Predire il ruolo dell'LncRNA nell'invecchiamento renale in base al sequenziamento dell'RNA Ⅱ

Correlazione tra lncRNA Gm43360 e i suoi potenziali mRNA bersaglio

LncRNA Gm43360 è stato selezionato per lo studio perché collegava due reti di coespressione lncRNA-mRNA. Il livello di espressione di Adra1a era correlato positivamente (rho=0.8650, p=0.026) con quello di Gm43360, Csnk1a1 (caseina chinasi 1A1) era correlato negativamente (rho{{12 }}.8084, p=0.0084) (Fig. 5a). Per verificare ulteriormente la correlazione tra lncRNA Gm43360 e i suoi potenziali mRNA bersaglio Adra1a e Csnk1a1, in questo studio è stato progettato un plasmide di sovraespressione di lncRNA Gm43360. L'espressione di Csnk1a1 è diminuita come previsto e anche l'espressione di Adra1a è diminuita, ma non in modo significativo. Successivamente, abbiamo abbattuto lncRNA Gm43360 mediante siRNA per rilevare se l'espressione dei suoi mRNA target era influenzata. Come previsto, Csnk1a1 era aumentato nelle cellule knockdown lncRNA Gm43360 rispetto al gruppo di controllo negativo siRNA (Fig. 5b). Dieci, abbiamo rilevato il ruolo dell'lncRNA Gm43360 nel ciclo cellulare. I risultati del kit di conteggio delle cellule-8 (CCK-8) hanno mostrato che lncRNA Gm43360 promuoveva la vitalità cellulare (Fig. 5c). I risultati hanno mostrato che lncRNA Gm43360 ha aumentato la percentuale di cellule in fase S e ha diminuito la percentuale di cellule in fase G1 rispetto al controllo negativo (Fig. 5d). Le proteine ​​p53 e p21 erano coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare e quindi erano i segni dell'invecchiamento cellulare. I livelli di espressione di p53 e p21 erano significativamente diminuiti nel gruppo con sovraespressione rispetto al gruppo di controllo. I livelli di espressione di p53 e p21 erano significativamente aumentati nel gruppo siRNA rispetto al gruppo di controllo siRNA (Fig. 5e). La sovraespressione di lncRNA Gm43360 ha ridotto il numero di cellule SA- -gal-positive e le cellule -gal-positive sono aumentate nel gruppo di Gm43360 trasfettato (Fig. 5f). Nel loro insieme, questi risultati hanno indicato che lncRNA Gm43360 ha inibito la senescenza delle cellule epiteliali tubulari renali medianteinibendo l'espressione di Csnk1a1.

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Discussione

In questo studio, abbiamo valutato i dati di espressione dell'mRNA da reni di topo giovani e anziani e condotto analisi di bioinformazioni che hanno rivelato le funzioni degli mRNA espressi in modo anomalo. Abbiamo osservato 347 mRNA sovraregolati e 355 mRNA downregolati nonché 130 lncRNA sovraregolati e 91 lncRNA downregolati inreni di topi vecchi rispetto a reni di topi giovani. Inoltre, è stato dimostrato che questi mRNA sono coinvolti nei percorsi legati all'invecchiamento, comefosforilazione ossidativa, la via di segnalazione AMPK, la via di segnalazione Wnt, la via di segnalazione Rap1 e le malattie legate all'età, che hanno dimostrato le funzioni degli mRNA espressi in modo differenziale nella patogenesi dell'invecchiamento renale.

Il lungo RNA non codificante NEAT1 è un fattore protettivo nella progressione della fibrosi renale nelle cellule epiteliali tubulari renali [21]. Per coincidenza, nei nostri risultati di sequenziamento, lncRNA NEAT1 era espresso a livelli più bassi nei reni dei topi anziani rispetto ai topi giovani, il che è coerente con i risultati precedenti. LincRNA-Gm4419 accelera l'infammazione e la fibrosi mediante meccanismi mediati dall'inflammasoma NF-kB/NLRP3 nella nefropatia diabetica [22]. Nei nostri risultati di sequenziamento, abbiamo anche scoperto che l’espressione di Gm4419 era più alta nei reni dei topi anziani rispetto a quelli dei topi giovani, ma non c’era alcuna differenza significativa. LncRNA Gm43360 si trova sul cromosoma 5 (Chr5: 122494022–122.494.908, 2887 bp). Secondo l'UCSC Genome Browser, Gm43360 si trova nell'introne del gene codificante la proteina Atp2a2. Tuttavia, fino ad oggi non sono stati riportati rapporti sul coinvolgimento dell’lncRNA Gm43360 nelle malattie. In questo studio, il knockdown di lncRNA Gm43360 ha promosso la senescenza delle cellule epiteliali tubulari renali. Inoltre, abbiamo identificato molti lncRNA espressi in modo differenziale nei risultati del sequenziamento e li abbiamo studiati.

