seguenti esperimenti per esplorare gli effetti degli oncheratinociti KCR, KCS, KCL e KCF. Innanzitutto, tutti gli estratti sono stati applicati ai cheratinociti HaCaT in presenza di UVA, UVB o non irradiazione. L'analisi CCK-8 ha mostrato che gli estratti non modificavano significativamente la vitalità dei cheratinociti a concentrazioni di 0,5 mg/mL. Successivamente, i cheratinociti sono stati trattati con KCR, KCS, KCL e KCF in presenza di irradiazione UVA o UVB. L'irradiazione UVA e UVB ha inibito significativamente la vitalità dei cheratinociti, come mostrato dall'analisi CCK-8 nella Figura 2A. Tuttavia, abbiamo scoperto che la vitalità dei cheratinociti irradiati da UVA e UVB è aumentata nel seguente ordine: KCL, KCR, KCS e KCF (Figura 2A). Abbiamo anche monitorato i cheratinociti danneggiati misurando il rilascio extracellulare di LDH. I risultati hanno mostrato che l'irradiazione UVA o UVB facilitava significativamente il rilascio di LDH; tuttavia, KCL, KCR, KCS e KCF hanno attenuato significativamente il rilascio di LDH con l'esposizione ai raggi UVA o UVB in quest'ordine (Figura 2B). I risultati sperimentali di cui sopra hanno mostrato che gli effetti antiproliferativi e citotossici dell'irradiazione UVA o UVB sui cheratinociti sono stati alleviati nell'ordine di KCL, KCR, KCS e KCF. In particolare, KCL può ripristinare la vitalità cellulare per controllare i livelli.

Figura 2. La vitalità dei cheratinociti e gli effetti di citotossicità dell'estratto di KCR, KCS, KCL e KCF in presenza di UVA, UVB o non irradiazione.

3.3. Confronto della produzione intracellulare di ROS nei cheratinociti trattati con diversi estratti parziali di KC in presenza o assenza di irradiazione UVA e UVB

Poiché la produzione intracellulare di ROS provoca gravi danni ai cheratinociti, sono considerati potenziali mediatori del danno indotto dalle radiazioni UVA o UVB. Diversi studi hanno suggerito che l'irradiazione UVA o UVB induce la produzione endogena di ROS [12,14]. Abbiamo mirato a determinare se vi fosse un aumento dei livelli di ROS endogeni nei cheratinociti irradiati con UVA o UVB. Di conseguenza, abbiamo analizzato l'intensità della fluorescenza intracellulare della sonda CM-H2DCFDA utilizzando la microscopia a fluorescenza e la citometria a flusso. Come risultato della microscopia a fluorescenza, le immagini di colorazione CM-H2DCFDA hanno mostrato una leggera colorazione nel controllo, cheratinociti trattati con KCR, KCS, KCL e KCF e una colorazione significativa nei cheratinociti irradiati con UVA o UVB (Figura 3A). Secondo i risultati quantificati della citometria a flusso, l'irradiazione UVA e UVB ha aumentato i livelli intracellulari di ROS nei cheratinociti rispettivamente del 27,2 ± 4,5 percento e del 34,1 ± 4,2 percento, rispetto a quello del controllo (5,7 ±0,2 percento). Inoltre, in modo simile ai risultati della microscopia a fluorescenza, è stato confermato che il livello di ROS intracellulare è stato soppresso dagli estratti di KC nell'ordine di KCL > KCR > KCS > KCF in presenza di irradiazione UVA o UVB (Figura 3B). Questi risultati indicano che diversi estratti parziali di KC hanno inibito significativamente il danno dei cheratinociti riducendo i livelli di ROS endogeni.

