Correlazione positiva tra appiattimento tubulare renale e danno tubulare renale / fibrosi interstiziale in modelli di malattia renale murina
Mar 17, 2022
ASTRATTO.Il numero di pazienti con cronico malattia renale(CKD) è in continua crescita a livello globale. Al fine di studiare la patogenesi e i meccanismi, sono stati sviluppati molti modelli animali, tra cui modelli spontanei, genetici e indotti. Sebbene ogni tipo di CKD mostri cambiamenti tissutali specifici della malattia nelle fasi iniziali, il disturbo tubulare e la fibrosi interstiziale si verificano istologicamente nel corso della progressione allo stadio terminaleInsufficienza renale. Pertanto, la quantificazione del disturbo tubulare e della fibrosi interstiziale nella ricerca sulla CKD utilizzando modelli animali è essenziale per misurare il grado di gravità della CKD e, quindi, l'efficacia degli agenti terapeutici. Diverse strategie sono state utilizzate per quantificare la fibrosi interstiziale. Tra i fattori di punteggio,renalel'appiattimento tubolare può essere valutato quantitativamente in modo semplice ed economico. Tuttavia, il valore diagnostico direnalela valutazione dell'appiattimento tubulare non è stata studiata in precedenza. Pertanto, in questo studio, abbiamo studiato la correlazione trarenaleappiattimento tubulare e fibrosi interstiziale orenalemarcatori di lesioni tubolari. Abbiamo osservato una forte correlazione tra il grado di lesione tubulare/fibrosi interstiziale erenaleappiattimento tubolare in tre tipi di mouseMalattia renalemodelli. Questo è vantaggioso perché le tecnologie in rapido progresso come l'intelligenza artificiale e l'elaborazione delle immagini possono essere facilmente applicate; pertanto, una diagnosi più precisa, obiettiva e quantitativa dovrebbe essere possibile in futuro.
Parole chiavi:fibrosi interstiziale, malattia renale, appiattimento tubulare renale, danno tubulare renale; Insufficienza renale
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Pazienti con cronicomalattia renale(CKD) mostrano sintomi di proteinuria o una diminuzione prolungata (più di tre mesi) della velocità di filtrazione glomerulare [15]. Questa malattia è classificata nel gruppo ad alto rischio di pazienti con stadio terminaleInsufficienza renale.Il numero di pazienti con CKD è in continua crescita a livello globale. Quando la CKD progredisce, porta alla fase finaleInsufficienza renale, che richiede un trattamento dialitico che costa molto, portando ad un aumento delle spese mediche [14]. Pertanto, lo sviluppo di nuovi marcatori per monitorare l'insorgenza e la progressione della CKD e l'istituzione di nuovi metodi di trattamento sono urgentemente necessari. Le cause comuni di CKD includono diabete, ipertensione, malattia glomerulare e altri fattori di rischio CKD. Sebbene ogni tipo di CKD mostri cambiamenti tissutali specifici della malattia nelle fasi iniziali, il disturbo tubulare e la fibrosi interstiziale si verificano istologicamente nel corso della progressione allo stadio terminaleInsufficienza renale.Renalela fibrosi è un cambiamento tissutale che è principalmente associato al disturbo tubulare correlato alla CKD e alla fibrosi interstiziale ed è considerato un obiettivo di trattamento significativo per prevenire la progressione allo stadio terminaleInsufficienza renale[25]. Pertanto, la quantificazione del disturbo tubulare e della fibrosi interstiziale nella ricerca sulla CKD utilizzando modelli animali è essenziale per misurare il grado di gravità della CKD e, quindi, l'efficacia degli agenti terapeutici. Diverse strategie sono state utilizzate per quantificare la fibrosi interstiziale, tra cui la colorazione rossa di Sirio o la colorazione tricroma di Masson per quantificare le regioni di fibrillizzazione, il punteggio del disturbo tubulare per l'analisi morfologica direnaletubuli e vari marcatori di lesione, come α-SMA, lipocalina associata alla gelatinasi neutrofila (NGAL), L-FABP e Kim-1 [6, 7, 9, 10, 16, 23]. Il punteggio del disturbo tubulare include appiattimento, espansione, degenerazione, atrofia e perdita del bordo del pennello direnaletubuli [27]. Tra questi fattori di punteggio,renalel'appiattimento tubolare (diminuzione dell'altezza) può essere valutato quantitativamente facilmente ed economicamente [1-3, 19, 20]. Tuttavia, il valore diagnostico della valutazione dell'appiattimento tubulare renale non è stato studiato in precedenza. Pertanto, abbiamo analizzato la correlazione tra il grado di fibrosi interstiziale erenaleappiattimento tubolare inmalattia renale.
