Effetti antimelanogenesi dell'estratto di foglie e sostanze fitochimiche dall'oliva di Ceylon (Elaeocarpus Serratus) nel modello di pesce zebra
Mar 23, 2022
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Chi-Ya Huang 1 · , I-Hsuan Liu 2 , Xiang-Zhe Huang 1 , Hui-Jen Chen 1 , Shang-Tzen Chang 1 , Mei-Ling Chang 3 , Yu-Tung Ho 1 e Hui-Ting Chang 1,*
Astratto:Lemelanogenesieffetto di inibizione nel pesce zebra (Danio rerio) eantitirosinasiattività di l'etanolicoestrarree le sue sostanze fitochimiche dalle foglie di oliva di Ceylon (Elaeocarpus serratus Linn.) erano indagato in questo studio. Tra l'estratto di foglie e quattro frazioni solubili, l'acetato di etile solubile la frazione presenta la migliore antitirosinasi eantimelanogenesiAttività. Un acido fenolico, gallico acido, e due flavonoidi, miricetina, e significa stagno, sono isolati dalle sottofrazioni attive attraverso l'isolamento guidato dal biodosaggio; le loro strutture sono chiarite in base alla NMR 1D e 2D, FTIR, UV, e analisi spettroscopiche MS. Questi composti hanno significativiantitirosinasiattività se utilizzando L-tirosina o L-DOPA come substrato; mearnsentin mostra l'attività ottimale. Nell'enzima indagine cinetica, sia l'acido gallico che la mearnsetina sono gli inibitori di tipo competitivo contro tirosinasi di funghi e miricetina agiscono come un tipo mistotirosinasiinibitore. Fogliaestrarree un la frazione solubile dell'acetato di etile mostra prestazioni efficaci nell'inibizione della formazione di melanina negli embrioni di zebrafish. Mearnsetin possiede anche un promettente effetto antimelanogenesi, che è superiore al controllo positivo,Arbutina. I risultati rivelano che l'estratto di foglie di olivo di Ceylon e il suo i fitochimici, in particolare la mearnsetina, hanno il potenziale per essere utilizzati comeantimelanogenesie ingredienti sbiancanti per la pelle.
Parole chiavi: effetto antimelanogenesi; Elaeocarpus serratus; melanina; inibitore della tirosinasi; Zebrafish
Herba cistanchesinibisce l'attività della tirosinasi.
1. Introduzione
La melanina svolge un ruolo essenziale in molte funzioni biochimiche; fornisce protezione per la pelle da danni ultravioletti (UV), l'eliminazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) e altre reazioni biochimiche [1-3]. L'eccessivo accumulo di melanina provoca anche iperpigmentazione, melasma, macchie dell'età, oscuramento della pelle, ecc. [4,5]. Nel mondo orientale, le persone sono interessate alla questione dell'effetto sbiancante sul pelle; l'industria cosmetica si dedica allo sviluppo di cosmetici sbiancanti contro la melanogenesi. Esistono diversi meccanismi, tra cuitirosinasiattività inibitoria, rimozione dei melanociti e interferenza con la sintesi della melanina per esibire la melanogenesi attività inibitoria. Sono stati studiati i promettenti reagenti che inibiscono la melanogenesi dal 1940 [2,4,6,7]. Tuttavia, partemelanogenesigli inibitori possiedono alcuni effetti collaterali; ad esempio, l'idrochinone può causare ocronosi esogena e ipomelanosi permanente [5,8]. L'eccesso di acido cogico può causare allergia e tumori alla tiroide [9,10].