Figura 3. Effetto dell'estratto di KCR, KCS, KCL e KCF sulla produzione intracellulare di ROS in cheratinociti UVA, UVB o non irradiati

3.4. Confronto dell'apoptosi dei cheratinociti trattati con diversi estratti parziali di KC in presenza o in assenza di irradiazione UVA e UVB

Per rilevare l'apoptosi, che è un indicatore affidabile del danno dei cheratinociti, i cheratinociti sono stati colorati con annessina V in combinazione con ioduro di propidio. Per testare il tasso di apoptosi nei cheratinociti è stato utilizzato l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit. L'irradiazione UVA e UVB ha facilitato l'attività di colorazione dell'Annessina V, mentre KCR, KCS, KCL e KCF hanno ridotto il tasso di attività di colorazione dell'Annessina V in presenza di irradiazione UVA e UVB. KCR, KCS, KCL e KCF da soli (0,5 mg/mL) non hanno indotto l'attività di colorazione dell'annessina V. I dati quantificati dalla citometria a flusso hanno mostrato che l'irradiazione UVA e UVB ha aumentato i livelli di apoptosi dei cheratinociti di 46,3± 1,5 per cento e 48,7 ± 1.0 percento, rispettivamente, rispetto a quello del controllo (5.{3}} percento ± 0,7 percento). È importante sottolineare che è stato confermato che il livello di apoptosi è stato soppresso dagli estratti di KC nell'ordine di KCL> KCR> KCS> KCF in presenza di irradiazione UVA o UVB (Figura 4A,B). Nel complesso, l'irradiazione UVA e UVB ha causato danni ai cheratinociti e diversi estratti parziali di KC hanno attenuato il danno ai cheratinociti indotto dall'irradiazione UV.

Figura 4. Effetto degli estratti KCR, KCS, KCL e KCF sull'apoptosi nei cheratinociti UVA, UVB o non irradiati.

3.5. Confronto del contenuto di melanina intracellulare e dell'attività tirosinasi dei melanociti trattati con diversi estratti parziali di KC in presenza o assenza di trattamento con -MSH

Prima di studiare il potenziale biologico di KCR, KCS, KCL e KCF sulla melanogenesi indotta da MSH, è stata valutata la vitalità cellulare dopo il trattamento con KCR, KCS, KCL e KCF (0.5 mg/mL) utilizzando il test CCK-8 nei melanociti B16F10 con o senza -MSH. KCR, KCS, KCL e KCF (0,5 mg/mL) non hanno alterato la vitalità cellulare in presenza o assenza di -MSH (Figura 5A). -MSH è un importante agente melanogeno che può aumentare il contenuto di melanina intracellulare legandosi al recettore della melanocortina 1 e attivando l'adenilato ciclasi. Per studiare l'effetto di KCR, KCS, KCL e KCF sulla melanogenesi nei melanociti, il contenuto di melanina intracellulare è stato determinato mediante osservazione visiva e misurazioni biochimiche. Come mostrato nella Figura 5B, il contenuto di melanina intracellulare è stato significativamente aumentato da -MSH. Tuttavia, il co-trattamento con KCR, KCS, KCL e KCF ha mostrato una notevole riduzione del contenuto di melanina intracellulare rispetto al trattamento -MSH. La sequenza di misurazioni biochimiche che indicavano l'inibizione del contenuto di melanina intracellulare era la seguente: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 5B). Il test dell'attività della tirosinasi intracellulare è stato eseguito secondo il test del contenuto di melanina intracellulare. L'attività della tirosinasi intracellulare dei melanociti stimolati con MSH è aumentata, mentre quella dei melanociti stimolati con MSH trattati con KCR, KCS, KCL e KCF è diminuita. La sequenza di misurazioni biochimiche che indicavano l'inibizione dell'attività della tirosinasi intracellulare era la seguente: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 5C). Questi risultati indicano che diversi estratti parziali di KC hanno ridotto significativamente il contenuto di melanina intracellulare e inibito l'attività della tirosinasi senza alterare la vitalità cellulare.

