Il precedente apprendimento della paura consente la rapida assimilazione di nuovi ricordi di paura direttamente nelle reti corticali Parte 3

Design sperimentale

La riproducibilità dei dati è stata valutata con diverse repliche (Tabella S1). I primi esperimenti di inattivazione del CNQX in Te2 (Fig 1A-1C) sono stati eseguiti in un numero maggiore di repliche perché sono stati i primi esperimenti che abbiamo condotto e sono serviti a testare l'ipotesi principale del nostro studio. Gli animali sono stati assegnati a priori a diversi gruppi comportamentali in modo bilanciato in termini di peso. Animali maschi della stessa covata sono stati assegnati in modo casuale a ciascun gruppo sperimentale. Per prima cosa abbiamo affrontato l'ipotesi principale del nostro studio, cioè che l'inattivazione corticale può influenzare in modo diverso il consolidamento di un nuovo ricordo di paura nei ratti sperimentalmente naïve e negli animali che avevano appreso un precedente evento di paura.

Gli animali maschi hanno una memoria estremamente forte perché hanno un istinto di sopravvivenza e un desiderio di riprodursi più forti. Gli animali che sopravvivono in natura hanno bisogno di ricordare molte informazioni geografiche, tipi di cibo, tracce dei predatori e posizione dei membri del gruppo per adattarsi meglio all’ambiente e proteggere la vita.

Ad esempio, i leoni maschi devono ricordare lo status dell'intero territorio, i rapporti di appartenenza e le posizioni dei concorrenti per proteggere il territorio e il loro status. Le zebre maschi devono ricordare la posizione delle fonti d'acqua e del cibo nella prateria per sopravvivere e riprodursi. Una volta un'azienda produttrice di bibite pubblicò un annuncio in cui mostrava che un orso polare maschio poteva ricordare un sub e il suo profumo unico in modo da poterlo identificare la prossima volta che lo vedevano.

Pertanto, gli animali maschi devono avere una memoria forte in termini di protezione del proprio territorio, fornitura di cibo sufficiente e riproduzione della prole. Ciò li rende anche soggetti importanti nella ricerca umana, ad esempio per esplorare malattie come i disturbi della memoria e il morbo di Alzheimer.

Nel mondo umano possiamo ispirarci anche al ricordo degli animali maschi. L’esposizione continua a cose nuove, l’apprendimento continuo e il pensiero possono migliorare la nostra memoria e la nostra adattabilità, nonché migliorare il nostro tenore di vita e l’efficienza lavorativa. Pertanto, impariamo dagli animali maschi, continuiamo ad accumulare conoscenza ed esperienza, abbiamo forti istinti di sopravvivenza e desideri riproduttivi e creiamo un futuro migliore. Si può vedere che dobbiamo migliorare la nostra memoria. La Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria perché la Cistanche deserticola è un materiale medicinale tradizionale cinese con molti effetti unici, uno dei quali è quello di migliorare la memoria. L'efficacia della carne macinata deriva dai vari principi attivi che contiene, tra cui acidi, polisaccaridi, flavonoidi, ecc. Questi ingredienti possono promuovere la salute del cervello in vari modi.

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Nel caso di differenze statistiche tra questi gruppi, abbiamo poi eventualmente eseguito ulteriori gruppi di controllo attraverso l'iniezione di soluzione salina. Un approccio simile è stato applicato agli esperimenti optogenetici, in cui il gruppo di controllo AAV è stato eseguito solo dopo aver rilevato differenze statistiche tra ratti naïve e precedentemente addestrati. Questi programmi sperimentali hanno permesso di evitare gruppi di controllo non necessari e l'utilizzo di animali non necessari, questione chiave nella legislazione europea e italiana sulla sperimentazione animale (principio delle 3 R).

Procedure comportamentali

Tutti gli esperimenti sono stati condotti durante la fase di luce del giorno (dalle 8:00 alle 16:00). Gli animali sono stati trasportati singolarmente dalla struttura alle sale sperimentali all'interno di diversi piccoli secchi trasparenti a seconda delle esigenze sperimentali.

Training uditivo: prima sessione comportamentale. Animali uditivi condizionati dalla paura (CS1-CS2). In questo gruppo, i ratti sono stati prelevati delicatamente dalla gabbia di casa e trasportati dalla stanza di stabulazione alla stanza insonorizzata. Una volta lì, gli animali sono stati posti all'interno dell'apparato di condizionamento costituito da una gabbia nera rettangolare (35 × 40 cm) dotata di una griglia di aste in acciaio inossidabile (1 cm di diametro, distanziate di 1,5 cm l'una dall'altra) collegata a un sistema di erogazione della scarica.

