Effetti sbiancanti e antirughe dei composti bioattivi isolati dal guscio di arachidi mediante estrazione assistita da ultrasuoni

Contatto:ali.ma@wecistanche.com

Da Hye Gam 1, Ji Woo Hong 1, Jun Hee Kim 1 e Jin Woo Kim 1,2,3,*

Astratto:La metodologia della superficie di risposta è stata impiegata per ottimizzare le condizioni di estrazione assistita da ultrasuoni (UAE) per l'ottimizzazione simultanea di variabili dipendenti, tra cui l'attività di scavenging radicale DPPH (RSA), l'inibizione dell'attività della tirosinasi (TAI) e l'inibizione dell'attività della collagenasi (CAI) di estratti di gusci di arachidi. Gli effetti delle variabili principali tra cui il tempo di estrazione (5.0~55.0 min, X1), la temperatura di estrazione (26.0~94.0 ◦C , X2) e la concentrazione di etanolo (0.0 percento ~99,5 percento ,X3) sono state ottimizzate. Sulla base dei valori sperimentali di ciascuna condizione, sono stati derivati ​​modelli di regressione quadratica per la previsione delle condizioni ottimali. Il coefficiente di determinazione (R2) della variabile indipendente era compreso nell'intervallo 0.89~0.96, il che dimostra che il modello di regressione è adatto per la previsione. Nella previsione delle condizioni ottimali degli Emirati Arabi Uniti in base al metodo di sovrapposizione, sono stati identificati un tempo di estrazione di 31,2 min, una temperatura di estrazione di 36,6 ◦C e una concentrazione di etanolo del 93,2%. In queste condizioni, sono state previste RSA del 74,9 percento, TAI del 50,6 percento e CAI del 86,8 percento, mostrando un buon accordo con i valori sperimentali. Una reazione a catena della trascrizione inversa-polimerasi ha mostrato che l'estratto di guscio di arachidi ha ridotto i livelli di mRNA ditirosinasigeni correlati alla proteina-1 e alla metalloproteinasi della matrice-3 nelle cellule B16-F0. Pertanto, abbiamo identificato ilsbiancamento della pellee gli effetti antirughe degli estratti di gusci di arachidi a livello di proteine ​​e di espressione genica, e i risultati mostrano che il guscio di arachidi è un materiale cosmetico efficace persbiancamento della pelleed effetti antirughe. Sulla base di questo studio, il guscio di arachidi, che era considerato un sottoprodotto, può essere utilizzato per lo sviluppo di cibi, medicinali e cosmetici sani.

Parole chiave:guscio di arachidi; ottimizzazione;sbiancamento della pelle; anti rughe; antiossidante;tirosinasi; collagenasi; proteina correlata alla tirosinasi umana-1 (TRP-1); metalloproteinasi della matrice (MMP)

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1. Introduzione

La melanina è un pigmento polimerico di colore marrone o nero sintetizzato dai melanosomi dei melanociti nell'epidermide. La sua funzione principale è quella di bloccare i raggi ultravioletti (UV) per proteggere la pelle. In alternativa, la sua produzione eccessiva può causare scurimenti del pigmento, come melasma, nei e macchie dell'età [1–3]. La tirosinasi è un importante enzima che catalizza le reazioni di autoossidazione e polimerizzazione, attraverso le quali la tirosina viene convertita in dopachinone tramite diidrossifenilalanina e produce melanina attraverso la biosintesi della melanina dopacromatica [4]. Pertanto, è ampiamente utilizzato per ridurre o attenuare la produzione di melanina attraverso l'inibizione ditirosinasiattività al fine di potenziare l'effetto sbiancante dei cosmetici [5]. La rapida industrializzazione e l'uso crescente di clorofluorocarburi hanno gravemente danneggiato lo strato protettivo di ozono terrestre, determinando così una maggiore quantità di raggi UV che raggiungono il suolo ed espongono la pelle. Questo aumento della radiazione UV induce di conseguenza la generazione attiva di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nel corpo umano, come anioni superossido, perossidi di idrogeno e radicali idrossilici. Tali specie hanno promosso l'ossidazione continua della tirosina, con conseguente aumento della produzione di melanina. A questo proposito, sono attivamente condotti studi sull'inibizione ditirosinasiattività così come la rimozione dei ROS al fine di svilupparsisbiancamento della pelleagenti [6]. Il collagene è una matrice extracellulare importante che comprende il 90 percento del derma. Il collagene protegge e dona elasticità alla pelle ed è coinvolto nella rigidità meccanica della pelle, nella resistenza, nel legame dei tessuti connettivi e nella proliferazione e differenziazione delle cellule [7]. Le proteine ​​che compongono la matrice extracellulare, come il collagene, vengono decomposte dalla collagenasi, come la metalloproteinasi della matrice (MMP), causando rughe, diminuzione dell'elasticità e rilassamento cutaneo [8]. Vari tipi di MMP che sono espressi da ROSidrolizzano la catena del collagene, il tessuto connettivo della pelle e generano la sua reticolazione anormale per aumentare la decomposizione del collagene e accelerare la formazione delle rughe [9]. Per questo motivo, l'inibizione della produzione di melanina e della decomposizione del collagene attraverso la riduzione della generazione di ROS è stata l'obiettivo principale per lo sbiancamento della pelle e la prevenzione delle rughe [10]. Arbutina, acido cogico e acido linolenico, come cosmetici sbiancanti e retinolo, gallato e andadenosina, come anti -cosmetici antirughe, sono stati ampiamente utilizzati negli ultimi anni. Tuttavia, l'uso di questi materiali è limitato, data la loro instabilità in presenza di luce e calore, nonché le reazioni avverse, tra cui irritazioni cutanee e dermatiti da contatto [11]. Con il crescente interesse per gli antiossidanti naturali per superare le carenze degli ingredienti sbiancanti e antirughe convenzionali, gli estratti di origine vegetale sono stati utilizzati attivamente per sviluppare composti bioattivi per la pelle e sicurisbiancamentoe cosmetici antirughe [12,13].

