Gli effetti benefici del verbascoside dall'erba di Cistanche

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Il verbascoside protegge i topi dalla cancrena del gas clostridiale inibendo l'attività della tossina alfa e della perfringolisina O

La cancrena gassosa, causata principalmente dal batterio anaerobico Clostridium perfringens (C. perfringens), provoca la morte entro 48 h dall'esordio. Sono disponibili strategie terapeutiche limitate ed è associato a una mortalità estremamente elevata. Sia la C. perfringens alfa-tossina (CPA) che la perfringolisina O (PFO) sono importanti fattori di virulenza nello sviluppo della cancrena gassosa, suggerendo che siano bersagli terapeutici. Ecco, l'abbiamo trovatoverbascoside, a glicoside fenilpropanoideampiamente distribuito in Erboristeria cinese Cistanche, potrebbe inibire efficacemente l'attività biologica sia del CPA che del PFO nei test emolitici.

L'oligomerizzazione del PFO è stata notevolmente inibita dal verbascoside. Sebbene non sia stata osservata alcuna attività antibatterica,verbascosideil trattamento ha protetto le cellule Caco-2 dai danni causati da CPA e PFO. Inoltre, i topi infetti trattati converbascosidemostrato in modo significativodanno alleviato, ridotta carica batterica, ediminuzione della mortalità. In sintesi,verbascoside ha un efficace effetto terapeutico contro la virulenza di C. perfringens sia in vitro che in vivomirando contemporaneamente a CPA e PFO. I nostri risultati forniscono una strategia promettente e un potenziale composto di piombo per le infezioni da C. perfringens, in particolare la cancrena gassosa.

Parole chiave: alfa-tossina, anti-infezione, Clostridium perfringens, gangrena gassosa, perfringolisina O, verbascoside

Il Clostridium perfringens (C. perfringens) è un batterio anaerobico gram-positivo ampiamente distribuito in natura e nell'intestino umano (Fraser e Collee, 1975). C. perfringens può secernere quattro tossine principali ( , , ε e Ì) ed è di conseguenza diviso in cinque sierotipi, A–E (Titball, 2005). Negli esseri umani, C. perfringens può causare una varietà di malattie, come intossicazione alimentare e cancrena gassosa, l'ultima delle quali può verificarsi anche negli animali, come gatti, bovini, cani, pecore, cavalli e capre (Verherstraeten et al. , 2015). Il periodo di incubazione della cancrena gassosa è breve e l'infezione può stabilirsi entro 6-8 ore (Uzal et al., 2015). Più seriamente, più del 50 per cento delle persone infette continuerà a sviluppare tossiemia sistemica, portando infine alla morte; quindi, senza la somministrazione tempestiva ed efficace del trattamento, la cancrena gassosa può portare a gravi perdite economiche (Low et al., 2018). Tuttavia, i trattamenti usuali, come il trattamento antibiotico e il trattamento chirurgico per la cancrena gassosa, presentano tutti alcuni svantaggi tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la resistenza agli antibiotici e il danno da amputazione dei pazienti (Park et al., 2010; Osman ed Elhariri, 2013). Pertanto, è necessario trovare nuovi metodi o idee per il trattamento della cancrena gassosa.

La cancrena da gas clostridi è la malattia infettiva fulminante causata principalmente dall'interazione di una tossina C. perfringens (CPA) e perfringolisina O (PFO) (Hifumi et al., 2018). Il CPA, appartenente alla famiglia degli enzimi batterici della zinco-Metallo fosfolipasi, è prodotto da tutti i C. perfringens, è codificato dai cromosomi, è una delle principali tossine di C. perfringens ed esibisce attività sia della fosfolipasi C che della sfingomielinasi (van Bunderen et al. , 2010; Masataka et al., 2015). Negli anni '90, Awad et al. (1995) hanno utilizzato mutanti CPA per testare un modello murino di gangrena gassosa e hanno scoperto che i ceppi privi del gene CPA mostravano una ridotta patogenicità e un minore danno tissutale dopo l'infezione. Questo lavoro ha confermato che il CPA è la principale tossina nella cancrena gassosa. Nel 2000, Alberto ha condotto studi approfonditi costruendo un modello molecolare di a-tossina e mutanti a tre loop nel dominio C-terminale, e l'attività emolitica e la citotossicità dei mutanti sono state ridotte rispetto a quelle del tipo selvaggio. È stato dimostrato che l'attività della sfingomielinasi e il dominio C-terminale sono necessari per la miotossicità in vivo (Alape-Giron et al., 2000). Il PFO, una citolisina dipendente dal colesterolo (CDC), interagisce con la membrana cellulare come monomero e il complesso preparato viene quindi inserito nel doppio strato di membrana mediante oligomerizzazione, lisando infine le cellule ospiti (Johnson e Heuck, 2014). Sebbene il PFO non sia necessario per la letalità, può causare citotossicità dei macrofagi nelle prime fasi della mionecrosi ed è importante per la formazione di trombi nelle ultime fasi dell'infezione, contribuendo alla patogenesi della cancrena gassosa (Verherstraeten et al., 2015). Il CPA può combinarsi con il PFO per danneggiare i neutrofili accumulati nel sito infetto e indurre disfunzione delle cellule endoteliali, edema e ischemia, portando infine all'ipossia tissutale e fornendo un ambiente anaerobico favorevole per la crescita e la riproduzione di C. perfringens (Bryant e Stevens, 1996 ). Pertanto, questo studio prende di mira CPA e PFO e mira a rivelare un nuovo metodo per il trattamento della cancrena gassosa.