I ratti sono stati lasciati indisturbati per 1 minuto. Dopo questo tempo, sono stati somministrati 7 stimoli condizionati (CS) costituiti da un tono puro di 15 kHz di frequenza (15 s di durata ciascuno, 80 dB, intervallo di prove di 36 s). L'ultimo 1 s di ciascun tono è stato abbinato a un'ecografia dolorosa (0,5 mA, 1 s). Al termine della sessione di condizionamento, i ratti sono stati riportati nella gabbia di origine.

Animali solo shock (shock-CS2). In questo gruppo, i ratti sono stati collocati in modo simile all'interno dello stesso apparato di condizionamento. Immediatamente dopo, ciascun ratto è stato sottoposto a 7-shock ai piedi (1 s, 0,5 mA) uno immediatamente dopo l'altro. Al termine della stimolazione gli animali sono stati riportati nella gabbia di origine. Il tempo di permanenza nella gabbia di condizionamento è stato inferiore a 9 secondi. Studi precedenti hanno dimostrato che questa procedura consente di evitare processi associativi tra stimoli dolorosi e stimoli sensoriali [29,30].

Animali condizionati dalla paura degli odori (odore-CS2). In questo gruppo, i ratti sono stati posti all'interno della stessa gabbia nera rettangolare impiegata nei gruppi sperimentali di cui sopra e collegati a un sistema di erogazione della scarica. I ratti sono stati lasciati indisturbati per 2 minuti. Dopo questo tempo, sono stati somministrati 7 CS costituiti da odori di vaniglia (10 s di durata ciascuno, intervallo di prova di 24 s). L'ultimo 1 s di ciascun odore è stato abbinato a un'ecografia dolorosa (0,5 mA, 1 s). Il modulo di condizionamento è stato posto in prossimità di una fonte di ventilazione per evitare la persistenza degli stimoli erogati dopo il loro offset. La gabbia era assicurata con una griglia superiore. Gli odori sono stati presentati utilizzando un olfattometro a diluizione del flusso. L'aria pulita (1,5 L/min) veniva diretta a un'elettrovalvola che, una volta azionata, faceva passare l'aria a una bottiglia da 15 ml contenente 10 ml di odore di vaniglia.

Animali solo tono (Tone-CS2). I ratti di questo gruppo sono stati posti all'interno della stessa gabbia nera e gli è stato presentato il tono 15-kHz (7 stimoli, 15 s di durata, 36 s ITI) erogato in assenza degli Stati Uniti.

Animali pre-esposti (Tone-CS1-CS2). I ratti sono stati posti all'interno della gabbia di condizionamento e, 1 minuto dopo, è stato presentato loro 20 volte solo con il tono 15-kHz e 24 ore dopo lo stesso tono è stato accoppiato con l'US che è diventato il CS1.

Animali condizionati dalla paura con rumore bianco (WN-CS2). In questo gruppo, i ratti sono stati posti all'interno della gabbia nera rettangolare e lasciati indisturbati per 1 minuto. Dopo questo tempo, sono stati somministrati 7 CS costituiti da un WN (15 s di durata ciascuno, 75 dB, 36 s di intervallo tra le prove). L'ultimo 1 s di ciascun tono è stato abbinato a un'ecografia dolorosa (0,5 mA, 1 s). Al termine della sessione di condizionamento, i ratti sono stati riportati nella gabbia di origine.

Apprendimento della paura uditiva: secondo training comportamentale. Due settimane dopo le procedure descritte nel paragrafo precedente, gli animali sono stati addestrati in un altro compito diverso di condizionamento della paura uditiva. I ratti sono stati messi in una scatola skinner standard, come nel nostro lavoro precedente [10], e lasciati indisturbati per 2 minuti. Trascorso questo tempo, sono stati erogati 7 CS costituiti da toni puri di 3 kHz di frequenza (8 s di durata ciascuno, 80 dB, 22 s di intervallo tra le prove). L'ultimo 1 s di ciascun tono è stato abbinato a un'ecografia dolorosa (0,5 mA, 1 s). Al termine della sessione di condizionamento, i ratti sono stati riportati nella gabbia di origine.