Esistono vari metodi di estrazione attualmente utilizzati per l'estrazione di composti bioattivi dalle piante. Tuttavia, l'estrazione di composti bioattivi da fonti naturali, in particolare piante, è stata condotta principalmente attraverso metodi di estrazione con solvente, acqua calda e Soxhlet, che hanno mostrato vari inconvenienti, tra cui bassa efficienza di estrazione, decomposizione degli ingredienti, bassa stabilità e costi operativi elevati [14]. Pertanto, sono stati recentemente testati metodi di estrazione, inclusa l'estrazione assistita da ultrasuoni, assistita da microonde e supercritica [15]. In particolare, gli ultrasuoni sono un'onda sonora con una frequenza di circa 20 kHz o più, che si traduce in compressione, cavitazione e rarefazione del liquido, massimizzando così il movimento molecolare in breve tempo per ottenere un'elevata efficienza di estrazione [16]. Inoltre, gli ultrasuoni sono vantaggiosi, in quanto il loro breve tempo di estrazione riduce al minimo la decomposizione dei composti bioattivi ed è considerato un metodo efficace per estrarre ingredienti naturali con azione antiossidante,sbiancamento, e proprietà antirughe di molte piante ed erbe [17]. L'ottimizzazione delle condizioni di estrazione è essenziale per aumentare l'efficienza dell'estrazione assistita da ultrasuoni (UAE) e il processo di ottimizzazione può essere eseguito con metodi sperimentali o statistici. Il metodo tradizionale un fattore alla volta, con tutte le variabili che rimangono costanti e cambiano solo un fattore alla volta, ha dei limiti nel determinare gli effetti interattivi se si tratta di un esperimento multivariato. D'altra parte, RSM fornisce informazioni statistiche sulla correlazione tra variabili negli esperimenti multivariati, insieme a esperimenti efficaci utilizzando un numero minimo di campioni, nonché importanti tecniche matematiche e statistiche per valutare l'efficacia e l'adeguatezza del modello di regressione. Per l'ottimizzazione su base statistica, vari modelli RSM, come il design fattoriale completo, il design Box-Behnken e il design composito centrale (CCD), sono stati ampiamente utilizzati. Tra questi, il CCD è molto efficiente e quindi fornisce molte informazioni sugli effetti variabili dell'esperimento e sull'errore sperimentale complessivo, con un numero minimo di esecuzioni richieste [18]. Pertanto, in molti studi esistenti, il CCD è stato ampiamente utilizzato per sviluppare, migliorare e ottimizzare il processo condizioni per estrarre vari antiossidanti e altri metaboliti da prodotti naturali.

L'arachide (Arachis hypogaea) è una pianta annuale appartenente alla famiglia delle leguminose. È coltivato in più di 50 paesi in tutto il mondo, tra cui Corea del Sud, India, Cina e Stati Uniti [19]. Le arachidi sono ricche fonti di proteine ​​(25 percento), lipidi (47 percento) e carboidrati (16 percento), oltre a minerali, vitamine, niacina, acidi grassi insaturi e acidi andoleici [20]. Sono consumati come prodotti non trasformati o trasformati, inclusi noci, burro e olio da cucina. Si stima che la produzione mondiale di arachidi ammonti a 4,1 milioni di tonnellate in totale e che il guscio dell'arachide rappresenti il ​​35% ~ 40% del peso totale dell'arachide [21]. Si stima che più di 1,5 milioni di tonnellate di gusci di arachidi vengano scartati ogni anno come sottoprodotti. Tuttavia, dato che solo una parte dei gusci di arachidi viene utilizzata come mangime per animali e che la maggior parte di essi viene incenerita o messa in discarica, causando costi di smaltimento e problemi ambientali, è necessario produrre materiali ad alto valore aggiunto utilizzando gusci di arachidi per superare il problema dei sottoprodotti [22] ]. Precedenti studi sugli antiossidanti hanno dimostrato che sono state riportate attività antinfiammatorie e antiobesità degli estratti di buccia di arachidi [23,24]. Tuttavia, finora, non ci sono ricerche sulla produzione di materiali cosmetici funzionali per il miglioramentosbiancamentoe gli effetti antirughe utilizzando composti bioattivi dai gusci di arachidi. Pertanto, questo studio ha estratto composti bioattivi da un guscio di arachidi impiegando l'estrazione assistita da ultrasuoni (UAE) per confermare i loro effetti antiossidanti, sbiancanti e antirughe e ha inoltre presentato una condizione ottimale degli Emirati Arabi Uniti utilizzando il metodo della superficie di risposta (RSM) e ha aumentato la funzionalità degli estratti al fine di confermare la possibilità del suo utilizzo come ingredienti alimentari, cosmetici e medicinali.

2. Risultati e discussione

2.1. Montaggio dei modelli RSM

In questo lavoro, la temperatura di estrazione, il tempo di estrazione e la concentrazione di etanolo sono stati selezionati come variabili principali del CCD utilizzando l'esperimento preliminare un fattore alla volta per determinare le variabili significative che interessano gli Emirati Arabi Uniti (Tabella 1).