Gli LncRNA sono stati classificati in cis-regolazione o trans-regolazione in base ai meccanismi di regolazione dell'lncRNA. Gli lncRNA ad azione cis potrebbero influenzare l'espressione di geni vicini dipendendo da elementi ad azione cis, come promotori, potenziatori e sequenze regolatrici, che sono distanze tra lncRNA e mRNA inferiori a 100 kb. Gli lncRNA trans-attivi si riferiscono agli lncRNA che lasciano il sito di trasfezione e operano in siti distanti (cioè, la distanza tra lncRNA e mRNA è superiore a 100 kb) [23]. L'lncRNA MAAT aumenta l'espressione del gene vicino Mbnl1 attraverso un modulo cis-regolatore [24]. L'lncRNA Pnky svolge un ruolo di regolatore trans-attivo nello sviluppo corticale [25]. In questo studio, è stata riscontrata una relazione transregolatoria tra lncRNA Gm43360 e Csnk1a1. Csnk1a1 è un gene soppressore del tumore [26] che codifica per una proteina che partecipa al ciclo cellulare e al processo di divisione cellulare [27]. Induce la downregulation di Csnk1a1infiammatoria associata alla senescenzarisposta con arresto della crescita nei tumori del colon-retto [26]. Csnk1a1 è stato sottoregolato quando Gm43360 è stato sovraregolato; quindi, è probabile che lncRNA Gm43360 partecipiinvecchiamento renalediregolando l'espressione di Csnk1a1.

Conclusioni

La nostra indagine sulla rete di coespressione lncRNA-mRNA ininvecchiamento renaleha rivelato che un lncRNA, lncRNA Gm43360, può svolgere un ruolo protettivo nell'invecchiamento renale e ha ampliato la nostra comprensione dei meccanismi coinvolti nell'invecchiamento renale.invecchiamento renale

Materiali e metodi

Campioni Topi maschi C57BL/6J giovani (3-mesi) e vecchi (24-mesi) maschi sono stati acquistati dal Centro sperimentale per animali dell'Università di Xiamen e sono stati allevati in un ambiente standard. Tutti i topi avevano libero accesso al cibo e all’acqua. I topi sono stati acclimatati nella nuova struttura per un mese prima di essere sacrificati. I topi sono stati anestetizzati con uretano mediante iniezione intraperitoneale alla dose di 750 mg/kg prima della raccolta del campione. Topi giovani e vecchi venivano sacrificati lo stesso giorno.Rene residuo di topoil tessuto è stato utilizzato per il sequenziamento in ciascun test. Sono stati eseguiti RNA-seq e istopatologiareni separatidallo stesso topo. Il tessuto renale è stato raccolto dai topi. Un rene è stato immediatamente immerso in formalina tamponata neutra al 10% per l'inclusione successiva della sezione, e l'altro rene è stato diviso in diversi tessuti e immediatamente posto in azoto liquido e quindi conservato a -80 gradi. Lo studio è stato sostenuto dal Comitato Etico del Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Xi'an Jiaotong (Shaanxi, Cina) (No. 2018-G-164). Tutti i metodi sono stati eseguiti secondo le linee guida e i regolamenti sull’etica animale. Questo studio è stato condotto in conformità con le linee guida ARRIVE.

Istopatologia renale

Campioni di tessuto renale di topi giovani e anziani sono stati fissati in una soluzione di paraformaldeide all'10% durante la notte. Dieci delle sezioni sono state disidratate, incluse in paraffina e sezionate con uno spessore di 4-μm. La colorazione tricromatica PAS e Masson è stata eseguita utilizzando protocolli standard. Le immagini sono state catturate dalla fotocamera ed è stata misurata l'area positiva alla colorazione. L'area per le immagini della telecamera istopatologica è stata calcolata con Image-Pro Plus 6.0.