Recentemente, i ricercatori si sono dedicati alla ricerca di promettenti reagenti melanogenici con effetti collaterali no/lievi da prodotti naturali vegetali [11-13]. Naturaletirosinasisono stati riportati inibitori da fonti vegetali, inclusi fenoli semplici, acidi fenolici, stilbeni, flavonoidi, lignani, terpenoidi, chinoidi, ecc. [2,14-16]. Solano et al. che i composti fenolici e gli altri composti naturali hanno il grande potenziale per inibizione della melanina, ad esempio arbutina (un glucoside fenolico trovato in Arctostaphylos uva-ursi), il estratto di tè verde, acido alfa idrossile (AHA), acido ascorbico e così via [5].Arbutinaè ampiamente utilizzato come ingrediente chiave dei prodotti sbiancanti commerciali sul mercato [4,17]. Gallocatechina-3-O-gallato (GCG), epigallocatechina-3-O-gallato (EGCG) ed epicatechina3-O-gallato (ECG) sono stati identificati nel tè verdeestrarre; questi composti possiedono una buona efficacia inibitoria della tirosinasi [17]. Arctigenina, un lignan isolato dall'artico di Fructus estratto, potrebbe ridurre il contenuto di melanina degli embrioni di zebrafish (Danio rerio) [18]. Lee et al. ha riferito che i ginsenosidi della foglia e della bacca di Panax ginseng inibiscono ilmelanogenesidell'embrione di zebrafish; i ginsenosidi attivi sono ginsenoside Rh6, vina-ginsenoside R4, vina-ginsenoside R13, ginsenoside Rh23 e floralginsenoside A [19-21].
Elaeocarpus serratus Linn. (Tiliaceae), comunemente chiamata oliva di Ceylon, è distribuita in Africa, Australia e Sud-Est asiatico. Il sottaceto fatto del frutto commestibile dell'oliva di Ceylon è comune in Sri Lanka [22]. È tradizionalmente usato per prevenire i pidocchi e la forfora in Sri Lanka. Le bioattività dell'estratto di E. serratus sono state valutate negli studi correlati [22,23]. E. l'estratto di foglie di serratus possedeva attività antibatterica contro Plesiomonas, Salmonella typhi, e Proteus spp. alla concentrazione di 400 μg/mL mediante il saggio di diffusione plate-hole [23]. L'estratto di foglie di E. serratus aveva il potenziale di essere un antitumorale, antimicrobico e pesticida reagente nello studio di citotossicità del test di letalità dei gamberetti in salamoia (Artemia salina); Le LC50 della fogliaestrarreera di 40 μg/mL contro i gamberetti in salamoia [23]. Flavonolo antiossidante glicosidi, tra cui miricitrina, mearnsetina 3-O-β-D-glucopiranoside, mearnsitrina, e tamarixetin 3-O-α-L-rhamnopyranoside, sono stati isolati e identificati dall'E. serratus estratto di foglie [22].
Gli obiettivi di questo studio sono valutare gli effetti della foglia di E. serratusestrarree le sue frazioni suantitirosinasiattività (in vitro) emelanogenesiattività di inibizione in zebrafish (in vivo). Sono state effettuate tecniche di frazionamento e isolamento guidate da biosaggi fuori per trovare i composti promettenti come potenziali ingredienti antimelanogenesi. Gli sviluppi di ingredienti antimelanogenesi efficaci possono aumentare l'utilizzo ottimale di prodotti vegetali naturali nell'industria farmaceutica e cosmetica.
2. Materiali e metodi
2.1. Materiale vegetale ed estrazione
Oliva di Ceylon (Elaeocarpus serratus), intorno ai 50 anni, le foglie sono state raccolte da Università Nazionale di Taiwan, Taipei, Taiwan a settembre. Le foglie fresche (3,95 kg) erano estratto con etanolo al 95% per 7 giorni a temperatura ambiente. Il filtratoestrarreè stato essiccato a pressione ridotta da un evaporatore rotante con una temperatura del bagno di 50 ◦C [24]. Le la resa dell'estratto di foglie (0,32 kg) è stata del 12,0% (p/p di peso essiccato).
cistancheestrarre
2.2. Partizione liquido-liquido
Leestrarreè stato sottoposto a successiva estrazione con solvente organico nell'aumento ordine di polarità per partizione liquido-liquido [24,25]. L'estratto di foglie è stato frazionato in frazione solubile in n-esano (HF, 9,1%), frazione solubile in acetato di etile (EF, 11,3%), n-butanolo frazione solubile (BF, 17,3%) e frazione solubile in acqua (WF, 31,0%).
2.3. Cromatografia su colonna e cromatografia su strato sottile
La frazione solubile di acetato di etile bioattivo è stata ulteriormente frazionata dalla colonna di gel di silice cromatografia (CC). La cromatografia a colonna aperta è stata eseguita mediante eluizione graduale con diverso rapporto tra n-esano e acetato di etile [26]. Diciannove sottofrazioni (E1–E19) sono stati ottenuti mediante cromatografia a strato sottile (TLC) [27]. Le rese delle sottofrazioni erano E1 (1.05%), E2 (8.21%), E3 (1.64%), E4 (0.74%), E5 (1.52%), E6 (0.86%), E7 (1.51%), E8 (9.50%), E9 (7.78%), E10 (3.97%), E11 (2.65%), E12 (8.49%), E13 (5.58%), E14 (4.43%), E15 (5.31%), E16 (1.14%), E17 (1.87%), E18 (0.76%), and E19 (2.96%).