In questo studio, due inibitori delle tossine sono stati selezionati da 17 composti naturali mediante emolisi per trovare un potenziale inibitore della cancrena gassosa. I dati emolitici per vari composti sono mostrati nella Tabella 1. Tra i 17 tipi di composti naturali, il verbascoside ha il miglior effetto inibitorio su entrambe le tossine e quindi abbiamo selezionato il verbascoside come composto bersaglio per questo studio. Il verbascoside è ampiamente distribuito in varie erbe medicinali cinesi come il cistanche ed è stato isolato ed estratto daVerbascosideda uno scienziato italiano nel 1963 (Speranza et al., 2010; Zhu et al., 2016). Gli studi lo hanno dimostratoil verbascoside ha molti effetti biologici e farmacologici, comeproprietà antinfiammatorie, antiossidanti, antibatteriche, antitumorali, antimicotiche e chelanti, epuò essere utilizzato nei cosmetici per la pelleepreparazioni d'attualità.Altri rapporti hanno dimostrato che il verbascoside può essere completamente assorbito entro 1 ora e raggiungere un'elevata concentrazione nel sangue e che la sua biodisponibilità al momento della consegna tramite vari metodi di iniezione non supera il 25 percento (Dai et al., 2017; Feng et al., 2018). Sulla base delle suddette attività farmacologiche, questo studio ha trovato e studiato l'inibitoreeffetti del verbascosidesulla cancrena gassosa attraverso una serie di esperimenti in vitro e in vivo.

Il verbascoside ha inibito l'attività emolitica di PFO e CPA

Alcuni flavonoidi sono stati segnalati per essere efficaci inibitori contro le tossine che formano i pori (Li et al., 2013; Wang et al., 2017; Zhou et al., 2017). Qui, è stato scoperto che il verbascoside, un fenilpropanoide, inibisce l'attività emolitica delle tossine PFO e CPA secrete da C. perfringens. Quando le concentrazioni di verbascoside variavano da 2 a 32 |ig/mL, il trattamento con verbascoside ha inibito significativamente l'attività emolitica di queste tossine in modo dose-dipendente, indicando che il verbascoside è un efficace inibitore sia del PFO che del CPA.

Il verbascoside non influisce sulla crescita di C. perfringens

We further performed MIC and bacterial growth curve studies to determine the antibacterial activity of verbascoside against C. perfringens, revealing a MIC assay result (Figure 2A) >256 |ig/ml. Allo stesso modo, i risultati della curva di crescita batterica (Figura 2B) indicano che il verbascoside non influisce sulla normale crescita dei batteri. Insieme, i nostri risultati indicano che il trattamento con verbascoside non ha influenza sulla vitalità di C. perfringens alle concentrazioni richieste per l'inibizione dell'attività di PFO e CPA.

Il verbascoside protegge le cellule dai danni indotti da PFO o CPA

Clostridium perfringens alfa-tossina e PFO in C. perfringens sono le principali tossine che causano cancrena gassosa; quindi, è stato anche esaminato se il verbascoside potesse proteggere le cellule da queste due tossine. Innanzitutto, abbiamo eseguito un test di citotossicità con il farmaco verbascoside, che non ha danneggiato le cellule (Figura 3A). Quindi, questo composto è stato aggiunto al sistema di co-coltura di cellule e PFO o CPA. Verbascoside ha inibito la citotossicità di queste due tossinenelle celle Caco{{0}}. Rispetto ai campioni non trattati con verbascoside, il danno indotto dalle tossine alle cellule Caco-2 trattate con verbascoside a 0.5 Jig/mL è stato significativamente ridotto in modo dose-dipendente. Soprattutto per la proteina PFO, le cellule sono state efficacemente protette a una concentrazione di farmaco di 0,25 ig/mL (P <0,05). un="" successivo="" test="" di="" vitalità/morte="" cellulare="" (figure="" 3d-k)="" è="" stato="" ulteriormente="" impiegato="" per="" dimostrare="" questo="" effetto="" protettivo.="" come="" previsto,="" il="" trattamento="" con="" verbascoside="" ha="" protetto="" visibilmente="" dal="" danno="" cellulare="" indotto="" da="" pfo="" o="" cpa.="" presi="" insieme,="" i="" nostri="" risultati="" hanno="" stabilito="" che="" il="" verbascoside="" inibisce="" significativamente="" il="" danno="" cellulare="" indotto="" da="" pfo="" o="" cpa="" in="" modo="">