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MATERIALI E METODI
Dichiarazione eticaTutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Presidente dell'Università di Kitasato, a seguito dell'esame da parte del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Kitasato (ID approvazione: n. 19-153, 19-154, 19-155). Topi maschi FVB/NJcl (FVB) e BALB/cAJcl (BALB/c) sono stati ottenuti da CLEA (Tokyo, Giappone). Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni specifiche prive di agenti patogeni. Hanno avuto accesso a cibo sterile e acqua ad libitum prima e durante gli esperimenti.AnimaliModello Tns2nph: il topo mutante FVB-Tns2nph (FVB-nph) è stato utilizzato come modello CKD come descritto in [22]. Modello di ischemia-riperfusione (IR): il modello IR creato è stato eseguito come descritto in precedenza [18]. I topi di otto settimane (FVB maschile) sono stati anestetizzati per inalazione di isoflurano e i cui reni sinistri sono stati rimossi, quindi lo strato muscolare e la facciata sono stati chiusi utilizzando sutura assorbibile. Dopo dieci giorni di recupero, i topi sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale della combinazione di farmaci per anestesia come descritto in precedenza [11], il lororenalele arterie e le vene sono state mantenute in uno stato ischemico con morsetti arteriosi (TKS-1-40, BEAR Medic, Ibaraki, Giappone) rispettivamente per 30 e 60 minuti, quindi lo strato muscolare e la facciata sono stati chiusi utilizzando la sutura assorbibile. Inoltre, i topi di controllo che hanno subito un intervento chirurgico fittizio sono stati sottoposti a chirurgia aperta senza morsetti. Successivamente, tutti i topi sono stati sottoposti a eutanasia per inalazione di un sovradosaggio di isoflurano (Escain, Pfizer Japan Inc., Tokyo, Giappone) per eseguire la raccolta del campione. Lerenisono stati rimossi 24 ore dopo la replicazione dell'ischemia. Modello di nefropatia indotta da adriamicina (ADR): modello di nefropatia: ai topi BALB/c di età compresa tra otto settimane è stato somministrato ADR (FUJIFILM Wako Pure Chemical Co., Ltd., Osaka, Giappone) (10 mg/kg) o soluzione salina (gruppo veicolo) attraverso la vena della coda per valutare la lorodisturbi renaliistologicamente a 14 giorni dalla somministrazione.
IstologiaI reni dei topi sono stati fissati con il 4% di paraformaldeide (PFA) a 4 ° C durante la notte.Renei blocchi sono stati tagliati a 2 μm (per la colorazione periodica acida-Schiff (PAS)) e 4 μm (per la colorazione picro-sirio red). Perrenalemisurazione dell'altezza tubolare, i lati della corteccia diRenele sezioni sono state fotografate casualmente in quattro diverse viste (×100). Due ricercatori indipendenti hanno misurato ciecamente ilrenalealtezza tubolare in tutte le viste per calcolare l'altezza media di ciascun soggetto. Per i soggetti con altezze tubolari irregolari, sono state selezionate misurazioni da due a cinque posizioni per tubulo per ottenere il valore medio (Fig. 1A). Sono state ottenute circa 700 misurazioni di altezza tubolare per soggetto utilizzando la procedura di cui sopra per calcolare il valore medio per ciascun soggetto. Per la colorazione Sirius Red, i vetrini sono stati deparaffinizzati e macchiati 1 ora con sirio rosso in acido picrico acquoso saturo e lavati con acido acetico allo 0,5%. Per valutare le aree di fibrillizzazione utilizzando la colorazione rossa sirio, le aree target sono state fotografate in modo casuale in otto viste (×100) e le aree positive sono state quantificate utilizzando ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) per calcolare il loro tasso di occupazione rispetto all'area totale. Glomeruli macchiati di rosso Sirio e vasi sanguigni sono stati esclusi dal calcolo.