2.4. Cromatografia liquida ad alte prestazioni
Le sottofrazioni attive della frazione solubile di acetato di etile sono state analizzate e isolate da cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC, L-2130, Hitachi, Tokyo, Giappone) montata con una colonna RP-18 preparativa (Purospher®, STAR RP-18 end-capped, 250 × 10 mm, 5 μm). La fase mobile gradiente consisteva in acqua (A) e acetonitrile (B). La portata era di 3 ml / min. Il programma di eluizione prevedeva un gradiente lineare dal 30 al 35% B in A per 0-15 min, dal 35 al 100% B in A entro 15-25 min, e seguito da 5 min di equilibrio con il 100% B. I picchi eluiti sono stati rilevati da un rilevatore UV a 254 nm [25,28].
2.5. Identificazione dei composti isolati
Le strutture dei composti isolati sono state determinate e caratterizzate per mezzo di analisi spettrali, compresa la spettroscopia ultravioletto-visibile (UV/VIS, V-550, Jasco, Tokyo, Giappone), spettroscopia infrarossa a trasformata di Fourier (FTIR, FTS-40, Bio-rad, Hercules, CA, USA) e spettroscopia di massa (MS, MAT-958, Finnigan, MA, USA). Nucleare magnetico spettroscopia di risonanza (NMR), inclusa 1D (1H-NMR, 500 MHz; 13C-NMR, 125 MHz) e 2D NMR (HSQC e HMBC), sono stati registrati con uno spettrometro Bruker AVIII NMR (Bruker Avance, Rheinstetten, Germania) [29–32].
2.6. Saggio antitirosinasi e studio enzimatico cinetico
In vitroantitirosinasiil saggio era un'analisi spettrofotometrica basata sui metodi descritto in precedenza [33–35]. L-DOPA (3,4-diidrossifenilalanina) e L-tirosina erano usato come substrato, rispettivamente. Nelle micropiastre a 96 pozzetti, 40 μL di soluzione campione e 70 μL di tampone fosfato di potassio (0,1 M, pH 6,8) sono stati miscelati, che è stato seguito aggiungendo 50 μL di 200 unità/mL di tirosinasi di funghi (EC1.14.18.1) dopo l'incubazione a 25 ◦C per 10 min. Quindi, abbiamo aggiunto 40 μL di substrato da 2,5 mM (L-tirosina/L-DOPA) nel bene, e la miscela è stata incubata per 10 minuti. Dopo l'incubazione, l'assorbanza a 475 nm di ciascun pozzetto è stato misurato dal lettore ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (SPECTROstar Nano, BMG LABTECH, Offenburg, Germania). Il controllo positivo è statoArbutina, e il numero di repliche era tre. L'inibizione percentuale deltirosinasil'attività è stata calcolata con la seguente equazione: Inibizione (%) = [(vuoto di Acontrol-Acontrol)– (Asample–Asample's blank)/(Acontrol–Acontrol's blank)] × 100. Quindi, l'inibitorio semi-massimale la concentrazione (IC50) del campione è stata calcolata dalla curva concentrazione-risposta.
Lo studio cinetico enzimatico è analizzato dal grafico reciproco Lineweaver-Burk del velocità di reazione e concentrazione del substrato per valutare l'effetto del campione su l'affinità del substrato e dell'enzima. La concentrazione ditirosinasiè stato mantenuto costante a 200 unità/mL, mentre la concentrazione del substrato (L-tirosina/L-DOPA) è stata variata a 0,5, 0,75, 1,0, 1,25 e 1,5 mM. La reazione è stata simile al saggio antitirosinasi come descritto sopra; 40 μL di soluzione campione e 70 μL di tampone fosfato di potassio (0,1 M, pH 6,8) erano miscelato, che è stato seguito dall'aggiunta di 50 μL di 200 unità/mL di tirosinasi, dopo incubazione a 25 ◦C per 10 min. Quindi, abbiamo aggiunto 40 μL del substrato nel pozzo e lo abbiamo mescolato accuratamente, e le misurazioni cinetiche della soluzione sono state misurate immediatamente per un periodo di 3 minuti alla lunghezza d'onda rilevata (475 nm). Entrambi i parametri cinetici, costante di Michaelis-Menten (Km) e velocità massima (Vmax), sono stati calcolati dalla lineare Lineweaver–Burk equazione [36–38].
