Analisi Fitochimica, Anti proliferativa in vitro, Antiossidante Parte 1

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Sfondo:Rumex rothschildianus è l'unico membro di una sezione unica del genere Rumex, nella famiglia Polygonaceae. Questa specie è una rarissima piccola dioica annuale, endemica della Palestina che viene tradizionalmente utilizzata come alimento e per la cura di varie malattie. Pertanto, l'attuale indagine mirava a schermare i costituenti chimici, gli antiossidanti, l'anti-a-amilasi, l'anti-a-glucosidasi, gli effetti anticipati e citotossici di quattro frazioni di solventi delle foglie di R. rothschildianus.

Metodi:La polvere secca delle foglie di R. rothschildianus è stata estratta in quattro solventi con diverse polarità. Sono stati eseguiti diversi test fitochimici qualitativi e quantitativi per determinare i componenti degli estratti. L'analisi colorimetrica è stata utilizzata per la determinazione quantitativa di fenoli, flavonoidi e tannini. Sono stati eseguiti saggi in vitro per valutare gli estratti di antiossidanti, anti-a-amilasi, anti-a-glucosidasi e anticipare le attività inibitorie, nonché la citotossicità mediante test MTS contro la linea cellulare di carcinoma cervicale (HeLa) e la linea cellulare di cancro al seno (MCF7).

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Risultati:La frazione acetonica delle foglie di R. rothschildianus ha mostrato la più significativaantiossidanteattività, a causa del più alto contenuto di flavonoidi e fenolici, con un valore di ICso di 6,3±0,4 ug/ml, rispetto a 3,1±0,9 ug/ml di Trolox, e per quanto riguarda attività di inibizione della lipasi La frazione di acetone ha mostrato l'attività più potente con un valore di ICso di 26,3±{{10}},6 ug/ml, rispetto al controllo positivo di orlistat ICso 12,3 ug/ml. Lo stesso estratto era l'inibitore più potente dell'a-amilasi e dell'a-glucosidasi, con valori di ICso rispettivamente di 19,1±0,7 ug/ml e 54,9±0,3 ug/ml, rispetto rispettivamente a 28,8, 37,1±0,3 ug/e di acarbosio. La frazione esano ha mostrato un'inibizione del 99,9% delle cellule HeLa e un'inibizione del 97,4% per le cellule MCF7.

Conclusione:La frazione acetonica delle foglie di R. rothschildianus potrebbe fornire una fonte di composti bioattivi per il trattamento dello stress ossidativo. Allo stesso modo, la frazione esano indica il promettente potenziale antitumorale di R. rothschildianus. Chiaramente, queste indicazioni iniziali necessitano di un'ulteriore purificazione dei composti potenzialmente attivi e, in definitiva, di studi in vivo per determinarne l'efficacia.

Parole chiave:Rumex rothschildianus, Antiossidante, Lipasi, Amilasi, Trolox, Fitochimica, Attività antiproliferativa

Sfondo

Le piante sono state utilizzate come terapie fin dai tempi antichi. Radici, semi, corteccia, foglie e fiori sono stati tutti usati per scopi riparatori. Al giorno d'oggi, le medicine di sintesi sono disponibili e sono efficaci nel trattamento di un'ampia gamma di malattie; tuttavia, alcune persone preferiscono ancora le medicine a base di erbe poiché sono considerate meno dannose per il corpo umano [1,2]. Le piante medicinali sono per definizione la fonte di composti fitochimici che possiedono attività terapeutiche. Queste proprietà dipendono dalla presenza di diversi metaboliti secondari, come fenolici, terpenoidi e alcaloidi [3]. Rumex rothschildianus Aarons. è l'unico membro di una sezione unica del genere Rumex, nella famiglia Polygonaceae. Questa specie è una rarissima piccola dioica annuale, endemica in Palestina. Ha un'altezza media di 45 cm ed è caratterizzato da fusti eretti che sorreggono foglie radicaliche picciolate, che sono corti alla base e corto-acuminate all'apice. I fiori hanno un diametro di 3-4 mm, mentre i fiori pistillati hanno un diametro di circa 2 mm con uno strato membranoso coriaceo [4]. Rumex spp. sono diffusi in diverse regioni della Turchia e sono rappresentati da 22 specie. Alcune delle specie più comuni sono R.patientia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus e R. caucasicus sono piante perenni distribuite nell'Anatolia centrale e orientale a un'altitudine di {{10 }} m sul livello del mare. Il genere Rumex è stato ampiamente utilizzato nella medicina tradizionale in Turchia per il trattamento di disturbi come costipazione, diarrea ed eczema [5, 6]. Il genere ha anche alcuni effetti lassativi, diuretici, antipiretici, cicatrizzanti e antinfiammatori. Molte persone nella parte orientale della Turchia utilizzano le foglie giovani di Rumex spp. come conservante nel formaggio, oltre a conferire aroma al cibo [7].