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Colorazione immunochimicaLe sezioni renali (5 μm) sono state deparaffinizzate e sottoposte al recupero dell'antigene in tampone citrato, a 121°C per 15 minuti dopo il lavaggio con soluzione salina tamponata con Tris (TBS),Renele sezioni sono state sigillate con perossido di idrogeno allo 0,3% / metanolo per 20 minuti e poi incubate durante la notte a 4 ° C con anticorpi anti-NGAL (Abcam, Cambridge, Regno Unito). Le sezioni sono state lavate con TBS e poi incubate con anticorpi secondari (Histofine SimpleStain MAX PO (Rabbit), Nichirei Biosciences Inc., Tokyo, Giappone) per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio con TBS, le sezioni sono state incubate con 3,3′-diaminobenzidina (DAB) (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Giappone) ed ematossilina a temperatura ambiente. Per valutare il disturbo tubulare tramite colorazione immunochimica utilizzando un anticorpo anti-NGAL, i campioni di tessuto sono stati fotografati in modo casuale in otto viste (×100) e le aree di colorazione DAB sono state quantificate utilizzando ImageJ per calcolare il loro tasso di occupazione rispetto all'area totale.
StatisticaI dati sono stati presentati come deviazione media ± standard. Il t-test dello studente è stato utilizzato per testare le differenze significative tra due gruppi e il test multigruppo di Bonferroni è stato utilizzato per testare più gruppi. Valore P<0.05 was="" statistically="" significant.="" bonferroni’s="" multigroup="" test="" was="" carried="" out="" using="" graphpad="" prism="" 5="" software="" (mdf,="" tokyo,="">
RISULTATI Come accennato in precedenza, la quantificazione delle aree fibrotiche interstiziali utilizzando la colorazione rossa di Sirius dovrebbe essere il metodo di valutazione standard per i disturbi tubulari in pazienti conmalattia renaleo inmalattia renalemodelli. Pertanto, per la quantificazione del disturbo tubulare e della fibrosi interstiziale utilizzando il modello murino CKD animale, abbiamo usato il topo mutante FVB-Tns2nph (FVB-nph), che è un modello animale CKD che presenta molti sintomi della CKD umana che progredisce gradualmente per un periodo prolungato, tra cui l'insorgenza genetica della glomerulosclerosi dalla nascita, la fibrillizzazione del tubulointerstizio,renaleanemia, eInsufficienza renale[17, 21, 22]. Il topo FVB-nph riproduce i sintomi tipici osservati nella progressione della CKD umana. In questo studio, abbiamo introdotto la mutazione nph in linee FVB suscettibili alla nefropatia. Il gruppo FVB-nph ha mostrato un maggiore appiattimento tubulare rispetto al gruppo WT, basato sul peggioramento della fibrillizzazione dell'interstizio nelrenaletubuli (Fig. 1B–D). L'analisi di regressione lineare ha indicato una correlazione opposta significativa tra l'altezza tubulare e il grado di fibrosi interstiziale (R2=0,7086: P=0,0023) (Fig. 1E).
Fig. 1. (A) Misurazione dell'altezza della cellula epiteliale tubulare. Le barre rosse indicano l'altezza dei tubuli. (B) Immagini rappresentative della colorazione periodica acid-Schiff (PAS) e delle immagini macchiate di Sirio rosso di sezioni renali FVB-Tns2WT (FVB-WT) (pannello di sinistra) e di topo mutante FVB-Tns2nph (FVB-nph) (pannello destro). Il pannello superiore rappresenta le immagini macchiate di PAS e il pannello inferiore rappresenta le immagini macchiate di rosso Sirius. Barre della scala: 50 μm. (C) Grafico che confronta le altezze tubolari di FVB-WT e FVB-nph. (D) Grafico che confronta l'area della fibrosi con l'area totale. I dati sono espressi come deviazione media ± standard; I valori P sono stati calcolati dal t-test dello studente. (E) I grafici a dispersione con regressione lineare mostrano un'analisi di correlazione tra l'altezza dei tubuli e il grado del punteggio di fibrosi. La linea di regressione lineare ha mostrato una correlazione inversa tra altezza tubulare e area fibrosi. Vengono mostrati i valori dei coefficienti di correlazione R e P. I cerchi neri indicano il gruppo FVB-WT (n=5) e i quadrati neri indicano il gruppo FVB-nph (n=5). **P<0.01,><>
Le lesioni tubulari renali e le altezze tubulari sono state misurate utilizzando ildanno renale(AKI) modello, cioè il modello IR [5, 12, 18]. Sebbene la fibrosi interstiziale non debba essere osservata nella maggior parte dei casi di AKI, tra cuirenaledisturbo ischemico, aumento dell'espressione di NGAL nelle cellule tubulari renali [7]. Inoltre, NGAL è noto per essere coinvolto nella progressione di AKI a CKD ed è stato proposto come un fattore vitale in entrambi. Pertanto, abbiamo dimostrato che l'espressione di NGAL è correlata conrenalealtezza tubolare utilizzando il modello IR. È stato riportato che il tempo di ischemia è spesso impostato a 20-60 minuti e che la lesione tubulare peggiora con l'aumentare del tempo di ischemia [4, 5, 12, 18]. In questo studio, i topi sono stati sottoposti a ischemia per 30 minuti come debole lesione tubulare e 60 minuti come forte lesione tubulare. Nei gruppi di 30 e 60 minuti è stato osservato un aumento dell'espressione di NGAL e un appiattimento tubulare. L'aumento dell'espressione di NGAL e l'appiattimento dei tubuli è stato più pronunciato nel gruppo di 60 minuti perché aveva subito più lesioni (Fig. 2A–C). Una diminuzione dell'altezza tubulare e un aumento dell'espressione di NGAL sono stati dimostrati sulla base di un aumento della durata dello stato ischemico (Fig. 2A-C). L'analisi di regressione lineare dei risultati ha anche indicato una correlazione negativa trarenalealtezza tubolare ed espressione NGAL (R2=0,6266, P=0,011) (Fig. 2D).