Colorazione SA‑‑gal

L'attività SA{{0}}gal è stata analizzata utilizzando un kit di colorazione SA- -gal (Cell Signaling Technology #9860) secondo il protocollo del produttore. È stata misurata l'area di colorazione positiva e le cellule positive a SA- -gal sono state calcolate utilizzando Image-Pro Plus 6.0.

Costruzione e sequenziamento di librerie di estrazione di RNA

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 sono stati utilizzati per costruire una libreria di sequenziamento. Dopo l'estrazione dell'RNA totale, l'mRNA è stato purificato dall'RNA totale (5ug) utilizzando Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, USA) con due cicli di purificazione. Dopo la purificazione, l'mRNA è stato suddiviso in brevi frammenti utilizzando cationi bivalenti ad alte temperature (Magnesium RNA Fragmentation Module (NEB, cat. e6150, USA) a 94 gradi 5-7 min). Quindi i frammenti di RNA scissi sono stati trascritti al contrario per ottenere il cDNA mediante trascrittasi inversa SuperScript™ II (Invitrogen, cat. 1,896,649, USA), che è stato successivamente utilizzato per sintetizzare DNA del secondo filamento marcati con U con la DNA polimerasi I di E. coli ( NEB, cat.m0209, USA), RNase H (NEB, cat.m0297, USA) e soluzione dUTP (Termo Fisher, cat.R0133, USA). Una base A è stata quindi aggiunta alle estremità smussate di ciascun filo, preparandole per la legatura agli adattatori indicizzati. Ciascun adattatore conteneva una sporgenza della base T per legare l'adattatore al DNA frammentato con coda A. Gli adattatori a doppio indice sono stati legati ai frammenti e la selezione della dimensione è stata eseguita con sfere AMPureXP. Dopo il trattamento con l'enzima UDG termolabile (NEB, cat.m0280, USA) dei DNA del secondo filamento marcati con U, i prodotti legati sono stati amplificati con PCR secondo le seguenti condizioni: denaturazione iniziale a 95 gradi per 3 minuti; 8 cicli di denaturazione a 98 gradi per 15 s, ricottura a 60 gradi per 15 s ed estensione a 72 gradi per 30 s; e poi estensione finale a 72 gradi per 5 min. La lunghezza media dell'inserto per le librerie di cDNA finali era di 300±50 bp. Infine, abbiamo eseguito il sequenziamento accoppiato 2×150 bp (PE150) su un Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, Cina) secondo il protocollo del produttore [28].

Analisi bioinformatica Sequenza e filtraggio di letture pulite

Una libreria di cDNA costruita mediante tecnologia dall'RNA raggruppato dacampioni di renidi topi è stato sequenziato ed eseguito con la piattaforma di sequenza Illumina NovaseqTM 6000. Utilizzando l'approccio RNA-seq Paired-End Illumina, abbiamo sequenziato il trascrittoma, generando un totale di milioni di letture Paired-End da 2x150 bp. Le letture ottenute dalle macchine di sequenziamento includono letture grezze contenenti adattatori o basi di bassa qualità che influenzeranno il successivo assemblaggio e analisi. Pertanto, per ottenere letture pulite di alta qualità, le letture sono state ulteriormente filtrate da Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, versione:cutadapt-1.9). I parametri erano i seguenti:

1) rimozione delle letture contenenti adattatori;

2) rimozione delle letture contenenti polyA e poly;

3) rimozione di read contenenti più del 5% di nucleotidi sconosciuti (N);

4) rimozione delle letture di bassa qualità contenenti più del 20% di basi di bassa qualità (valore Q inferiore o uguale a 20).

La qualità di dieci sequenze è stata verificata utilizzando FastQC [30] (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/, 0.11.9). compreso il contenuto Q20, Q30 e GC dei dati puliti. Successivamente, è stato prodotto un totale di G bp di letture accoppiate e pulite. I dati grezzi della sequenza sono stati inviati ai set di dati NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) con numero di accesso GSE154223.

Il genoma/annotazione di riferimento era Mus_musculus.GRCm38. La fonte e la versione dell'annotazione genetica utilizzata per le analisi era Ensembl_v88.

Assemblaggio delle trascrizioni

Innanzitutto, Cutadapt [29] è stato utilizzato per rimuovere le letture che contenevano contaminazione dell'adattatore, basi di bassa qualità e basi indeterminate. La qualità di dieci sequenze è stata alimentata utilizzando FastQC (http://www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/). Abbiamo usato Bowtie2 [31] e Hisat2 [32] per mappare le letture sul genoma del topo. Le letture mappate di ciascun campione sono state assemblate utilizzando StringTie [33]. Dieci, tutte le trascrizioni dacampioni di renisono stati uniti per ricostruire un trascrittoma completo utilizzando gli script Perl. Dopo che è stato generato il trascrittoma finale, StringTie [33] e edgeR [34] sono stati utilizzati per stimare i livelli di espressione di tutte le trascrizioni.