Il verbascoside inibisce l'attività emolitica del PFO diminuendone l'oligomerizzazione

L'attività emolitica del PFO deve essere accompagnata dal verificarsi di oligomerizzazione e formazione di pori (Johnson e Heuck, 2014). Qui, l'oligomerizzazione del PFO è stata indotta dal KCl e dal sangue di coniglio ed è stata rilevata l'oligomerizzazione del PFO (Figura 4), rivelando una ridotta intensità della banda di oligomerizzazione quando la concentrazione di verbascoside è stata aumentata. Insieme, i nostri risultati suggeriscono che il trattamento con verbascoside inibisce l'oligomerizzazione del PFO e quindi riduce l'attività emolitica di questa tossina.

Il verbascoside protegge i topi dall'infezione da C. perfringens

È stato stabilito un modello di cancrena del muscolo della gamba del topo per determinare se la protezione osservata in vitro potesse essere osservata anche in vivo. Le gambe dei topi con infezione da ATCC13124- erano Al contrario, il numero di cellule infiammatorie nel gruppo del farmaco era significativamente ridotto e il tessuto era intatto dopo il trattamento con verbascoside. Inoltre, il numero di batteri colonizzati nei muscoli delle gambe è stato significativamente ridotto dopo il trattamento con verbascoside. Come mostrato nei risultati dell'esperimento, il 93,33% dei topi infetti è morto entro 32 ore dall'infezione. Come previsto, il tasso di sopravvivenza dei topi trattati con verbascoside è aumentato del 33,33%, poiché solo il 60% dei topi infetti è morto (P=0.015 da un log-rank test). Inoltre, il trattamento con verbascoside ha ritardato il picco del periodo di morte di quasi 8 ore (da 32 ore per i topi con infezione da ATCC 13124- a 40 ore per i topi trattati con verbascoside) e potrebbe quindi prolungare il tempo prezioso necessario per il salvataggio clinico. Presi insieme, i nostri risultati hanno indicato che nei topi, il verbascoside può fornire una protezione sistematicamente efficace contro la cancrena gassosa causata da C. perfringens.

Come batterio anaerobico gram-positivo, C. perfringens è ampiamente distribuito in natura e può secernere una varietà di tossine, che possono portare a una varietà di malattie negli esseri umani e negli animali, inclusa la cancrena gassosa (Fraser e Collee, 1975; Verherstraeten et al. ., 2015). La cancrena gassosa è causata principalmente dalla combinazione di tossine a e theta secrete da C. perfringens, che possono portare alla morte di animali infetti, con conseguenti grandi perdite economiche. Tuttavia, ad oggi, i metodi efficaci per il trattamento della cancrena gassosa includono ossigeno iperbarico, chirurgia e antibiotici. Tra questi, la chirurgia può causare danni fisici sostanziali ai pazienti e avere un impatto molto sconveniente sulla vita postoperatoria. Numerosi geni di resistenza alle tetracicline sono stati trovati negli isolati di C. perfringens provenienti da Svezia, Norvegia, Danimarca e altri luoghi. Pertanto, sono necessarie nuove strategie o agenti per combattere questa infezione batterica (Park et al., 2010; Osman and Elhariri, 2013). In questo studio, il fenilpropanoide verbascoside, che differisce dai tradizionali trattamenti antibatterici (antibiotici), potrebbe inibire l'attività emolitica sia del CPA che del PFO, due importanti tossine che formano pori che contribuiscono in modo critico alla patogenicità di C. perfringens. A livello cellulare, il verbascoside potrebbe anche proteggere efficacemente le cellule di Caco-2 da queste due tossine a basse concentrazioni (0,25-2 ig/mL). In particolare, il verbascoside potrebbe ridurre l'attività delle tossine inibendo l'oligomerizzazione del PFO. Questi risultati potrebbero fornire dati di base sufficienti per la ricerca in vivo.