3.6. Confronto dei livelli di trascrizione e traduzione di tirosinasi, TRP-1 e TRP-2 nei melanociti trattati con diversi estratti parziali di KC in presenza o assenza di-Trattamento MSH

Per esplorare l'effetto di KCR, KCS, KCL e KCF sulla downregulation dei livelli di espressione di proteine ​​e mRNA dei marcatori della melanogenesi (tirosinasi, TRP-1 e TRP-2), i melanociti sono stati trattati con KCR , KCS, KCL e KCF in presenza o assenza di -MSH. Come mostrato nella Figura 6A-C, i livelli di mRNA di tirosinasi, TRP-1 e TRP-2 sono stati significativamente aumentati dal trattamento con -MSH. Al contrario, rispetto al trattamento -MSH, KCR, KCS, KCL e KCF hanno sottoregolato l'espressione dell'mRNA di tirosinasi, TRP-1 e TRP-2. Inoltre, KCR, KCS, KCL e KCF da soli non hanno avuto effetti significativi sui livelli di mRNA di tirosinasi, TRP-1 e TRP-2. L'analisi Western blot è stata eseguita in collaborazione con la PCR in tempo reale. I risultati hanno mostrato che il trattamento con -MSH ha aumentato i livelli di espressione proteica di tirosinasi, TRP-1 e TRP-2 e questi livelli sono stati ridotti dal co-trattamento con KCR, KCS, KCL e KCF (Figura 6D ). La sequenza di PCR quantitativa in tempo reale e western blot indicando l'inibizione di tirosinasi, TRP-1 e TRP-2 mRNA e l'espressione proteica era la seguente: KCL > KCR=KCS > KCF (Figura 6). Questi risultati suggeriscono che diversi estratti parziali di KC hanno il potenziale per promuovere l'anti-melanogenesi, che è stata dimostrata dalla downregulation dei marcatori di melanogenesi.

3.7. Confronto tra espressione MITF e fosforilazione CREB di melanociti trattati con diversi estratti parziali di KC in presenza o assenza di trattamento -MSH

Tirosinasi, TRP-1 e TRP-2 sono essenziali nella melanogenesi. La loro espressione è regolata dall'espressione MITF e dalla fosforilazione di CREB [17,21]. L'analisi Western blot ha indicato che KCR, KCS, KCL e KCF hanno inibito efficacemente l'aumento del livello proteico di MITF causato dal trattamento con -MSH. Inoltre, KCR, KCS, KCL e KCF da soli hanno rilevato a malapena l'espressione della proteina MITF. La sequenza dei risultati quantificati del western blot che indicava l'inibizione dei livelli di espressione della proteina MITF era la seguente: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 7A). Inoltre, KCR, KCS, KCL e KCF hanno invertito gli effetti del trattamento -MSH sulla fosforilazione di CREB. KCR, KCS, KCL e KCF da soli hanno avuto scarso effetto sulla fosforilazione di CREB. La sequenza dei risultati quantificati del western blot che indicano l'inibizione dei livelli di fosforilazione di CREB era la seguente: KCL > KCR > KCS > KCF (Figura 7B). Questi risultati hanno indicato che diversi estratti parziali di KC hanno soppresso gli inmelanociti della melanogenesi, almeno in parte, attraverso l'espressione di MITF e la fosforilazione di CREB.

4. Discussione

La popolarità dello sbiancamento cutaneo sta aumentando in tutto il mondo a causa dell'aumento dell'irradiazione UV ed è probabile che raggiunga proporzioni elevate nei prossimi decenni per scopi estetici [8]. I numerosi tipi di candeggina, come l'acido cogico e l'arbutina, sono stati utilizzati nei mercati cosmetici e farmaceutici. Inoltre, gli estratti naturali stanno ricevendo una crescente attenzione a causa delle loro potenziali attività antiossidanti, antinfiammatorie, antitumorali, antibatteriche e di altro tipo [26,27]. Sulla base delle caratteristiche degli antiossidanti e della fotoprotezione e anti-melanogenesi, sono stati sviluppati diversi candidati cosmetici e farmaceutici. È noto che queste proprietà dei candidati sbiancanti sono indispensabili per la ricerca e lo sviluppo cosmetico e farmaceutico [28]. Il TDM ha proprietà multi-componente e multi-target e migliora notevolmente l'efficacia biologica umana e la qualità della vita [29]. La moderna ricerca fitochimica mostra che KC contiene una varietà di ingredienti, con lignani e terpenoidi come ingredienti principali [30]. Sono stati identificati più di 202 composti, inclusi dibenzocicloottadiene lignani, Spirobenzofuranoidi dibenzocicloottadiene lignani, Arilnaftalene lignani, Kadlongilactone triterpenoidi e sesquiterpenoidi [31,32]. Le radici, gli steli e le foglie essiccate di KC hanno un'ampia tradizione di utilizzo nella TDM per il trattamento dell'artrite reumatoide, delle ulcere duodenali, dei disturbi gastrointestinali e dei problemi ginecologici. Le radici essiccate di KC, con azioni di schiarimento del calore ed eliminazione delle tossine, inducendo la diuresi per rimuovere gli edemi. I frutti di KC sono per lo più consumati sotto forma di frutta fresca, succhi e vino di frutta, indicando che sono benefici per la salute umana [7,33,34]. Precedenti studi hanno anche dimostrato che è ricco di ingredienti bioattivi come lignani, triterpenoidi, flavonoidi, acidi fenolici, steroidi e aminoacidi, che hanno un alto valore nutritivo e medicinale [3,35]. In questo studio sono state estratte diverse parti di KC. In particolare, il contenuto totale di polifenoli e flavonoidi delle foglie e delle radici di KC era molto più alto di quello di steli e frutti. Foglie e radici contengono più del doppio di polifenoli e flavonoidi rispetto a steli e frutti. Di conseguenza, riteniamo che i polifenoli e i flavonoidi totali diano un contributo significativo agli effetti fotoprotettivi e anti-melanogenici del KC.