Quindi, sono state costruite 17 prove sperimentali, di cui 3 repliche nel punto centrale utilizzando variabili 3- e CCD a 5 livelli. Gli errori sperimentali sono stati ridotti al minimo randomizzando l'ordine sperimentale al fine di ridurre al minimo l'impatto della variabilità inspiegabile. I risultati sperimentali e previsti per l'attività di scavenging radicale (RSA) DPPH,tirosinasil'inibizione dell'attività (TAI) e l'inibizione dell'attività della collagenasi (CAI) sono mostrate nella Tabella 2.

Per determinare la correlazione tra le 17 esecuzioni sperimentali delle condizioni sperimentali CCD ei risultati sperimentali, sono stati proposti modelli di regressione multipla per prevedere i livelli ottimali di queste 3 variabili. Applicando l'analisi di regressione multipla ai dati sperimentali, le variabili dipendenti (Y) e le variabili testate sono state correlate dalle seguenti equazioni di regressione quadratica (Tabella 3).

L'analisi della varianza (ANOVA) è un test statistico per l'analisi dei dati sperimentali. Suddivide la variazione totale in un set di dati in parti componenti associate a specifiche fonti di variazione al fine di verificare un'ipotesi sulle variabili del modello o di stimare le componenti della varianza [25]. L'analisi della superficie di risposta e l'ANOVA sono state impiegate per determinare i coefficienti, valutare la significatività statistica dei termini del modello e adattare i modelli matematici dei dati sperimentali che miravano a ottimizzare la regione complessiva per le variabili di risposta [26]. Come stabilito dal modello, i coefficienti di correlazione (R2) utilizzati per determinare la relazione tra le risposte sperimentali e previste dai modelli di regressione erano nell'intervallo 0.8862~0.9622. Ciò suggerisce che le variabili di processo analizzate spiegano più dell'88,6 percento delle variabili indipendenti. Il software Design-Expert è stato utilizzato per calcolare i coefficienti delle equazioni di regressione quadratica e l'idoneità del modello è stata testata da ANOVA. Secondo il valore del coefficiente monomio, le equazioni di regressione quadratica sono elencate nella Tabella 4 e l'ordine di priorità tra gli effetti principali delle variabili indipendenti è la concentrazione di etanolo (X3) > temperatura di estrazione (X2) > tempo di estrazione (X1).

2.2. Effetto delle condizioni di estrazione su RSA

La tabella 2 mostra i dati sperimentali dell'RSA in base alle diverse condizioni degli Emirati Arabi Uniti. L'RSA dell'estratto di guscio di arachidi è stato determinato nell'intervallo del 7,6% ~ 89,9%. L'RSA più alto è stato identificato nelle seguenti condizioni di estrazione: tempo di estrazione di 55.0 min, temperatura di estrazione di 60.{{10}} ◦C e concentrazione di etanolo di 5 0.0 percento (corsa n. 10). L'RSA più basso del 7,6 percento, in un tempo di estrazione di 30.0 min, temperatura di estrazione di 60,0 ◦C e concentrazione di etanolo dello 0,0 percento, è stato identificato come valore sperimentale (Run n. 13) . Applicando l'analisi di regressione multipla, i dati sperimentali e le risposte sono stati correlati mediante equazioni di regressione quadratica (Tabella 3). L'analisi statistica ha rivelato che R2 del modello di regressione era 0,9308 (p=0.0027), il che indica che questa equazione potrebbe spiegare il 93,0 percento dei risultati delle condizioni sperimentali, il che implica che il modello era altamente significativo e poteva essere utilizzato per prevedere con precisione la funzione di risposta.

L'effetto di una singola variabile degli Emirati Arabi Uniti a livelli fissi di altre variabili sulla RSA è previsto e mostrato nella Figura 1a. RSA tende ad aumentare e quindi diminuire all'aumentare di tutte le variabili UAE. La concentrazione di etanolo ha avuto l'effetto maggiore sull'RSA tra le tre variabili degli Emirati Arabi Uniti, mentre il tempo di estrazione e la temperatura di estrazione hanno avuto l'effetto minore sull'RSA. Questo risultato è coerente con i risultati dell'ANOVA in cui la concentrazione di etanolo ha mostrato un effetto più significativo (p=0.0002) su RSA come mostrato nella Tabella 4. L'effetto di interazione tra variabili indipendenti su RSA è stato visualizzato utilizzando 3D curve di superficie di risposta. La temperatura di estrazione e il tempo di estrazione sono stati modificati simultaneamente al livello fisso di concentrazione di etanolo (Figura 2A). All'aumentare delle due variabili (temperatura di estrazione e tempo), RSA è aumentata al livello massimo e quindi è nuovamente diminuita. L'RSA più alto è stato ottenuto ad una temperatura di estrazione di 56,1 ◦C, il che suggerisce quindi che l'estrazione di composti bioattivi con potenziali antiossidanti, come i polifenoli, aumenta con la distruzione dei componenti della parete vegetale, come la lignina, a temperature fino a 56,1 ◦C; tuttavia, a temperature più elevate, RSA è stata ridotta a causa della decomposizione o polimerizzazione degli ingredienti antiossidanti. Le figure 2B, C mostrano che l'RSA non è stato influenzato in modo significativo dal tempo o dalla temperatura di estrazione, mentre l'RSA è stato influenzato in modo significativo dalla concentrazione di etanolo, che era la più alta alla concentrazione di etanolo del 61,0 percento e che è anche diminuita di nuovo. Questo risultato è coerente con quello dell'esperimento di estrazione con acqua calda di Lespedeza cuneata di Kim et al. in cui RSA era più influenzato dalla concentrazione di etanolo rispetto alla temperatura di estrazione e RSA era il massimo all'intervallo di concentrazione di etanolo del 60% ~ 70% [27]. Questi risultati indicano che l'efficienza di estrazione del solvente binario (acqua ed etanolo) è più efficace per l'estrazione con solvente singolo negli Emirati Arabi Uniti di gusci di arachidi.