Identificazione dell'LncRNA

Innanzitutto sono stati scartati i trascritti che si sovrapponevano a mRNA noti e i trascritti più brevi di 200 bp. Quindi abbiamo utilizzato CPC [35] e CNCI [36] per prevedere le trascrizioni con potenziale di codifica. Tutte le trascrizioni con punteggio CPC<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

Analisi dei geni di analisi differenzialmente espressi (DGE).

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 erano considerati geni differenzialmente espressi.

Predizione del gene target e analisi funzionale degli lncRNA

Per esplorare la funzione della funzione degli lncRNA, abbiamo previsto i geni bersaglio cis degli lncRNA. Gli LncRNA possono svolgere un ruolo cis nell'agire sui geni bersaglio vicini. In questo studio, i geni codificanti in 100,000 a monte e a valle sono stati selezionati mediante script Perl. Quindi, abbiamo mostrato un'analisi funzionale dei geni bersaglio per gli lncRNA utilizzando gli script BLAST2GO [39]. Il collegamento completo dei comandi al dominio pubblico era Jie-Li/README.md in main · dandan-li/Jie-Li (github.com).

Categorie di ontologia genetica (GO) e analisi dell'Enciclopedia di geni e genomi di Kyoto (KEGG).

L'analisi bioinformatica per il sequenziamento dell'RNA è stata eseguita utilizzando gli strumenti OmicStudio (http://www.omicsudio.cn/tool). L'analisi di arricchimento funzionale di Gene Ontology (GO) e l'analisi di arricchimento dell'Enciclopedia di geni e genomi di Kyoto (KEGG) [37-39] sono state utilizzate per analizzare le funzioni biologiche dei geni bersaglio previsti. L'analisi GO chiarisce i principali processi biologici attraverso tre aspetti: composizione cellulare, funzioni molecolari e processi biologici (http://www.geneontology.org/). L'analisi inserisce innanzitutto tutti i geni espressi in modo differenziale e i geni di fondo nel database GO. Ogni elemento viene mappato, viene calcolato il numero di geni in ciascun elemento e la distribuzione ipergeometrica viene utilizzata per eseguire test di ipotesi per ottenere il valore P del risultato dell'arricchimento. Più basso è il valore P, più significativo è il risultato dell'arricchimento. KEGG è una risorsa di database che analizza gli mRNA espressi in modo differenziale dalla biologia genetica per esplorare importanti percorsi correlati ai geni bersaglio (https://www.genome.jp/kegg/). I risultati sono espressi da valori p; più basso è il valore p, più significativo è il risultato dell'arricchimento.

qRT–PCR

GAPDH è stato utilizzato come controllo endogeno. Quindi, sono stati calcolati i livelli di espressione relativi di geni sconosciuti. Tutti i primer sono stati progettati e sintetizzati appositamente per questo esperimento. Sono stati commercializzati primer per GAPDH. La specificità dei primer Adra1a e Csnk1a1 è stata identificata dal singolo picco della curva di fusione.

Costruisci una rete di coespressione mRNA‑lncRNA

La transregolamentazione si è basata sulla ricerca e quindi è stata calcolata l’energia trans. Minore era l'energia trans, maggiore era la possibilità di legame. Quindi è stato calcolato anche il coefficiente di correlazione di mRNA-lncRNA. La rete mRNA-lncRNA è stata costruita scegliendo un coefficiente di correlazione di Spearman superiore a 0.9. La rete di coespressione mRNA-lncRNA è stata costruita utilizzando il software Cytoscape (v3.7.1).

Coltura cellulare

Cellule epiteliali tubulari prossimali renali di topo (MRPT-EpiC) sono state coltivate in cellule epiteliali animali di medie dimensioni (EpiCM-a, Cat. n. 4131) contenenti il ​​2% di siero bovino fetale (FBS, Cat. n. 0010) e supplemento per la crescita delle cellule epiteliali nell'animale (EpiCGS-a, Cat. #4182) senza antibiotici in un incubatore umidificato a 37 gradi e 5% di CO2. Il terreno di coltura è stato cambiato ogni 2-3 giorni. Le cellule nella fase di crescita logaritmica sono state sottocoltivate quando la crescita ha raggiunto il 90%. La sospensione cellulare digerita dalla trypsin è stata seminata in piastre a 6-pozzetti con 2*104 -5*104 cellule in ciascun pozzetto. Le cellule utilizzate per la trasfezione erano tutte di generazione compresa tra la 2 e la 5.