Il modello di nefropatia ADR è spesso usato inmalattia renalericerca perché produce lesioni glomerulari e disturbi tubulari minori con un alto livello di riproducibilità utilizzando una singola dose di ADR [13]. Il modello murino di nefropatia ADR è stato utilizzato in questo studio per valutarerenalelesioni tubolari e altezze. Il modello di roditore della nefropatia indotta da ADR viene spesso utilizzato per spiegare i meccanismi della glomerulosclerosi focale (FSGS) e della CKD. Una singola dose di ADR può causare perdita di podociti, proteinuria persistente e FSGS. Tra i diversi ceppi di topo, BALB/c è sensibile all'ADR, mentre C57BL/6 (B6) è resistente. Pertanto, abbiamo usato BALB / c in questo esperimento ADR. Nella nefropatia ADR,renalela fibrosi interstiziale, che è una scoperta tipica della CKD, è
Fig. 2. (A) Immagini rappresentative di colorazione periodica acida-Schiff (PAS) e immagini colorate immunochimiche con anticorpo lipocalina associato alla gelatinasi anti-neutrofili (NGAL) di sezioni renali sham (pannello sinistro), 30 min (pannello centrale) e 60 min (pannello destro). Il pannello superiore rappresenta l'immagine macchiata di PAS e il pannello inferiore rappresenta l'immagine macchiata di immunochimica con anticorpo anti-NGAL. Barre della scala: 50 μm. (B) Grafico che confronta le altezze tubolari di sham, 30 min e 60 min. (C) Grafico che confronta l'area NGAL-positiva con l'area totale di sham, 30 min e 60 min. I dati sono espressi come deviazione media ± standard; I valori P sono stati calcolati dal test multigruppo di Bonferroni. (D) I grafici a dispersione con regressione lineare mostrano un'analisi di correlazione tra l'altezza dei tubuli e l'area NGAL-positiva. La linea di regressione lineare mostra una correlazione inversa tra altezza tubulare e aree NGAL-positive. Vengono mostrati i valori dei coefficienti di correlazione R e P. I cerchi neri indicano il gruppo fittizio (n = 3), i quadrati neri indicano il gruppo di 30 minuti (n = 3) e i triangoli neri indicano il gruppo di 60 minuti (n = 3). *P<0.05,><>
prominente a 4 settimane dopo la somministrazione di ADR, mentre una condizione intermedia tra AKI e CKD è osservata a meno di 4 settimane [24]. Nel presente studio, abbiamo valutato l'appiattimento tubulare nei topi 2 settimane dopo il trattamento ADR, una condizione intermedia. Il livello direnalela lesione tubulare è stata valutata misurando l'espressione di NGAL, che aumenta nelle cellule dei tubuli renali danneggiati [6]. Sono state misurate le altezze tubulari renali e la colorazione immunochimica utilizzando un anticorpo anti-NGAL è stata eseguita sui tessuti renali dei gruppi ADR e veicolo. Non è stata rilevata alcuna immagine positiva della colorazione rossa di Sirio (dati non mostrati). L'appiattimento tubulare è stato potenziato dalla somministrazione di ADR ed è stato dimostrato un evidente aumento dell'espressione di NGAL (Fig. 3A-C). Inoltre, l'analisi di regressione lineare delle altezze tubolari e dei livelli di espressione NGAL ha mostrato una correlazione opposta (R2=0,522, P=0,043) (Fig.3D).