2.3. Effetto delle condizioni di estrazione su TAI

tirosinasiè un enzima che promuove la produzione di melanina ossidando la tirosina nello strato basale dell'epidermide e l'inibizione di questo enzima è essenziale per il potenziamentosbiancamento della pelle [28]. The TAI of peanut shell extracted via UAE, according to 17 extraction conditions, ranged from 0.34% to 51.8% (Table 2). Based on experimental values, the relationship between independent variables (X1, X2, X3) and the dependent variable (TAI) was modeled using quadratic regression equations as shown in Table 3. To evaluate the agreement between the experimental and predicted values derived by the quadratic regression models, the goodness-of-fit of the model was evaluated based on ANOVA. The R2 was 0.9622, which is close to 1 and indicates a high degree of correlation between the experimental and predicted values. p-value is used as a tool to evaluate the significance of each coefficient and interactions between each independent variable. The UAE variables will be more significant if the p-value becomes smaller and significance was confirmed at the level of p < 0.05 [29,30]. In evaluating the effects of independent variables, the significance was determined in the order of ethanol concentration (p < 0.0001) >temperatura di estrazione (p <{0}}.0598) > tempo di estrazione (p <0,4329), che ha confermato che l'effetto della concentrazione di etanolo era il più significativo in TAI.

Per confrontare l'effetto delle condizioni degli Emirati Arabi Uniti sul TAI, è stato utilizzato il grafico perturbativo per valutare l'effetto delle singole variabili sul TAI fissando due variabili al centro. Come mostrato nella Figura 1b, TAI ha mostrato un modello diverso rispetto al precedente esperimento RSA; è aumentato all'aumentare della concentrazione di etanolo, mentre il tempo di estrazione non ha influenzato in modo significativo la TAI. Il significativo aumento proporzionale di TAI con la concentrazione di etanolo può essere spiegato dai risultati dell'ANOVA. La TAI è stata significativamente influenzata dal termine primario di concentrazione di etanolo (X3) e (p < 0.05)="" il="" termine="" quadratico="" non="" è="" statisticamente="" significativo,="" quindi="" mostra="" una="" forte="" relazione="" proporzionale="" tra="" tai="" e="" concentrazione="" di="" etanolo.="" la="" curva="" della="" superficie="" di="" risposta="" 3d="" è="" la="" rappresentazione="" grafica="" dell'equazione="" di="" regressione="" quadratica="" e="" dei="" risultati="" di="" tai,="" influenzati="" dalla="" temperatura="" di="" estrazione="" (x1),="" dal="" tempo="" di="" estrazione="" (x2)="" e="" dalla="" concentrazione="" di="" etanolo="" (x3).="" la="" figura="" 3a="" visualizza="" l'effetto="" di="" interazione="" del="" tempo="" di="" estrazione="" e="" della="" concentrazione="" di="" etanolo="" su="" tai.="" il="" risultato="" ha="" confermato="" che="" il="" tempo="" di="" estrazione="" non="" ha="" mostrato="" effetti="" significativi="" sulla="" tai,="" mentre="" la="" concentrazione="" di="" etanolo="" ha="" avuto="" una="" forte="" relazione="" proporzionale="" con="" la="" tai.="" allo="" stesso="" modo,="" come="" mostrato="" nella="" figura="" 3b,="" il="" tai="" era="" più="" dipendente="" dalla="" concentrazione="" di="" etanolo="" che="" dalla="" temperatura="" di="" estrazione="" e="" il="" tai="" più="" alto="" è="" stato="" raggiunto="" quando="" la="" concentrazione="" di="" etanolo="" è="" aumentata="" al="" 99,5%.="" nell'esplorazione="" delle="" condizioni="" degli="" emirati="" arabi="" uniti="" con="" il="" tai="" massimo,="" si="" prevedeva="" che="" i="" valori="" massimi="" delle="" condizioni="" tai="" fossero="" 3{{20}},0="" min,="" 26,3="" ◦c="" e="" 99,5%.="" questo="" risultato="" è="" simile="" a="" quello="" riportato="" da="" nakamura="" et="" al.="" [31]="" in="" uno="" studio="" sull'attività="" biologica="" delle="" foglie="" di="" cedro,="" quando="" il="" 20,0%="" ~="" 80,0%="" di="" etanolo="" è="" stato="" utilizzato="" come="" solvente="" di="" estrazione,="" il="" tai="" è="" aumentato="" in="" proporzione="" in="" risposta="" all'aumento="" della="" concentrazione="" di="" etanolo="" e="" ha="" mostrato="" il="" valore="" massimo="" nell'estrazione="" utilizzando="" l'80%="" di="" etanolo.="" ciò="" suggerisce="" che="" l'uso="" di="" una="" concentrazione="" più="" elevata="" di="" etanolo="" è="" vantaggioso="" nell'estrazione="" di="" composti="" bioattivi="">sbiancamento della pelleeffetto da gusci di arachidi o altre piante.