La fototossicità cutanea causata dalle radiazioni UV è principalmente dovuta alla citotossicità cellulare, all'accumulo intracellulare di ROS e all'apoptosi nei cheratinociti. Pertanto, è più ragionevole concentrarsi sull'inibizione della citotossicità cellulare, dell'accumulo intracellulare di ROS e dell'apoptosi nei cheratinociti irradiati da UVA e UVB [36,37]. Come descritto in questo studio [10,38], l'intervento con estratti di KC sulla fotocitotossicità (UVA: 20 J/cm2, UVB: 50 mJ/cm2) ha mostrato che gli estratti di KC hanno ridotto significativamente la citotossicità cellulare, l'accumulo intracellulare di ROS e apoptosi. Coerentemente con i risultati precedenti, gli effetti fotoprotettivi delle foglie e delle radici di KC erano molto superiori a quelli dello stelo e del frutto. Inoltre, i nostri risultati hanno indicato che gli estratti di KC mostrano gli effetti sopra menzionati promuovendo l'attività antiossidante. La melanogenesi è spesso osservata dopo l'irradiazione UV ed è principalmente associata a pigmentazione o iperpigmentazione [39]. Secondo studi precedenti, il tema dell'induzione della melanogenesi utilizzando -MSH è stato ampiamente riconosciuto e applicato. Pertanto, questo studio si è basato sulla costruzione di un modello di melanociti stimolato con -MSH [24,39]. Abbiamo scoperto che gli estratti di KC sopprimevano il contenuto di melanina intracellulare stimolato da MSH e l'attività della tirosinasi. Inoltre, gli estratti di KC hanno sottoregolato la trascrizione e la traduzione dei marcatori della melanogenesi come tirosinasi, TRP-1 e TRP-2 nei melanociti stimolati con MSH. Inoltre, abbiamo studiato l'espressione della proteina MITF e la fosforilazione di CREB nei melanociti stimolati con MSH. Allo stesso modo, in questo studio, abbiamo scoperto che gli estratti di KC sopprimevano l'espressione della proteina MITF mediata da MSH e la fosforilazione di CREB nei melanociti. Coerentemente con i risultati fotoprotettivi, gli effetti anti-melanogenici delle foglie e delle radici di KC erano molto superiori a quelli degli steli e dei frutti.

fettine di cistanghe

Per maggiori informazioni, clicca qui.

5. Conclusioni

Nel complesso, in questo studio sono stati trovati i potenziali effetti fotoprotettivi e anti-melanogenici dell'estratto di KC. L'estratto di KC ad alto contenuto di polifenoli e flavonoidi può esercitare effetti fotoprotettivi e antimelanogenici su cheratinociti e melanociti. Questo studio fornisce una logica e una strategia di ricerca per interventi cosmetici e farmaceutici per sbiancanti naturali e agenti fotoprotettivi.