2.7. Valutazione dell'effetto antimelanogenesi nel pesce zebra
Il pesce zebra (Danio rerio) del ceppo AB selvatico è stato mantenuto in un ambiente acquatico sano ambiente a 26–30 ◦C, con un ciclo luce-buio di 14:10 ore. Dopo 9 ore di post-fecondazione (hpf), gli embrioni sono stati posti in una piastra a 24 pozzetti (3 embrioni per pozzetto), trattati con vari finali concentrazioni di campioni disciolti in DMSO all'1% e incubati a 28 ◦C per 48 ore (a 57 hpf). L'immagine digitale di un embrione di zebrafish vivo è stata presa attraverso uno stereomicroscopio (Olympus SZ61, Tokyo, Giappone) con un ingrandimento totale del 40×; quindi, il contenuto di melanina dell'embrione di zebrafish è stato analizzato dal software ImageJ. I controlli positivi sono statiArbutina(ingrediente commerciale per lo sbiancamento della pelle) e 1-fenil-2-tiourea (PTU, una sintesi di melanina inibitore). Il numero di repliche è stato di sei [21,39,40].
2.8. Analisi statistica
I dati ottenuti nello studio sono stati analizzati da Statistical Analysis System (SAS) v 9.2 (Cary, NC, USA) con il test di Scheffe, che è un metodo di confronto multiplo post hoc. L'intervallo di confidenza è stato fissato al 95%.
dr vita OPC nelsbiancamento della pelle
3. Risultati e discussione
3.1. Attività antitirosinasi dell'estratto di foglie di E. serratus e delle sue frazioni
Il diagramma schematico di estrazione, isolamento, identificazione,antitirosinasiattività eantimelanogenesieffetto della foglia di E. serratusestrarreè mostrato nella Figura 1. L'estratto di foglie è stato ulteriormente frazionato in frazione solubile di n-esano (HF), frazione solubile di acetato di etile (EF), la frazione solubile n-butanolo (BF) e una frazione solubile in acqua (WF) da liquido liquido partizione.
La tirosinasi, prodotta dalle cellule melanocitarie, svolge un ruolo chiave per catalizzare la complicata sintesi della melanina; l'esplorazione ditirosinasiinibitore è uno dei prominenti modi per ritardaremelanogenesi[2,5,41]. Attività di inibizione della tirosinasi della fogliaestrarree quattro frazioni sono mostrate nella Figura 2. Quando si utilizza L-tirosina come substrato, solo il la frazione solubile dell'acetato di etile ha avuto l'effetto di inibizione contro la tirosinasi alla concentrazione di 400 μg/mL. L'estratto di foglie, la frazione solubile di acetato di etile e la frazione solubile di n-butanolo hanno mostrato l'attività dell'antitirosinasi quando si cambia L-DOPA come substrato. Tra estratto di foglie e quattro frazioni, la frazione solubile di acetato di etile si è dimostrata la miglioreantitirosinasicon i valori IC50 di 279,38 e 166,95 ug/mL quando si utilizzano rispettivamente L-tirosina e L-DOPA come substrato (Tabella 1).
Tabella 1. IC50 valori di sottofrazioni attive contro la tirosinasi dei funghi.
La frazione solubile di acetato di etile è stata sottoposta al frazionamento guidato dal biodosaggio utilizzando tecniche cromatografiche a colonna preparativa e cromatografiche a strato sottile, e sono state ottenute diciannove sottofrazioni (E1-E19). Tra queste sottofrazioni, le sottofrazioni E7-E10 hanno mostrato il più alto effetto inibitorio della tirosinasi in entrambi i saggi di substrato (L-tirosina e L-DOPA). I valori di concentrazione inibitoria semi-massimale (IC50) delle sottofrazioni attive controtirosinasisono riportati nella tabella 1. I valori IC50 di tutte le sottofrazioni E7–E10 erano inferiori a 200 μg/ml; Le sottofrazioni E7 ed E9 hanno anche mostrato prestazioni migliori rispetto a conArbutina, che è un ingrediente sbiancante commerciale.