Paura della ritenzione della memoria. La ritenzione della memoria uditiva della paura recentemente acquisita al CS2 (3 kHz) è stata testata 4 giorni dopo. Per gli esperimenti di optogenetica, il test della memoria recente è stato eseguito con erogazione del laser 24 ore dopo l'apprendimento CS2-US in analogia all'intervallo di tempo in cui abbiamo eseguito l'inattivazione corticale attraverso la somministrazione del CNQX (cioè, 24 ore dopo formazione). I ratti sono stati abituati a un apparato diverso da quello utilizzato per il condizionamento e posti in una stanza diversa per evitare comportamenti di paura condizionati da segnali contestuali [10,62].

Il nuovo apparecchio era costituito da una gabbia di plastica trasparente con un lato verniciato di nero racchiusa all'interno di una scatola fonoassorbente dotata di un aspiratore, che eliminava l'aria odorizzata dall'involucro e forniva un rumore di fondo di 60 dB. Agli animali è stato permesso di esplorare la gabbia per 5 minuti al giorno durante la sessione di assuefazione. Il giorno del test di ritenzione della memoria della paura, dopo 2 minuti di esplorazione libera, abbiamo erogato 4 CS2 da 3 kHz (8 s—22 ITI) non seguite da alcuna ecografia.

Se richiesto dalla richiesta sperimentale, i ratti sono stati poi testati per la ritenzione della memoria remota della paura, acquisita 2 settimane prima della seconda prova di condizionamento uditivo alla paura. A questo scopo, 7 giorni dopo il test di ritenzione della memoria della paura al tono 3-kHz, gli animali sono stati messi in un ambiente nuovo (una gabbia a strisce bianche e nere) e poi presentati con il tono 15-kHz. Quattro toni sono stati presentati a intervalli di 36 secondi.

Formazione contestuale: prima sessione comportamentale. Gruppo di condizionamento contestuale alla paura (CtxA-CtxB). In questo gruppo, i ratti sono stati prelevati delicatamente dalla gabbia di casa, posti in un secchio e trasportati dalla stanza di stabulazione alla stanza insonorizzata. Una volta lì, gli animali venivano posti all'interno dell'apparato di condizionamento costituito dalla suddetta gabbia rettangolare nera, dotata di griglia di tondini di acciaio inossidabile collegata ad un dispositivo di erogazione degli shock. I ratti sono stati lasciati indisturbati per 1 minuto. Dopo questo tempo, sono stati somministrati 5 US (0,5 mA, 1 s) con intervalli di tempo di 51 s. Al termine della sessione gli animali sono stati riportati nella gabbia di origine.

Gruppo di solo shock (shock-CtxB). I ratti, una volta posti all'interno dell'apparato di condizionamento, ricevevano immediatamente 5-shock ai piedi (1 s, 0,5 mA) uno subito dopo l'altro. Il tempo di permanenza nella gabbia di condizionamento è stato inferiore a 7 secondi. Studi precedenti hanno dimostrato che questa procedura consente di evitare processi associativi tra stimoli dolorosi e stimoli sensoriali [29,30].

Gruppo di solo shock (shock-CtxB). I ratti, una volta posti all'interno dell'apparato di condizionamento, ricevevano immediatamente 5-shock ai piedi (1 s, 0,5 mA) uno subito dopo l'altro. Il tempo di permanenza nella gabbia di condizionamento è stato inferiore a 7 secondi. Studi precedenti hanno dimostrato che questa procedura consente di evitare processi associativi tra stimoli dolorosi e stimoli sensoriali [29,30].

Nuovo condizionamento contestuale alla paura e recente conservazione della memoria della paura. Due settimane dopo le procedure descritte nel paragrafo precedente, tutti i gruppi sono stati addestrati ad associare un nuovo ambiente contestuale (il modulo skinner box, posizionato in una stanza diversa) con un'ecografia dolorosa (0,5 mA, 1 s) . Ciascun animale è stato posto all'interno della nuova camera e lasciato indisturbato per 2 minuti. Successivamente è stato esposto a 5 US separati da intervalli di 30 s.

La ritenzione della memoria contestuale della paura è stata testata 4 giorni dopo la procedura di condizionamento della paura mettendo nuovamente i ratti nella camera della scatola di Skinner per 3 minuti. Per gli esperimenti di optogenetica, il test della memoria recente è stato eseguito con erogazione del laser 24 ore dopo l'apprendimento del CtxB-US in analogia all'intervallo di tempo in cui abbiamo eseguito l'inattivazione corticale attraverso la somministrazione del CNQX (cioè 24 ore dopo l'allenamento). Se richiesto dalla richiesta sperimentale, i ratti sono stati poi testati per la ritenzione della memoria remota della paura inserendo gli animali nel contesto accoppiati agli US 2 settimane prima della nuova associazione.