È stata condotta una serie di ricerche sulle specie Rumex, come le attività antimicrobiche segnalate per alcune specie. Alcuni fitochimici bioattivi sono stati precedentemente trovati in Rumex vicario L, come carotenoidi, tocoferoli, polifenoli, flavonoidi e acido ascorbico, che hanno un ruolo come antiossidanti e agenti disintossicanti naturali. L'assunzione con la dieta di sostanze fitochimiche antiossidanti, come i carotenoidi,fenolici, eflavonoidipuò proteggere da malattie non trasmissibili nell'uomo, come cancro, disturbi cardiovascolari e altri problemi di salute legati allo stress ossidativo [5, 8]. È noto che i radicali liberi dannosi svolgono un ruolo importante in molti dei principali problemi di salute, come cancro, malattie cardiovascolari, artrite reumatoide, cataratta,Il morbo di Alzheimere altre malattie degenerative legate all'invecchiamento. Gli antiossidanti sono componenti benefici che neutralizzano questi radicali liberi prima che possano attaccare le cellule e quindi prevengono i danni alle proteine ​​cellulari, ai lipidi ecarboidrati. Una varietà di antiossidanti naturali e sintetici è stata proposta per il trattamento delle malattie umane. Tale interesse per il ruolo degli antiossidanti nella salute umana ha spinto la ricerca nel campo delle scienze alimentari e delle erbe medicinali, valutando la funzione delle erbe come antiossidanti. L'azione antiossidante comprende la capacità di scavenging dei radicali liberi, l'inibizione della perossidazione lipidica, la capacità di chelazione degli ioni metallici e anche la capacità di riduzione [9,10].

Il cancro è uno dei problemi sanitari più globali. Lo sviluppo e la scoperta di nuovi farmaci antitumorali rimangono estremamente importanti a causa di vari fattori. Questi fattori includono trattamenti che possono causare gravi effetti collaterali o possono essere piuttosto costosi. Le alternative biologicamente più sicure e più convenienti sono ancora altamente auspicabili [11-14].

Diverse specie vegetali sono considerate potenziali fonti di molecole bioattive come l'atropina dalle foglie di Belladonna, la cocaina dalle foglie di coca, la vincristina dalla pianta di Vinca e molte altre che ancora svolgono un ruolo importante nella medicina moderna [15,16].

Utili effetti terapeutici possono derivare dalla miscelazione di prodotti secondari presenti nelle piante medicinali. Questi composti sono per lo più metaboliti secondari, come alcaloidi, steroidi, tannini, flavonoidi e fenolici, che vengono sintetizzati e depositati in parti specifiche di queste piante [17,18]. Il presente studio esamina le attività in vitro anti-a-a-amilasi, anti{5}}glucosidasi, anti-lipasi, anti-proliferativa e antiossidante di diverse frazioni estratte dalle foglie di R. rothschildianus.