3.2. Isolamento e identificazione di composti da sottofrazioni bioattive
Tre composti (ES1-3) sono stati isolati da sottofrazioni bioattive (E7-E10) da cromatografia liquida ad alte prestazioni. Acido gallico (ES1): polvere bianca; mp 257 °C; UV (MeOH) λmax (log ε) 215.5 (3.94), 268.0 (3.46) nm; IR (KBr) νmax 3495, 3416, 3285, 1647, 1542, e 1220 cm−1; EI-MS m/z 171 [M+H] + , in accordo con la formula molecolare C7H6O5. Miricetina (ES2): ago giallo; mp 358 °C; UV (MeOH) λmax (log ε) 252.5 (4.43) e 374,0 (4,50) nm; IR (KBr) νmax 3421, 1663, 1596, 1520, 1229, 1202 e 1171 cm−1; EI-MS m/z 319,36 [M+H] + , formula molecolare C15H10O8. Mearnsetina (4′-O-metilmiricetina, ES3): polvere gialla; mp 184 °C; UV (MeOH) λmax (log ε) 259,5 (4,21) e 364,5 (4,26) nm; IR (KBr) νmax 3409, 2960, 2927, 2853, 1661, 1599, 1507, 1208 e 1163 cm−1; EI-MS m/z 333,0 [M+H] + , formula molecolare C16H12O8. I dati NMR di questi composti sono riassunti nella tabella 2. Le strutture chimiche dei composti identificati sono mostrate nella Figura 3.
Tabella 2. Dati NMR 1H, 13C e HMBC dei composti.
Tra questi composti, l'acido gallico è un acido fenolico; miricetina e mearnsetina appartengono ai flavonoidi. Il contenuto di ciascun composto nella frazione solubile dell'acetato di etile e le sottofrazioni E7-E10 sono elencate nella Tabella 3. La sottofrazione E7 era ricca di mearnsetin (433,38 mg/g); la sottofrazione primaria E8 conteneva acido gallico (417,64 mg/g). Il principale costituente delle sottofrazioni E9 ed E10 era la miricetina (rispettivamente 406,41 e 336,41 mg/g). Il contenuto di tre composti nella frazione solubile dell'acetato di etile era di 59,72 mg/g (acido gallico), 45,21 mg/g (miricetina) e 22,66 mg/g (mearnsetina).
3.3. Attività dell'antitirosinasi e studio cinetico enzimatico di composti isolati
Antitirosinasil'attività di questi composti da sottofrazioni attive è stata rappresentata nella tabella 4. Quando si utilizzava la L-tirosina come substrato, l'ordine di attività antitirosinasi dei composti esaminati era mearnsetina > miricetina > acido gallico > arbutina; mearnsetin ha avuto il miglior effetto di inibizione con il valore IC50 di 56,57 μg/mL (0,17 mM). Risultati simili sono stati osservati nella L-DOPA utilizzata come substrato; l'efficacia di tre sostanze fitochimiche era superiore a quello diArbutina.
Un vero inibitore enzimatico contiene quattro modalità di inibizione, tra cui competitivo, non competitivo, di tipo misto (sia competitivo che non competitivo) e non competitivo [12]. Le costanti cinetiche, Km e Vmax, sono determinate dalla velocità iniziale dell'enzima alle diverse concentrazioni del substrato nel grafico di Lineweaver-Burk; si intersecano sull'asse y è equivalente a 1/Vmax, e si intersecano all'asse x è −1/Km. Nell'enzima cinetico studio dei composti terpenoidi dall'olio essenziale di buccia di agrumi controtirosinasicitrale ha agito come un inibitore non competitivo e il mircene è stato un inibitore competitivo [36]. Le meccanismo di inibizione della 3,7-dioleylquercetin contro la tirosinasi dei funghi era attraverso il modello di inibizione competitiva per sopprimere la produzione di melanina [42].