2.4. Effetto delle Condizioni di Estrazione sul CAI

Collagen is the most abundant protein in mammals and the main structural component of the extracellular matrix with gly-pro-hyp repeating units longer than 1400 amino acids. Collagenase is an enzyme that breaks down peptide bonds of collagen that form skin, bones, tendons, and ligaments. The collagen present in the dermis is decomposed by collagenase, which causes skin wrinkles and reduces skin elasticity; therefore, it is necessary to reduce the activity of collagenase to prevent skin wrinkles [32,33]. The optimization of the UAE condition was performed to maximize the CAI of peanut shell extract. A total of 17 runs were needed for optimizing the three individual variables and the experimental data of CAI obtained under experimental sets were 25.2%~92.3% (Table 2). Based on the 17 experimental runs, by applying multiple regression analysis on the experimental data, response and independent variables were related by the following quadratic regression equation in terms of the coded parameters given in Table 3. Then, ANOVA was applied to determine the regression coefficients, statistical significance, and to fit the mathematical models. The mean-square values were calculated by dividing the sum of the squares of each variation source by their degrees of freedom, and a 95% confidence level (α = 0.05) was applied to determine the statistical significance in the analysis of the quadratic model. The ANOVA results confirmed that R2 of the quadratic regression equation was 0.8862 and that the p-value was 0.0134, which is less than the significance level (p < 0.05), thus indicating a good model of fit and statistical significance for predicting CAI values. In the primary term, the X2 and X3 showed significant effects and the interaction effect terms were significant in the X1X2 and X2X3 (p < 0.05). The effect of UAE conditions on CAI production was confirmed to be in the order of: extraction temperature (p = 0.0236) >concentrazione di etanolo (p=0.0240) > tempo di estrazione (p=0.8505), indicando così che l'effetto della temperatura di estrazione e della concentrazione di etanolo erano significativi sul CAI.

La figura 1c mostra un grafico perturbativo in cui sono fissate due variabili e visualizza l'effetto di una singola variabile su CAI. Gli effetti di tutte e tre le variabili sulla CAI si sono dimostrate simili e le tre variabili hanno mostrato effetti significativi e aumentato e successivamente diminuito CAI all'aumentare di ciascuna variabile indipendente. Nel nostro studio, sono state sviluppate curve di risposta alla superficie 3D per visualizzare l'interazione di due variabili indipendenti in CAI utilizzando equazioni di regressione quadratica (Figura 4). Quando la concentrazione di etanolo è stata fissata nel punto centrale, l'effetto del tempo di estrazione e della temperatura su CAI è stato valutato nella Figura 4A. Poiché le due variabili sono cambiate contemporaneamente, il CAI è aumentato a 33,4 min e 76,8 ◦C ed è nuovamente diminuito dopo un CAI massimo del 92,8%. Come mostrato nella Figura 4B, C, CAI aveva il valore più alto alla concentrazione di etanolo del 64,3 percento, mostrando una tendenza alla diminuzione graduale in seguito, il che suggerisce che un solvente binario costituito dal 64,3 percento di etanolo è più adatto come solvente di estrazione. Questo risultato è coerente con una ricerca precedente che riportava che un solvente binario di acqua ed etanolo mostrava un CAI maggiore dell'acqua nell'estrazione di composti bioattivi da Orostachys japonica, il che suggerisce che il 50 percento di etanolo sarebbe più vantaggioso nell'estrazionesbiancamento della pelleingredienti [34]. Il CAI massimo dell'estratto di guscio di arachidi previsto dal modello di regressione quadratica era del 94,5%, ottenuto in condizioni di tempo di estrazione di 45,1 min, temperatura di estrazione di 93,6°C e concentrazione di etanolo del 42,3%. Il CAI ottenuto nel nostro studio è stato del 94,5 percento, che è più del doppio degli effetti del 39,4 percento e del 40,3 percento dei valori CAI degli estratti di tè verde riportati da Oh et al. [35].

2.5. Condizioni di estrazione ottimali

antiossidante,sbiancamento della pellee gli effetti antirughe sono tutte funzioni importanti per i cosmetici ed è necessario derivare condizioni che possano massimizzare queste tre funzioni contemporaneamente nell'ottimizzazione delle condizioni degli Emirati Arabi Uniti. La Figura 5 mostra una procedura di ottimizzazione che può massimizzare contemporaneamente RSA (Y1), TAI (Y2) e CAI (Y3) sovrapponendo ciascuna condizione ottimale di un grafico di contorno derivato tramite un'equazione di regressione quadratica. Gli intervalli di variabili indipendenti per l'ottimizzazione di tre variabili sono stati limitati al tempo di estrazione di 5.0~55.0 min, temperatura di estrazione di 26.{{1{12}}}}~94 .0 ◦C e concentrazione di etanolo di 0,0 percento ~99,5 percento (Tabella 5). In base alle condizioni di estrazione ottimali individuali, le condizioni ottimali degli Emirati Arabi Uniti erano 31,2 minuti di tempo di estrazione, 36,6 ◦C di temperatura di estrazione, 93,2% di concentrazione di etanolo e, nelle condizioni di cui sopra, RSA del 74,9%, TAI del 50,6% e CAI di È stato previsto 86.8 percento. Quando i valori RSA, TAI e CAI previsti sono stati confrontati con quelli ottenuti dall'esperimento per la convalida, i valori del test di convalida erano simili a quelli dei valori previsti, dove i valori erano rispettivamente del 78,2%, 52,3% e 87,7%.

2.6. Confronto tra SE e UAE

Per confermare l'efficacia dell'estrazione degli Emirati Arabi Uniti, confrontiamo RSA, TAI e CAI di estratto di guscio di arachidi prodotto utilizzando le tecniche di estrazione degli Emirati Arabi Uniti e Soxhlet (SE). Quando il SE è stato condotto in condizioni generali di SE utilizzando etanolo al 99,5% a 70 ◦C per 4 ore di tempo di estrazione, RSA, TAI e CAI sono risultati essere 75,5%, 60,2% e 74,4%, che non erano molto diverso dai risultati ottenuti in condizioni ottimali degli Emirati Arabi Uniti. Tuttavia, quando le condizioni SE sono state impostate uguali alle condizioni ottimali degli Emirati Arabi Uniti di 31,2 minuti e 93,2 percento di etanolo, RSA, TAI e CAI sono diminuite rispettivamente del 62,0, 28,3 e 45,6 percento, rispetto agli Emirati Arabi Uniti in condizioni ottimali. Il vantaggio degli ultrasuoni nella produzione di materiali utili dai gusci di arachidi è stato valutato come un processo adatto per un'elevata produttività e industrializzazione grazie al basso consumo di solvente e ai brevi tempi di estrazione.