Metodi

Materiale vegetale, prodotti chimici e strumenti

Le foglie di R. rothschildianus sono state raccolte dalle regioni occidentali della Palestina, tra febbraio e marzo 2018. Sono state identificate dal Dr. Nidal Jaradat, del Laboratorio di Farmacognosia dell'Università Nazionale di An-Najah, con il codice del campione del voucher Pharm-PCT{{3} }. Tutti i prodotti chimici sono stati acquistati da Sigma-Aldrich. Uno spettrofotometro-UV/Visibile (Jenway degree 7135, Stafford-shire, UK), carte da filtro (Whitman n. 1, Washington, USA), dispositivo shaker (Memmert 531-25-1, Stoccolma, Svezia), apparato rotavap (Heidolph -VV 2000, Schwa-bach, Germania), smerigliatrice (Aero Plus 500 W Mixer Grinder, I01, Wan Chai, Cina), bilancia elettronica (Radwag, AS 220/c/2, Torunska, Polonia), liofilizzatore-BT85 (Tecnologia Millrock, Cina) e crio-essiccatore (tecnologia Millrock, BT85, Kingston, USA).

Preparazione degli estratti e frazionamento

La polvere secca delle foglie di R. rothschildianus è stata estratta aggiungendo solventi in sequenza in base alla loro polarità, iniziando con il solvente non polare esano, quindi acetone (un solvente organico aprotico polare), metanolo (alcol polare) e infine acqua distillata (a solvente protico polare). Per ogni estrazione, circa 25 g di foglie essiccate macinate sono stati posti in 0.51 esano per 72 ore in un dispositivo agitatore a 100 rotazioni al minuto a 25 gradi. In primo luogo, l'esano è stato sostituito con 0,5 L di acetone, quindi successivamente la sostituzione ha comportato volumi equivalenti di metanolo e acqua. Le incubazioni nei solventi erano come descritto sopra per l'esano. Ciascuna frazione organica è stata filtrata e concentrata sotto vuoto su un evaporatore rotante, mentre la frazione acquosa è stata essiccata utilizzando un liofilizzatore. Infine, tutte le frazioni grezze sono state conservate a 4 gradi [19,20].

La resa di ciascuna frazione è stata calcolata utilizzando la seguente formula:

Valutazione fitochimica preliminare

Sono stati effettuati test di screening fitochimico delle foglie di R. rothschildianus in quattro frazioni per identificare i metaboliti secondari attivi. I risultati qualitativi sono stati espressi come (più) per la presenza e (-) per l'assenza di sostanze fitochimiche bioattive[10,21].

Determinazione del contenuto fenolico totale (TPC)

La procedura per determinare il TPC era basata su quella di Cheung et al. Il TPC è stato espresso in milligrammi di equivalenti di acido gallico per grammo di peso secco delle foglie (mg GA/g di peso secco). È stata preparata una soluzione di carbonato di sodio al 7,5 percento appena preparata ponendo 7,5 g di Na2CO3 in un matraccio tarato e regolando il volume a 100 ml con acqua distillata. Una soluzione standard di riferimento (soluzione di acido gallico) è stata preparata sciogliendo 100 mg di acido gallico in acqua distillata fino ad un volume finale di 100 ml. Da questo, è stata eseguita una diluizione seriale per ottenere soluzioni di acido gallico a 100,70,50,40 e 10ug/ml). Le soluzioni madre delle frazioni di foglie sono state preparate sciogliendo 100 mg di estratto vegetale in acqua distillata e regolate ad un volume totale di 100 ml. Le miscele di reazione sono state preparate mescolando 0,5 ml di ciascuna soluzione di frazione con 2,5 ml di reagente di Folin-Ciocalteu al 10%, che è stato sciolto in acqua con 2,5 ml di bicarbonato di sodio al 7,5%. Le provette del campione sono state incubate per 45 minuti a 45 gradi. Quindi, l'assorbanza di ciascuno è stata misurata in uno spettrofotometro a una lunghezza d'onda di 765 nm. I campioni di lavoro sono stati preparati in triplicato per ogni studio analitico, da cui sono stati calcolati i valori medi e di deviazione standard [21].