Tabella 4. IC50 valori di composti contro la tirosinasi dei funghi
Il tipo di inibizione sulla tirosinasi di tre sostanze fitochimiche è stato chiarito da un studio cinetico enzimatico. La figura 4 mostrava il diagramma di Lineweaver-Burk (doppio grafico reciproco) di mearnsetin. Nelle analisi di entrambi i substrati, L-tirosina e L-Dopa, la regressione lineare linea di diverse concentrazioni di mearnsetina aveva la stessa intercetta sull'asse y e la pendenza crescente. I parametri cinetici dell'acido gallico, della miricetina e della mearnetina sono riassunto nella Tabella 5. In presenza di acido gallico o mearnsetina, un aumento di Km e è stata osservata una costante in Vmax, che indica che sia l'acido gallico che la mearnsetina erano i inibitore competitivo della tirosinasi. Ha indicato che l'acido gallico e la mearnsetina potrebbero legarsi per liberaretirosinasicon elevata affinità e prevenire il legame del substrato (L-tirosina o L-DOPA) al sito attivo della tirosinasi. Miricetina è risultato essere un inibitore di tipo misto, contenente inibizione competitiva e non competitiva da quando Km è stato aumentato e Vmax è stato diminuito. L'inibizione non competitiva ha dimostrato che i composti si legano al substrato della tirosinasi complesso ma non alla tirosinasi libera.
3.4. Effetti antimelanogenesi di estratti, frazioni e fitochimici isolati
Il pesce zebra (Danio rerio) è un nuovo e valido organismo modello per la ricerca sulla melanogenesi in studi recenti [18–21,40]. Leantimelanogenesieffetti dell'estratto di foglie e quattro frazioni nel test in vivo del pesce zebra sono mostrati nella Figura 5. La fogliaestrarree acetato di etile la frazione solubile ha mostrato buone prestazioni nell'inibizione della formazione di melanina in embrioni di zebrafish. Ad una concentrazione di 200 μg/mL, l'estratto di foglie e l'acetato di etile la frazione solubile ha inibito il 27,72% e il 35,60% della produzione di melanina degli embrioni di zebrafish, rispettivamente. Tutti i trattamenti non hanno influenzato la crescita degli embrioni di zebrafish con un tasso di sopravvivenza del 100%.
La figura 6 ha presentato gli effetti dei composti e dei controlli positivi, PTU e arbutina, sulmelanogenesidi pesce zebra ad una concentrazione di 50 μM. PTU è un fortetirosinasiinibitore per prevenire la produzione di melanina, mentreArbutinaè uno sbiancamento della pelle commerciale agente; entrambi i controlli positivi potrebbero ridurre la formazione di melanina nel pesce zebra. Tra i tre fitochimici, la miricetina ha mostrato un leggero effetto di inibizione della melanina, mentre la mearnarnsetina ha avuto la migliore attività di inibizione della melanogenesi nel pesce zebra.
Le concentrazioni effettive dimelanogenesil'attività di inibizione nel pesce zebra dei composti è elencata nella Tabella 6. I valori IC50 di PTU e arbutina erano 26,29 μM e 323,69 μM, rispettivamente. L'ordine dell'attività antimelanogenesi dei composti esaminati era PTU > mearnsetin >Arbutinae miricetina > acido gallico. Mearnsetin ha mostrato la migliore efficacia con un valore IC50 di 121,01 μM tra i fitochimici esaminati.
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4. Conclusioni
Lemelanogenesieffetto di inibizione eantitirosinasiattività dell'estratto di foglie da L'oliva di Ceylon (E. serratus) è stata valutata in questo studio. Tra le foglieestrarree i suoi quattro frazioni, la frazione solubile di acetato di etile ha avuto il meglioantitirosinasiattività. Fitochimici, tra cui acido gallico, miricetina e mearnsetina, sono stati isolati e identificati dal sottofrazioni attive mediante cromatografia guidata da biodosaggio e analisi spettrali. L'ordine dell'attività antitirosinasi di questi composti era mearnsetina > miricetina > acido gallico. Le uno studio enzimatico cinetico in vitro rivela che l'acido gallico e la mearnsetina erano inibitori competitivi della tirosinasi e la miricetina era un inibitore di tipo misto. I risultati del test in vivo del pesce zebra hanno rivelato che una frazione solubile di acetato di etile e tre sostanze fitochimiche possedeva significativomelanogenesieffetti di inibizione. L'effetto antimelanogenesi di mearnsetin era superiore a quella del controllo positivo,Arbutina, nel pesce zebra.