2.7. Espressione mRNA di MMP-3 e TRP-1

Nei melanociti dei mammiferi, la melanogenesi e l'idrolisi del collagene sono controllate rispettivamente dai geni TRP e MMP e TRP{{0}} e MMP-3 sono noti come i geni principali per la regolazione della melanogenesi e dell'idrolisi del collagene; pertanto, è stata eseguita l'analisi RT-PCR su lisati cellulari interi di cellule B16-F{18}} e l'effetto dell'estratto di guscio di arachidi prodotto dagli Emirati Arabi Uniti in condizioni ottimali (31,2 min, 36,6 gradi, 93,2 percento) sull'espressione di mRNA di MMP-3 e TRP-1 è stata studiata. Come mostra la Figura 6, l'estratto di guscio di arachidi ha sottoregolato in modo significativo l'espressione di MMP-3 e TRP-1 nelle cellule B16-F0 quando gli esperimenti di espressione genica sono stati eseguiti con un'arachide intervallo di concentrazione dell'estratto di guscio di 0~1 mg/mL. L'estratto di guscio di arachidi ha ridotto significativamente l'espressione MMP-3 e TRP-1 di 6.{24}}volte e 8.{26}}volte, rispettivamente, a 1.0 mg /ml. Questi risultati suggeriscono che l'estratto di guscio di arachidi inibisce la degradazione del collagene nelle cellule B16F0 dall'inattivazione dell'MMP 3 all'inattivazione dell'MMP-1 e interferisce con la cooperazione dell'MMP-9 [36]. Studi esistenti hanno dimostrato che il trattamento con estratti vegetali ha inibito l'espressione del fattore di trascrizione associato alla microftalmia (MITF) fosforilando la protein chinasi extracellulare regolata dal segnale (ERK). Pertanto, l'effetto inibitorio della produzione di melanina da parte dell'estratto di guscio di arachidi è attribuito all'inibizione ditirosinasiattività attraverso l'inibizione dell'espressione di ERK e MITF [37]. Pertanto, gli estratti di guscio di arachidi hanno ridotto i livelli di espressione dell'mRNA di TRP-1 e MMP-3, il che indica che l'estratto di guscio di arachidi possiede forti attività inibitorie sulla collagenolisi e sulla melanogenesi, rendendolo un eccellente materiale cosmetico consbiancamento della pelleed effetti antirughe.

3. Materiali e metodi

3.1. Materiali e reagenti

I gusci di arachidi sono stati acquistati dal mercato di Nonghyup (Gochang, Jeonbuk, Corea) il 2 marzo019 e i gusci sono stati essiccati a 60 ◦C utilizzando un forno a secco (FC 49, Lab House, Seoul, Corea) per 24 ore fino al il peso a secco è rimasto costante. I gusci di arachidi essiccati sono stati polverizzati utilizzando un robot da cucina (Hanil HMF-3800, Seoul, Corea) e quindi passati attraverso un setaccio da 600 µm. L'etanolo è stato acquistato da Samchun Chemical (95,0% v/v, Seoul, Corea). Il reagente Folin-Ciocalteu, l'acido gallico (97%) e la quercetina sono stati acquistati da Merck (Kenilworth, NJ, USA). 2,2-difenil{11}}picrylidrazyl (DPPH), acido ascorbico e 3,4-diidrossi-L-fenilalanina (L-DOPA) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Tutte le altre sostanze chimiche utilizzate in questo esperimento erano di grado analitico e acquistate da Sigma-Aldrich. Tutte le soluzioni stock sono state preparate mediante acqua deionizzata purificata utilizzando un sistema di purificazione Milli-Q (Millipore, Burlington, VT, USA).

3.2. Estrazione assistita da ultrasuoni ed Estrazione Soxhlet

Il guscio di arachidi in polvere (1 g) è stato posto in un recipiente di estrazione, ciascuno con 10 ml di solvente e miscelato utilizzando un miscelatore a vortice (VM-10, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Corea) per 1 minuto. L'estrazione è stata effettuata facendo circolare l'acqua nell'estrattore ad ultrasuoni (250 W, SD-D250H, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Corea) utilizzando un circolatore a bagno refrigerato esterno (CDRC8, Daihan Scientific Co., Ltd., Wonju, Corea ) con un timer digitale e un regolatore di temperatura. L'estrazione è stata eseguita con il dispositivo ad ultrasuoni dotato di un timer digitale e di un termoregolatore. Il campione è stato sonicato per varie durate sperimentali e temperature a una frequenza di lavoro di 40 kHz. Quindi, l'estratto è stato centrifugato a 10,{10}} rpm per 10 minuti (236R, Labogene, Seoul, Corea). Dopo la centrifugazione, i volumi del campione sono stati portati a 5 mL e filtrati attraverso un filtro a membrana da 0,2 µm prima dell'analisi. Per l'estrazione Soxhlet, il guscio di arachidi in polvere (5 g) è stato estratto continuamente con 100 mL usando etanolo al 99,5 percento per 4 ore (8 cicli) a una temperatura massima di 70°C in un apparato Soxhlet. La tecnica di estrazione assistita da ultrasuoni si è rivelata molto efficiente nell'estrazione dell'olio dai vinaccioli il vantaggio degli ultrasuoni, rispetto ai metodi di estrazione convenzionali sia per l'olio che per i polifenoli, era simile in quanto la resa in olio/polifenoli ottenuta con un minor consumo di solvente e un minor consumo di tempo di estrazione.