Gli animali sono stati trasportati in 2 diversi secchi alle camere di condizionamento secondo le diverse procedure contestuali.

Misura di congelamento. In tutte le procedure sperimentali, la valutazione della ritenzione della memoria della paura è stata determinata come una risposta di congelamento [10], analizzata come la completa assenza di mobilità somatica ad eccezione dei movimenti respiratori. Per ciascun animale, la quantità di tempo (in secondi) trascorso nel congelamento è stata misurata offline da 2 osservatori indipendenti che erano in cieco rispetto ai gruppi di animali.

Procedure chirurgiche

Per somministrare le sostanze selezionate nei siti target, i ratti sono stati anestetizzati con isoflurano: l'induzione è stata eseguita al 4% [vol/vol] in 2 L/min di aria medicale ed estesa ad un'esposizione continua al 2% [vol/vol]) quando i ratti venivano montati nell'apparato stereotassico.

È stata praticata un'incisione del cranio e sono stati praticati piccoli fori per consentire la penetrazione di un ago per infusione di 28-calibro. Per somministrare le sostanze veniva utilizzata una siringa 10-ul Hamilton montata su una pompa per infusione. Dopo le infusioni, l'ago è stato lasciato in sede per altri 3 minuti. L'incisione è stata quindi chiusa con clip per ferite in acciaio inossidabile e all'animale è stata somministrata un'iniezione sottocutanea del ketoprofene analgesico/antinfiammatorio (2 mg/kg di peso corporeo) e l'animale è stato tenuto al caldo e sotto osservazione fino al recupero dall'anestesia.

Come negli studi precedenti [10,32–34], l'incannulamento degli animali non era necessario, poiché i composti attivi venivano somministrati direttamente per via stereotassica. Questa procedura è vantaggiosa perché viene evitato il trauma chirurgico inerente alla procedura di incannulamento permanente, limitando così il trauma ad una singola penetrazione dell’ago [10,32–34]. In effetti, l’anestesia generale non influisce in modo significativo sul consolidamento della memoria [10,32–34]. Per garantire che i tempi di somministrazione dei composti relativi alla prova di apprendimento fossero accurati in modo che i ratti ricevessero i composti selezionati circa 1 ora e circa 1 giorno dopo l'addestramento, l'anestesia con isoflurano è stata indotta 5 minuti prima del momento dell'iniezione pianificata, ad esempio, a 55 min nei ratti trattati 60 minuti dopo l'allenamento e 23 ore e 55 minuti negli animali iniettati 24 ore dopo l'addestramento. Ciascun ratto è stato condizionato e poi operato separatamente. Gli animali appartenenti ai diversi gruppi comportamentali sono stati manipolati in modo interleaved.

L'inibitore selettivo dei recettori AMPA/kainato del glutammato CNQX ({{0}}ciano-7-nitrochinossalina-2,3-dione) (Tocris, 10 ng /ul) [20,21] è stato sciolto in una soluzione salina sterile (NaCl, 0,9%) e regolato a pH 7,4 con HCl. L'inibitore della sintesi proteica anisomicina (Merck, 125 ug/ul) è stato sciolto in HCl equimolare, diluito con soluzione salina sterile e regolato a pH 7,4 con NaOH. Come veicolo di controllo è stata utilizzata soluzione salina sterile (0,9% NaCl). Queste sostanze sono state iniettate bilateralmente ad una velocità di 0,1 ul/min e un volume di 0,5 ul per sito alle seguenti coordinate stereotassiche prese dall'atlante di Paxinos e Watson [26], con il campo corticale Te2 riferito all'atlante di Zilles [25]:

Corteccia uditiva secondaria (Te2): 1) AP: −5,8 L: ±7,2 DV: −6. 2) AP: -6,8 L: ±7,2 DV: −6.

Corteccia cingolata anteriore (ACC): 1) AP: +2,5 L: ±0,6 DV: −2,2. 2) PA: +3,7 L: ±0,6 DV: −2,2.

Il volume di iniezione (0,5 ul per sito) è stato selezionato sulla base di studi precedenti in cui i composti attivi venivano iniettati in Te2 [10,34] e ACC [55,63] in ratti adulti.

Per inattivare l'ippocampo dorsale, i composti attivi sono stati iniettati in un volume di 0,6 ul per sito alle seguenti coordinate stereotassiche:

Ippocampo dorsale: 1) AP: −2,8 L: ±1,6 DV: −3,3. 2) AP: −4,2 L: ±2,6 DV: −3.