Determinazione del contenuto totale di flavonoidi (TFC)

Il TFC nelle quattro frazioni fogliari di R. rothschildianus è stato valutato utilizzando una curva di calibrazione della rutina (composto di riferimento standard). I risultati sono stati espressi come milligrammi di rutina equivalente per grammo di peso secco di foglie di estratto (mg RU/g di peso secco). È stata stabilita una curva di calibrazione per la rutina utilizzando diluizioni seriali generate da una soluzione madre di 1{{10}}0 ug/ml. Per preparare la soluzione madre, 10 mg di rutina sono stati sciolti in 10 ml di acqua distillata e quindi diluiti a 100 ml. Successivamente, la soluzione madre è stata diluita per fornire rutina a concentrazioni di 10, 30, 40,50,70 e 100 ug/ml. Per la preparazione della soluzione di lavoro, 0,5 ml di ciascuna frazione di soluzione sono stati miscelati con 3 ml di metanolo, 0,2 ml di AlCl3 al 10%, 0,2 ml di acetato di potassio 1M e 5 ml di acqua distillata, quindi incubati a temperatura ambiente per 30 minuti. I passaggi precedenti sono stati ripetuti per ciascuna delle frazioni, dopodiché è stata misurata l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 415 nm. Per un controllo in bianco, è stata preparata una soluzione di lavoro con acqua distillata al posto dell'estratto del campione. I campioni sono stati preparati in triplicato per ogni studio analitico, da cui sono stati calcolati i valori medi e di deviazione standard [22].

Determinazione del contenuto di tannino totale (TTC) Il protocollo di Sun et al. è stato utilizzato per determinare il TTC nelle quattro frazioni fogliari di R. rothschildianus, essendo la procedura più comunemente utilizzata. La catechina è stata utilizzata come composto di riferimento per costruire una curva di calibrazione. È stato preparato uno stock da 100 ug/ml in metanolo, da cui è stata generata una serie di diluizioni per fornire concentrazioni di catechina di 10, 30, 50,70 e 100 ug/ml. Una soluzione al 4% di vanillina in metanolo è stata preparata di fresco. Le soluzioni madre delle frazioni a 100 ug/ml sono state preparate usando metanolo come solvente. Per la soluzione di lavoro, 0,5 ml di ciascuna soluzione di frazione sono stati miscelati con 3 ml di soluzione di vanillina e 1,5 ml di HCl concentrato. La miscela è stata lasciata riposare per 15 minuti, quindi è stata misurata l'assorbanza a 500 nm, utilizzando una soluzione di lavoro preparata con metanolo al posto dell'estratto del campione come bianco. Tutti i campioni di lavoro sono stati analizzati in triplicato, da cui sono stati calcolati i valori di media e deviazione standard. Il tannino totale in ciascuna frazione è stato espresso in termini di catechine equivalenti (mg di CAE/g peso secco delle foglie)[23].

Metodo dell'attività antiossidante

Per misurare l'attività antiossidante nelle diverse frazioni di foglie di R. rothschildianus è stato utilizzato il test di scavenging dei radicali liberi 2,2-difenil-picrylidrazyl (DPPH). È stata preparata in metanolo una soluzione madre da 1000 ug/ml di ciascuna frazione vegetale. Inoltre è stata preparata anche una soluzione di Trolox da 1000 ug/ml (lo standard di riferimento). Una serie di diluizioni è stata preparata dalle soluzioni madre per ciascuna frazione, fornendo sei diluizioni seriali a 2, 5, 10,20, 50 e 100 ug/ml. Un ml di ciascuna diluizione dell'estratto è stato miscelato con 1 ml 0,002 g/ml di DPPH in metanolo. Un ml di metanolo è stato aggiunto per ottenere un volume di lavoro finale di 3 ml. La soluzione di DPPH è stata preparata al momento, poiché era molto sensibile alla luce. Il controllo in bianco delle concentrazioni della serie era DPPH in metanolo in un rapporto di 1:2, senza l'aggiunta di un estratto. Tutte le soluzioni di lavoro sono state incubate a temperatura ambiente (25 gradi) al buio per circa 30 minuti. Le densità ottiche sono state quindi misurate con uno spettrofotometro a una lunghezza d'onda di 517 nm. La seguente equazione è stata utilizzata per calcolare l'inibizione percentuale di DPPH per ciascuna frazione vegetale, con Trolox come composto standard:

dove Ag è l'assorbanza registrata della soluzione del bianco e Ats è l'assorbanza registrata della soluzione del campione testato [21].