3.3. Design sperimentale

Il disegno sperimentale è stato eseguito utilizzando CCD, un tipo di RSM per ridurre al minimo il numero di prove sperimentali e studiare l'interazione tra i fattori. Il software Design-Expert® 8.0 (State-Ease, City, MN, USA) è stato utilizzato per la progettazione di esperimenti, l'analisi dei dati e l'ottimizzazione delle condizioni di estrazione per la massimizzazione dell'estrazione di composti bioattivi aventi proprietà antiossidanti,sbiancamento della pellee gli effetti antirughe del guscio di arachidi. Gli esperimenti sono stati progettati secondo CCD, i valori dell'intervallo e del punto centrale di tre variabili indipendenti presentate erano basati sui risultati degli esperimenti preliminari (Tabella 1). Il CCD è stato applicato per prevedere le condizioni ottimali degli Emirati Arabi Uniti per la massimizzazione delle risposte tra cui RSA, TAI e CAI dai gusci di arachidi. Come variabili indipendenti, le tre variabili scelte erano tempo di estrazione (X1), temperatura di estrazione (X2) e concentrazione di etanolo (X3). Un totale di 17 corse sperimentali sono state generate con tre repliche nei punti centrali per stimare la riproducibilità. Il modello di regressione quadratica è stato utilizzato per adattare i dati sperimentali e applicato per prevedere le variabili di risposta, come mostrato nell'equazione (1):

Y= 0 più 1X1 più 2X2 più 3X3 più 11X12 più 22X22 più 33X32 più 12X1X2 più 13X1X3 più 23X2X3 (1)

dove Y è la risposta prevista; 0 è la costante (intercetta); 1, 2 e 3 sono i coefficienti di regressione per i termini dell'effetto lineare; 11, 22 e 33 sono i termini dell'effetto quadratico; e 12, 13 e 23 sono rispettivamente i termini dell'effetto di interazione. Un'analisi della superficie di risposta e l'ANOVA sono stati impiegati per determinare i coefficienti di regressione e la significatività statistica dei termini del modello e per adattarsi ai modelli matematici dello sperimentale [38].

3.4. DPPH Attività di scavenging radicale (RSA)

RSA dell'estratto di guscio di arachidi è stato descritto da Pereira-Caro et al. [39]. È stata preparata una soluzione di 0.0 1 mM di DPPH in metanolo (95 percento) e 1,25 mL sono stati aggiunti a 0,25 mL di estratto diluito. RSA è stato determinato per misurare l'assorbanza a 517 nm utilizzando il visspettrofotometro UV (UV1650PC, Shimadzu, Kyoto, Giappone) dopo 20 minuti di incubazione. Il bianco è stato preparato utilizzando acqua distillata e l'RSA è stato calcolato secondo quanto segue.(Equazione (2)):

RSA ( percentuale )={1 -Abs (campione) /Abs (controllo) }× 100 (2)

3.5. Inibizione dell'attività della tirosinasi (TAI)

TAI è stato eseguito secondo il metodo modificato utilizzando L-DOPA come substrato da Jo et al. [40]. I campioni sono stati miscelati con 200 µL di L-DOPA e 200 µL di tampone fosfato di potassio (pH 6,8) e 200 µL ditirosinasi(125 U/mL) è stato aggiunto nella provetta e incubato a 37°C per 20 min. L'assorbanza del campione è stata misurata a 475 nm utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis e i risultati sono stati confrontati con il controllo. Per ciascuna concentrazione, l'attività enzimatica è stata calcolata come percentuale rispetto a quella del dosaggio utilizzando un tampone senza alcun inibitore e la TAI è stata calcolata in base alla seguente formula. (Equazione (3)):

TAI ( percentuale )={1 −Abs (controllo) − Abs (campione) /Abs (controllo)}× 100 (3)

dove Abs (controllo) è l'assorbimento del tampone più collagenasi; Abs (campione) è l'assorbanza del tampone più collagenasi più campione/standard.

3.6. Inibizione dell'attività della collagenasi (CAI)

La misurazione del CAI degli estratti è stata effettuata modificando i metodi di Wünsch e Heindrich [41]. Il substrato, 4-phenylazobezyloxylcarbonyl-Pro-Leu-Gly Pro-Arg (FALGPA), è stato sciolto in 10 mL di tampone a 1,2 mg/mL e quindi sono stati aggiunti 125 µL di soluzione e incubati per 60 minuti a 37 ◦C. La collagenasi è stata disciolta nel tampone a 0,4 mg/ml e alla soluzione tampone sono stati aggiunti 75 µl di soluzione enzimatica. La miscela enzima-substrato è stata incubata in un bagno d'acqua a 37°C per 30 minuti e la reazione è stata interrotta aggiungendo 75 µL di acido citrico al 20% (p/v). Dopo l'aggiunta di 1,5 mL di acetato di etile, lo strato di acetato di etile è stato separato e l'assorbanza è stata misurata a 320 nm. La percentuale di inibizione è stata calcolata secondo la formula seguente.

CAI ( percentuale )={1 − [Abs (controllo) − Abs (campione)] /Abs (controllo)}× 100 (4)

dove Abs (controllo) è l'assorbimento del tampone più collagenasi; Abs (campione) è l'assorbanza del tampone più collagenasi più campione/standard.