Costruzione di plasmidi e trasfezione cellulare

Il plasmide di sovraespressione lncRNA Gm43360 è stato costruito da GeneChem (Shanghai, Cina). La struttura portante del plasmide era GV658 e il promotore del CMV guidava l'espressione dell'lncRNA. La sequenza nucleotidica clonata è fornita nel materiale supplementare. Per il knockdown dell'lncRNA Gm43360, tre lncRNA ENS DEVONO00000197656-target siRNA (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3'; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'-CCCUGUCACUCA UGAAGUUTT-3'; e lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAAUAAACUCAAUGGGTT-3') sono stati progettati e sintetizzati presso GenePharma (Shanghai, Cina). Secondo il protocollo del produttore, le cellule sono state trasfettate con 2500 ng di plasmide o 100 pmol di siRNA con 6 µl di reagente di trasfezione Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, USA) per pozzetto. I livelli di espressione di RNA e proteine ​​sono stati rilevati 48 ore dopo la trasfezione e ciascun esperimento è stato ripetuto almeno tre volte. La PCR quantitativa in tempo reale è stata utilizzata per convalidare l'efficienza della sovraespressione e del knockdown di lncRNA Gm43360.

Analisi Western Blot

Le cellule in coltura sono state lavate con PBS ghiacciato, sono stati aggiunti 120 µl di tampone RIPA (Heart, Cina) e sono stati aggiunti inibitore della proteasi e PMSF (Heart, Cina) per 30 minuti su ghiaccio. Dopo aver raccolto le cellule in diverse provette da microcentrifuga, la concentrazione proteica è stata quantificata. Il tampone di caricamento è stato aggiunto a ciascun campione e poi fatto bollire per 7 minuti. Trenta microgrammi del campione sono stati separati mediante SDS-PAGE al 12% (Beyotime, Cina) ed elettrotrasferiti su membrane PVDF (Thermo Fisher, USA). Successivamente le membrane sono state bloccate con latte al 5%. Le membrane sono state incubate con anticorpi primari specifici: anti-p21 (1:1000, Abcam, ab109199), anti-p53 (1:1000, Proteintech, 10442-1-AP) e anti-GAPDH (1:3000, Profintech , 60004-1-Ig) durante la notte a 4 gradi . Dopo il lavaggio con TBST, le membrane sono state incubate con un anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente. Le bande proteiche sono state osservate utilizzando un kit di chemiluminescenza (Millipore, USA). L'espressione di GAPDH è stata utilizzata per normalizzare i livelli proteici.

Saggio di proliferazione cellulare

La capacità di proliferazione cellulare è stata determinata mediante il test del kit di conteggio delle cellule-8 (CCK-8). Quarantotto ore dopo la trasfezione, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 90 µl di nuovo terreno e 10 µl di soluzione CCK-8 (Beyotime, C0042). Le cellule sono state incubate per 1–4 ore a 37 gradi in CO2 al 5% e misurate a 450 nm mediante un lettore di micropiastre universale (Bio-Tek, USA).

Analisi citofluorimetrica

Le cellule sono state piastrate in piastre a 6-pozzetti il ​​giorno prima della trasfezione. Quarantotto ore dopo la trasfezione, le cellule sono state trypsinizzate e centrifugate a 1000 giri al minuto per 5 minuti. Quindi, le cellule sono state fissate in etanolo al 70% a 4 gradi per almeno 4 ore. Dopo la centrifugazione, alle cellule è stata aggiunta la soluzione colorante RNasi A e ioduro di propidio (PI) e le cellule sono state quindi incubate per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Le cellule colorate con Te sono state analizzate utilizzando un ACEA NovoCyte (Biosciences, USA).

analisi statistica

I dati di misurazione mediante la distribuzione normale sono presentati come media ± DS. La differenza tra i due diversi gruppi è stata determinata utilizzando il test t di Student non appaiato a due code e un valore p < 0.05 è stato considerato statisticamente significativo. Tutti i calcoli sono stati eseguiti utilizzando GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., USA).

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