Le lesioni irreversibili dell'ippocampo dorsale sono state indotte mediante la somministrazione di NMDA (Tocris, 18 ug/ul, disciolto in soluzione salina sterile, 0,4 ul per sito) ad una velocità di 0,1 ul/ min nei punti alle suddette coordinate. Le stesse coordinate sono state utilizzate per i controlli iniettati con soluzione salina e per gli animali sottoposti a simulazione.

Red Retrobeads (Lumafluor, diluizione 1:2 in soluzione salina, 0,6 ul) sono stati iniettati in BLA secondo le seguenti coordinate: AP: −2,8; L: ±5,4; VD: -8.3.

Al termine degli esperimenti, sono state verificate istologicamente le tracce dell'ago nel caso di iniezioni di CNQX, anisomicina o soluzione salina o l'estensione delle lesioni nel caso di iniezioni di NMDA. I ratti sono stati profondamente anestetizzati e perfusi intracardiacamente con formaldeide al 4%. I loro cervelli sono stati sezionati a 30 μm su un criostato. Sezioni seriali colorate con Nissl sono state preparate utilizzando la procedura convenzionale e le sezioni sono state verificate istologicamente al microscopio ingrandito a 2,5×.

Esperimenti optogenetici

Iniezione di virus. Il virus adeno-associato AAV5:CaMKII ::eNpHR3.0-cherry e il vettore di controllo AAV5:CaMKII -cherry sono stati ottenuti dal Vector Core dell'Università della Carolina del Nord (Chapel Hill, Carolina del Nord, Stati Uniti d'America). Il titolo virale della frase era 5:8 Il titolo virale era 5,8 × 10^12 vg/ml per entrambi i virus. L'uso del promotore CaMKII consente l'espressione del transgene favorendo i neuroni piramidali. I virus sono stati conservati in un congelatore a -80˚C. Le infusioni virali mirate al Te2 o all'ACC sono state eseguite alle coordinate stereotassiche di cui sopra ai volumi di 0,5 ul per ciascun foro. Il virus è stato iniettato a una velocità di 0,1 ul/min e l’ago è stato lasciato in sede per altri 5 minuti. Le iniezioni virali sono state eseguite 4 settimane prima degli esperimenti di optogenetica.

Illuminazione.

Le fibre ottiche (Plexon, nucleo 200/230 μm; lunghezza 10 mm) sono state impiantate bilateralmente nel BLA (AP=−2,8, L=± 5,4, V=−8,2 mm da Bregma). L'inibizione optogenetica delle proiezioni Te2 su BLA o delle proiezioni ACC su BLA è stata ottenuta utilizzando il sistema di stimolazione optogenetica PlexBright accoppiato ad un diodo laser (Laserglow Technologies). La luce gialla (589 nm) viene generata e fatta passare attraverso una fibra ottica. La densità di potenza stimata all'estremità della fibra ottica era compresa tra 10 e 15 mW per l'illuminazione dei luoghi di proiezione. Durante la ritenzione della memoria della paura, l'emissione di luce veniva avviata 4 s prima dell'inizio del tono, persisteva per tutta la durata del tono e veniva interrotta 4 s dopo lo spostamento del tono. Gli animali appartenenti a gruppi di condizionamento contestuale alla paura hanno ricevuto stimolazione luminosa durante l'intera esplorazione del contesto (3 minuti). I ratti hanno familiarizzato con il cavo di connessione per 2 giorni prima della prova di conservazione della memoria.

Immunoistochimica. Al termine degli esperimenti di optogenetica, i ratti sono stati profondamente anestetizzati e perfusi intracardiacamente con PAF al 4% per esaminare la diffusione del virus. I cervelli sono stati sezionati, conservati per una notte a 4°C e infine trasferiti in saccarosio al 30%. Sezioni coronali (30 μm) sono state tagliate su un criostato e raccolte in PBS. Le sezioni fluttuanti sono state incubate in una soluzione bloccante per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi, sono stati incubati in anticorpo primario monoclonale di topo anti mCherry (diluizione 1:500, Abcam) nella soluzione bloccante per una notte a temperatura ambiente. Successivamente, le sezioni sono state lavate con PBS e incubate per 1 ora a temperatura ambiente con un anticorpo anti-topo fluorescente secondario AlexaFluor-568 (1:600, Invitrogen) diluito in PBS. Le sezioni sono state lavate in PBS, montate con mezzi di montaggio contenenti DAPI (Vector) e coperte con vetrino coprioggetto.