3.7. Manutenzione e Coltivazione di Linee Cellulari

La cellula di melanoma B16-F0 che produce melanina è stata ottenuta dalla Korea Cell Line Bank (KCLB, Chongno, Seoul, Corea) ed è stata coltivata nel mezzo Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) integrato con siero bovino fetale (FBS, 10 percento, Welgene, Gyeongsan, Corea) e soluzione antibiotica di penicillina-streptomicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). La tripsina-EDTA (Gibco, Grand Island, NY, USA) è stata utilizzata per la tripsinizzazione delle cellule. Tutti i materiali utilizzati erano di grado di coltura cellulare.

3.8. Reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR)

La RT-PCR è stata eseguita per misurare i cambiamenti nei livelli di espressione genica MMP-3 e TRP-1 associati asbiancamentoed effetti antirughe, le cellule B16-F0 sono state coltivate in una24-piastra a pozzetti trattate con le diverse concentrazioni di estratto di guscio di arachidi in DMEM privo di siero e incubate per 24 ore. Il controllo cellulare non trattato è stato mantenuto nelle stesse condizioni del gruppo testato durante l'esperimento. L'isolamento dell'RNA dalle cellule è stato condotto utilizzando il kit di estrazione dell'RNA universale AccuPrep® (Bioneer, Daejeon, Corea). Il DNA complementare è stato sintetizzato utilizzando la sintesi del cDNA del platino AmfiRiert MasterMix (GenDEPOT, Barker, TX, USA). L'analisi RT-PCR è stata eseguita utilizzando il sistema CFX 96 touch PCR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) per determinare i livelli di mRNA. I primer utilizzati erano i seguenti: MMP-3 senso, {{10}}AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-30 e antisenso, 50-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-30; e TRP-1 senso, 50-GCGTGCAGGAGCCTTCTTTCTC 30 e antisenso, 50-AAGACGCTGCACTGCTGGTCT-30. Un set appropriato di primer sopra menzionato è stato utilizzato per amplificare i rispettivi geni utilizzando le seguenti condizioni di ciclo: 94 ◦C per 5 minuti, seguiti da 25 cicli a 95 ◦C per 5 s, 60 ◦C per 30 s (forMMP-3) e 60 ◦C per 30 s (per TRP-1) e 72 ◦C per 30 s di estensione. I prodotti della PCR sono stati sottoposti a elettroforesi su un gel di agarosio all'1%, colorati con bromuro di etidio e visualizzati utilizzando il software Gel Doc TM XR plus System e Quantity One 2.0 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Una proteina di pulizia, -actina, è stata utilizzata come controllo del carico con il presupposto che i livelli di espressione di queste proteine ​​rimangano costanti.

4. Conclusioni

In questo studio, l'approccio complementare è stato impiegato per il recupero e l'uso di sostanze bioattive dai sottoprodotti agricoli dei gusci di arachidi per sviluppare ingredienti a valore aggiunto con molteplici usi. Innanzitutto, abbiamo tentato di aumentare l'efficienza di estrazione dei composti bioattivi con effetti antiossidanti, sbiancanti e antirughe ottimizzando il processo degli Emirati Arabi Uniti. Pertanto, questo studio ha impiegato gli Emirati Arabi Uniti per la produzione efficiente di composti bioattivi consbiancamento della pellee gli effetti antirughe dai gusci di arachidi e l'ottimizzazione basata su statistiche applicate per massimizzare RSA, TAI e CAI contemporaneamente. Le condizioni degli Emirati Arabi Uniti sono state ottimizzate utilizzando CCD ed è stato confermato che la scelta del solvente e della concentrazione dovrebbe essere considerata nell'estrazione di composti bioattivi dai gusci di arachidi. Sovrapponendo le superfici di risposta, le curve di tre variabili dipendenti, un tempo di estrazione di 31,2 min, una temperatura di estrazione di 36,6 ◦C e una concentrazione di etanolo del 93,2 percento sono state determinate come condizioni ottimali degli Emirati Arabi Uniti. È stato confermato che l'RSA degli estratti di gusci di arachidi è molto elevato e ci si può aspettare un aumento di TAI e CAI, che sono indicatori disbiancamento della pelleed effetti antirughe, rispettivamente. L'ottimizzazione delle condizioni degli Emirati Arabi Uniti ha confermato un aumento della produzione di sostanze bioattive nei gusci di arachidi e le attività sbiancanti e antirughe dell'estratto di arachidi attraversotirosinasie downregulations dell'attività della collagenasi. Sulla base di ciò, è stato valutato l'effetto dei gusci di arachidi sui livelli di espressione di MMP e TRP per valutare se hanno effetti sbiancanti e antirughe a livello di espressione genica. Gli effetti sbiancanti e antirughe degli estratti di gusci di arachidi sono stati confermati attraverso la downregulation di Espressioni di mRNA nonché l'inibizione delle espressioni proteiche di MMP-3 e TRP-1. Pertanto, l'estratto di guscio di arachidi ha dimostrato di essere efficacesbiancamentoe il miglioramento delle rughe a livello di espressione proteica e genica. L'estratto di guscio di arachidi, che utilizza gli Emirati Arabi Uniti, ha un'elevata attività antiossidante ed eccellenti effetti sbiancanti e antirughe della pelle, conferendo al guscio di arachidi un grande potenziale come cosmetico naturale e ingrediente alimentare. Inoltre, si ritiene che la produzione di composti bioattivi utilizzando gli Emirati Arabi Uniti possa essere applicata al processo di commercializzazione per la produzione di materiali cosmetici, alimentari e farmaceutici, data la maggiore resa di produzione e i ridotti costi di lavorazione rispetto ai processi convenzionali.