Saggio di inibizione della lipasi pancreatica suina

Sono state prodotte soluzioni stock di 500 ug/ml da ciascuna frazione vegetale con 10 percento di DMSO. Da questi, è stata effettuata una serie di diluizioni di cinque concentrazioni di 50.100.200, 300 e 400 ug/ml. Una soluzione madre da 1 mg/ml di lipasi pancreatica suina in tampone Tris-HCl è stata preparata appena prima dell'uso. Il substrato, p-nitrofenil butirrato (PNPB) è stato preparato sciogliendo 20,9 mg in 2 ml di acetonitrile. Per ciascuna soluzione di lavoro, 0,1 ml di lipasi pancreatica suina sono stati miscelati con 0,2 ml di frazione vegetale da ciascun membro della serie di diluizioni. Tris-HCl è stato aggiunto per rendere il volume finale delle soluzioni di lavoro 1 ml e sono state incubate a 37°C per 15 minuti. Dopo l'incubazione, a ciascuna provetta sono stati aggiunti 0,1 ml di soluzione di p-nitrofenil butirrato. La miscela è stata quindi incubata per altri 30 minuti a 37 gradi. L'attività della lipasi pancreatica è stata determinata misurando l'idrolisi del PNPB in p-nitrofenolato a 410 nm, utilizzando uno spettrofotometro UV. La stessa procedura è stata ripetuta usando orlistat come composto di riferimento standard. La percentuale di inibizione della lipasi da parte delle frazioni vegetali è stata calcolata con la seguente equazione:

dove, Ap è l'assorbanza registrata della soluzione del bianco e Ats è l'assorbanza registrata della soluzione del campione testato [24]. Saggio inibitorio dell'a-amilasi

A100 mg di ciascuna frazione è stato sciolto in pochi millimetri di 10 percento di DMSO, quindi ulteriormente sciolto fino a 100 ml in 0,02 M Na HPOq/ NaH-PO4,0,006M NaCl, pH 6,9 per dare finalmente soluzioni madre con concentrazioni di 1000 ug/ml. Da questi, sono state preparate le seguenti diluizioni di 10,50,70,100 e 500 ug/ml, usando il 10% di DMSO come diluente. Un volume di 0,2 ml di 2 unità/ml di amilasi pancreatica suina è stato miscelato con 0,2 ml

frazione vegetale ed è stato incubato per 10min a 30 gradi. Dopo l'incubazione, sono stati aggiunti 0,2 ml di una soluzione di amido all'1% in acqua preparata di fresco e le provette sono state quindi incubate per almeno altri tre minuti. A questo punto, la reazione è stata bloccata mediante l'aggiunta di 0,2 ml di reagente colorante acido dinitrosalicilico (DNSA) ed è stata diluita con 5 ml di acqua distillata, prima di essere riscaldata a 90 gradi per 10 minuti in acqua bagno. La miscela è stata quindi raffreddata a temperatura ambiente e l'assorbanza è stata misurata a 540 nm. Il controllo in bianco è stato preparato utilizzando le stesse quantità sopra descritte, ma sostituendo la frazione vegetale con 0,2 ml di tampone. L'acarbosio è stato utilizzato come riferimento standard seguendo la procedura sopra descritta. L'attività inibitoria dell'a-amilasi è stata calcolata utilizzando la seguente equazione:

dove Ag: è l'assorbanza del campione bianco e Ar è l'assorbanza del campione di prova [25].

Questo articolo è tratto da Jaradat et al. Medicina e terapie complementari BMC (2021) 21:107