Allo stesso modo sono stati raccolti i cervelli dei ratti sottoposti a iniezioni di NMDA. Le sezioni fluttuanti, dopo diversi risciacqui, sono state incubate con anticorpo primario monoclonale di topo anti-Neun (1:1, diluizione 000, Merck) nella soluzione bloccante per una notte a temperatura ambiente. Successivamente, le sezioni sono state lavate con PBS e incubate per 1 ora a temperatura ambiente con anticorpo anti-topo di cavallo biotinilato (diluizione 1:200, Vector). Il complesso avidina-biotina (complesso ABC 1:100, Vector, 2 ore e mezza di incubazione) è stato accoppiato alla diaminobenzidina (0,03%, Merck) per colorare Neun. Le sezioni sono state quindi risciacquate in PBS e trasferite su vetrini rivestiti di gelatina, disidratate e coperte con un vetrino coprioggetto.

Le sezioni Te2 di ratti a cui sono state iniettate retrosfere sono state sottoposte ad incubazione con anticorpo primario policlonale anti-Fos di coniglio (1:2,000, segnalazione cellulare) nella soluzione bloccante durante la notte a temperatura ambiente. Successivamente, le fette sono state lavate con PBS e incubate per 1 ora a temperatura ambiente con Alexa 488 anti-coniglio (1:1,000, Invitrogen, in PBS). Infine, le sezioni immunomarcate sono state lavate in PBS, montate su vetrini rivestiti di gelatina e coperte con un mezzo di montaggio integrato con DAPI.

Microscopia

L'etichettatura di mCherry è stata esaminata utilizzando un microscopio confocale Zeiss Airyscan: sono stati utilizzati due laser (405 e 561 nm), ciascuno corrispondente allo spettro di emissione di picco per DAPI (colorazione Nissl per nuclei cellulari) e Alexa 568 (mCherry ), rispettivamente. Per analizzare la diffusione del virus nei siti di iniezione, sono state acquisite micrografie di Te2 e ACC come immagini a mosaico (ciascuna singola è stata acquisita utilizzando un obiettivo 10×). I terminali degli assoni nel BLA sono stati analizzati utilizzando un obiettivo 40 × come uno stack z di 10 sezioni, distanziate di 1 μm l'una dall'altra (quadrato di 159 μm; frazione di zoom, 1,0).

Per gli animali iniettati con retrobeads sottoposti a immunomarcatura con cFos, le immagini sono state acquisite con un ingrandimento di 40× (quadrato di 159 μm; frazione di zoom, 1,0) con 3 laser diversi, corrispondenti allo spettro di emissione di picco rispettivamente per DAPI (colorazione Nissl per nuclei cellulari), AlexaFluor 488 (cFos) e Texas Red (Retrobeads). Sezioni da 0,7 μm sono state acquisite lungo uno z-stack da 10-μm. Il numero di nuclei che esprimono cFos, marcati con sferette e doppi positivi (marcate con sferette cFos+) è stato quantificato per ciascun animale nella regione Te2 alle coordinate anteroposteriori da 6,7 ​​a 7,3 mm dal bregma [10]. È stata poi calcolata la media dei dati per produrre la media di ciascun animale e i risultati sono stati confrontati statisticamente. Le immagini delle sezioni con colorazione DAB di Neun sono state analizzate utilizzando il software Neurolucida collegato a un microscopio tramite una telecamera CCD a colori [10].

Analisi dei dati e criteri di esclusione

Il n per ciascun gruppo è stato stabilito a priori in base ai nostri studi precedenti [10,16,17], lavori precedentemente pubblicati nel campo (vedere come riferimenti per ACC [6,22,55] e Te2 [10,59]), e attraverso stime della potenza G, secondo la seguente tabella (Tabella 1):

Per ciascuna analisi, abbiamo stimato un numero medio finale di 8-10 animali per ciascun gruppo. I gruppi sono stati eseguiti con controlli interni nella stessa sessione sperimentale (Tabella S1). Data la variabilità delle procedure chirurgiche e comportamentali, abbiamo incluso a priori un numero maggiore di soggetti sperimentali (fino al 15% in più) che in alcuni casi soddisfacevano i criteri sperimentali e sono stati inclusi, evitando così un'esclusione arbitraria. Nel caso degli studi sull'ippocampo, per valutare gli effetti delle iniezioni di NMDA e CNQX a intervalli di tempo distinti, abbiamo bilanciato il numero totale di animali di controllo tra ratti veicolo e ratti operati in modo simulato tra i diversi gruppi.