DISCUSSIONE
In questo studio sono state dimostrate forti correlazioni tra appiattimento tubulare renale e fibrosi interstiziale in modelli di CKD gravi e tra appiattimento tubulare e disturbo tubulare in modelli ADR e IR. Esistono vari meccanismi con cui le lesioni glomerulari si diffondono alla fibrosi interstiziale attraverso disturbi tubulari. Uno studio ha riportato cherenaleIl danno tubulare (appiattimento) induce fibrosi interstiziale, produzione di matrice extracellulare (ECM) e infiltrazione di cellule infiammatorie. La forte correlazione trarenalel'appiattimento tubulare e la fibrillizzazione interstiziale tubulare renale osservati in questo studio corrispondono probabilmente all'associazione causale precedentemente riportata; vale a dire,renalei danni tubolari inducono fibrosi, produzione di ECM e infiltrazione cellulare. Un altro studio ha anche mostrato una correlazione tra una maggiore espressione di NGAL e l'atrofia tubulare renale (un'altra voce del punteggio di danno da disturbo renale), con risultati simili al punteggio di appiattimento tubulare renale ottenuto in questo studio [26]. In questo studio, solo maschi
Fig. 3. (A) Immagini rappresentative di colorazione periodica acida-Schiff (PAS) e immagini colorate immunochimiche con anticorpo lipocalina associato alla gelatinasi anti-neutrofili (NGAL) delle sezioni renali veicolo (pannello sinistro) e adriamicina (ADR) (pannello destro). Il pannello superiore rappresenta l'immagine macchiata di PAS e il pannello inferiore rappresenta l'immagine macchiata di immunochimica con anticorpo anti-NGAL. Barre della scala: 50 μm. (B) Grafico che confronta le altezze tubolari del veicolo e dell'ADR. (C) Grafico che confronta l'area NGAL-positiva rispetto all'area totale. I dati sono espressi come deviazione media ± standard; I valori P sono stati calcolati dal test multigruppo di Bonferroni. (D) I grafici a dispersione con regressione lineare mostrano un'analisi di correlazione tra l'altezza dei tubuli e l'area NGAL-positiva. La linea di regressione lineare mostra una correlazione inversa tra altezza tubulare e aree NGAL-positive. Vengono mostrati i valori dei coefficienti di correlazione R e P. I cerchi neri indicano il gruppo del veicolo (n = 3) e i quadrati neri indicano il gruppo ADR (n = 5). *P<0.05,><>
CISTANCHE MIGLIORERÀ IL DOLORE RENALE / RENALE
sono stati usati topi, ma l'appiattimento dei tubuli nella nefropatia può essere osservato in entrambi i sessi. Tuttavia, i topi femmina sono stati segnalati per essere resistenti all'IR e ad altri modelli di nefropatia, quindi l'uso di topi maschi o femmine deve essere considerato a seconda del modello di nefropatia utilizzato [8]. È stato anche difficile valutare l'appiattimento tubulare nel midollo, perché i tubuli nel midollo al momento della non lesione hanno cellule tubolari sottili, sebbene sia stata valutata l'altezza dei tubuli nella corteccia. Pertanto, un metodo semplice per valutare la lesione tubulare nel midollo dovrebbe essere sviluppato in futuro (dati non mostrati). Esperti come patologi o medici generalmente eseguono una valutazione del livello di atrofia, espansione o mutazione dei tubuli renali per valutare l'istologia dei tubuli renali; tuttavia, la misurazione delle altezze tubulari renali per segnare il livello di appiattimento può essere eseguita molto più facilmente rispetto ad altri metodi. Questo è anche vantaggioso perché tecnologie in rapido progresso come l'intelligenza artificiale e l'elaborazione delle immagini possono essere facilmente applicate; pertanto, una diagnosi più precisa, obiettiva e quantitativa dovrebbe essere possibile in futuro. Per confermare se l'appiattimento tubulare renale potrebbe essere un fenomeno universalmente osservato come indice di malignità CKD in diverse specie, dovrebbero essere condotte ulteriori indagini utilizzando modelli CKD di altri roditori, animali da compagnia come cani e gatti o campioni raccolti dagli esseri umani.