L'analisi comportamentale, le ispezioni istologiche e la conta cellulare sono state eseguite in cieco. Gli animali con localizzazione inadeguata della traccia dell'ago o della lesione in caso di lesioni irreversibili NMDA sono stati esclusi dall'analisi dei dati (Tabella S1). Negli studi farmacologici, abbiamo escluso 57 animali su un totale di 465 animali a causa di un posizionamento errato dell'ago (22/255 per Te2, 31/179 per ACC e 4/31 per ippocampo). Negli studi di tracciamento, su 21 animali, abbiamo eliminato 3 soggetti in cui l'iniezione di retrobeads mancava il BLA. Negli studi optogenetici Te2, su un totale di 30 animali, abbiamo escluso 1 ratto perché il posizionamento delle fibre ottiche non era al di sopra della regione target, 1 ratto. Dopotutto, il virus era assente nei ratti Te2 e in 2 perché la diffusione del virus era rispettivamente inferiore al 4,7% e al 5,3% dell'area Te2 nei siti di iniezione. Nei ratti inclusi nell'analisi statistica, la diffusione minima del virus è stata del 39,6% nella coordinata stereotassica più anteriore e del 50,2% nella coordinata stereotassica più posteriore.

Allo stesso modo, negli esperimenti di optogenetica dell'ACC, su un totale di 32 animali, 2 ratti sono stati eliminati perché il posizionamento delle fibre ottiche non era al di sopra della regione bersaglio. Due ratti sono stati esclusi perché il virus nell'ACC era assente, 1 animale perché il virus era presente nella corteccia motoria secondaria adiacente e 1 ratto perché la diffusione del virus era inferiore al 2,3% dell'area dell'ACC nei siti di iniezione. Nei restanti ratti, la diffusione minima del virus è stata del 33,3% alla coordinata stereotassica più anteriore e del 42,2% alla coordinata più posteriore.

Negli studi sulle lesioni NMDA, le lesioni colpivano principalmente la regione CA1 dell'ippocampo dorsale. L'estensione minima (rossa) e massima (rosa) delle lesioni ippocampali sull'intera area dell'ippocampo dorsale erano rispettivamente del 23,2% e 53,5% alla coordinata stereotassica più anteriore e del 28,3% e 62,3% alla coordinata più posteriore. Su un totale di 73 animali, 4 ratti sono stati eliminati perché la lesione era assente, mentre altri 3 animali sono stati scartati perché l'estensione delle lesioni era inferiore al 5,0% (ovvero 4,8%, 4,3%, 3,1 %) riguardante l'area dell'ippocampo alle 2 coordinate.

L'analisi del contorno dell'area è stata eseguita tramite ispezione visiva e quantificazione manuale utilizzando lo strumento di contorno della regione del software ZEN 3.0. I valori dell'area sono stati poi normalizzati sulla superficie totale della regione. Le coordinate stereotassiche di Te2, ACC e ippocampo erano basate sull'atlante di Paxinos [26] e, nel caso di Te2, con il campo corticale riferito all'atlante di Zilles [25].

analisi statistica

Tutti i dati sono presentati come media ± SEM. Tutti i dati hanno superato il test di Levene per l'uguaglianza delle varianze. Pertanto, durante tutti gli esperimenti sono state utilizzate statistiche parametriche. I dati di 2 gruppi sono stati confrontati utilizzando test t di Student a 2-coda non appaiati. I confronti tra gruppi multipli sono stati valutati utilizzando un test ANOVA 1-way con il test post hoc di Tukey. Per affrontare le differenze tra e all'interno dei gruppi, abbiamo calcolato un modello ANOVA a progettazione mista 3 × 2 con un gruppo (CS1-CS2, Tone-CS1-CS2, WN-CS2) come tra- variabile dei soggetti e condizione (prima e dopo il recente condizionamento + iniezione) come variabile entro i soggetti. Laddove l'interazione gruppo x condizione era significativa, abbiamo eseguito una semplice analisi degli effetti principali e abbiamo corretto ciascun valore p con la correzione di Bonferroni. Per ciascun modello ANOVA misto, abbiamo valutato l'ipotesi di sfericità attraverso il test di sfericità di Mauchly.

I parametri statistici (cioè il valore esatto di n per ciascun gruppo, SEM, test statistico, dimensione dell'effetto e valore p esatto) sono riportati nelle legende. A parità di dimensioni del campione, le dimensioni dell'effetto per i t-test non appaiati sono state determinate calcolando il d di Cohen o il d di Glass in base alla somiglianza delle SD mentre, per dimensioni del campione diverse, il g di Hedges. Le correlazioni tra il conteggio delle cellule e il congelamento sono state calcolate utilizzando il coefficiente di Pearson. Per determinare se i dati soddisfacevano le ipotesi dell'approccio statistico, abbiamo rifiutato l'ipotesi nulla al livello P < 0.05. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando SPSS Statistics 22 (IBM).

Informazioni di supporto

S1 Fig. Ingrandimento delle tracce dell'ago di Te2 (A) e della corteccia ACC (B) iniettate con CNQX, selezionate come esempi. (C) Quando rappresentati con lo stesso contesto 2 settimane dopo la procedura, gli animali sottoposti a solo shock hanno mostrato una bassa risposta di paura, dimostrando che la procedura non ha suscitato il congelamento condizionato nel contesto in cui è stato erogato lo shock. (D) Risultati simili a quelli della Fig. 1 sono stati ottenuti controbilanciando i 2 toni utilizzati come CS (CS1, 3 kHz e CS2, 15 kHz) (test t di Student, t(14)=3.44, p {{ 13}}.0040, Glass d=4.14). (E) Nei ratti condizionati con CS-odore il congelamento all'odore, 2 settimane dopo il condizionamento, era elevato anche se testati in un ambiente diverso rispetto al contesto di condizionamento, dimostrando così che la paura era specificamente associata a questo segnale. Barre di scala, 300 μm. ��P < 0,01. Tutti i dati sono medi e SEM. I dati di riepilogo per S1 Fig possono essere trovati nelle informazioni di supporto nel file denominato S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S2 Fig. L'iniezione di CNQX ha compromesso la ritenzione dei recenti ricordi uditivi della paura nei ratti in cui la generalizzazione della paura è stata abbassata da un solo tono pre-esposizione o utilizzando un tono di rumore bianco come CS1. Un'ANOVA a disegno misto 3 × 2 (effetto principale del gruppo: F(2,42)=6.478, p {{10}}.00 4, η2=0.236, effetto principale della condizione: F(1,42)=0.161, p=0.691, η2=0.004, gruppo × l'interazione della condizione F(2,42)=3.942, p=0.027, η2=0.158) ha mostrato che il congelamento al tono a 3 kHz prima della sua associazione agli Stati Uniti era inferiore in animali che hanno ricevuto la pre-esposizione al tono di 15 kHz prima dell'accoppiamento a 15 kHz-US (n=10, p=0.001) o in ratti condizionati a un rumore bianco (n=13 , p=0.008) rispetto agli animali CS1-CS2 (n=22) che hanno mostrato una risposta di generalizzazione della paura variabile. Tuttavia, dopo l’apprendimento CS-US e le iniezioni di cnqx nella corteccia Te2, la memoria della paura recente era compromessa in tutti i gruppi (p > 0,05). Effetto principale semplice all'interno dei gruppi (prima e dopo l'apprendimento CS-US seguito dall'iniezione cnqx): CS1-CS2, p=0.025; Tono-CS1-CS2, p=0.189; WN-CS2, p=0.347) �P < 0,05, ��P < 0,01. Tutti i dati sono medi e SEM. I dati di riepilogo per S2 Fig sono reperibili nelle informazioni di supporto nel file denominato S1 Supporting Figure Data. (TIF)

S3 Fig. (A) Esempio casuale di iniezione di retrosfere mirate al BLA. (B e C) Esempi di posizionamenti di fibre ottiche sopra il BLA di animali iniettati con vettori AAV in Te2 (B) e corteccia ACC (C). Barre di scala, 500 μm.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Dott. E. Manassero per il suo continuo supporto e consiglio.

Contributi dell'autore

Concettualizzazione: Giulia Concina, Annamaria Renna, Benedetto Sacchetti.

Cura dei dati: Giulia Concina, Luisella Milano, Benedetto Sacchetti.

Analisi formale: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Acquisizione finanziamenti: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Indagine: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Metodologia: Giulia Concina, Annamaria Renna, Luisella Milano.

Supervisione: Benedetto Sacchetti.

Validazione: Benedetto Sacchetti.

Scrittura – bozza originale: Giulia Concina, Benedetto Sacchetti.

Scrittura – revisione e editing: Annamaria Renna, Luisella Milano.

Riferimenti
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