La progressione della malattia renale cronica non diabetica è arrestata dal trattamento con metformina nei ratti Ⅲ

DISCUSSIONE

Dopo decenni di ricerca,insufficienza renale cronicacontinua ad essere unquestione sanitaria globalenella maggior parte dei pazienti la diagnosi viene effettuata quando la malattia renale cronica è già accertata (stadi 2–3a o anche 3b–4). Sebbene astile di vita sano e corretta gestione del diabeteEipertensionepuò impedire l'insorgenza orallentare la progressione della CKD, manca un trattamento efficace. Nel presente studio, la metformina ha dimostrato un potente effettoefficacia terapeuticaarrestando la progressione della malattia renale cronica accertata in uninsufficienza renale cronica indotta da adeninamodello di ratto. È stato dimostrato che il trattamento preventivo con metforminapreservare la funzionalità renalein modelli di roditori con insufficienza renale cronica diabetica e non diabetica.37,38 Inoltre, abbiamo recentemente dimostrato che nel modello di ratto con insufficienza renale cronica indotta da adenina e disturbi minerali e ossei, il trattamento preventivo con metformina ha attenuato lo sviluppo di insufficienza renale cronica grave nonché i conseguenti problemi vascolari e ossei. comorbidità.14 Tuttavia, i dati sul suo potenziale come farmaco terapeutico sono scarsi.

NUOVA FORMULAZIONE A BASE DI ERBERALLENTARE LA PROGRESSIONE DELLA CKD

Figura 8|Analisi di sovrarappresentazione dell'elenco primario di proteine ​​differenzialmente espresse (DEP). La lunghezza della barra rappresenta il significato del percorso. Inoltre, più luminoso è il colore, più significativo è il percorso

Recentemente, Borges et al.39 hanno studiato l'effetto terapeutico della metformina in un modello di nefrectomia subtotale. Il trattamento con metformina (300 mg/kg, in acqua potabile) è stato iniziato 30 giorni nel modello quando sono stati notati pressione arteriosa sistolica e albuminuria più elevate, anche se in assenza di aumentati livelli di creatinina sierica. Dopo 120 giorni di trattamento con metformina, sono stati osservati abbassamento della pressione sanguigna, albuminuria e una minore fibrosi renale interstiziale, mentre non è stato osservato alcun effetto benefico della metformina sui livelli di creatinina sierica.39 Sebbene questo studio confermi un impatto favorevole della metformina su un rene disfunzionale, Il modello era troppo blando e con un tasso di progressione troppo lento per giungere a una conclusione diretta sul vero potenziale terapeutico della metformina. Nel nostro modello di ratto con CKD indotta da adenina, la CKD da lieve a moderata è stata confermata all'inizio del trattamento da un aumento da 2- a 3- volte della creatinina sierica dopo 4 settimane e da un aumento del 3- un aumento di 4-volte dei valori di creatinina sierica dopo 5 settimane di dieta adenina, corrispondenti rispettivamente alla categoria GFR da G2 a G3 e alla categoria G3. Dopo 8 e 9 settimane di dieta adenina, negli animali trattati con il veicolo è stata osservata una grave insufficienza renale (ovvero un aumento di 10-volte della creatinina sierica rispetto ai valori basali), corrispondente alla categoria GFR da G4 a G5 (ovvero , malattia renale allo stadio terminale) e confermando il progressivo declino funzionale in questo modello. Il trattamento con metformina, a partire dall’insorgenza di CKD lieve (4 settimane) e anche moderata (5 settimane), ha protetto in modo significativo (P <0,0001) i ratti esposti ad adenina dall’evoluzione verso una CKD grave. In linea con la ridotta funzionalità renale negli animali trattati con il veicolo, i livelli sierici di calcio e fosforo erano sbilanciati, con conseguente iperfosfatemia e ipocalcemia correlata alla CKD. Oltre ad arrestare il declino della funzionalità renale, la metformina ha portato alla normalizzazione dell'omeostasi minerale, estendendo così le sue promettenti implicazioni terapeutiche alle comorbidità correlate alla malattia renale cronica.14 Modello di ratto con insufficienza renale cronica. Trasferire il grado di disfunzione renale nel nostro studio sui ratti alla popolazione umana con insufficienza renale cronica indica che la metformina dovrebbe essere in grado di arrestare la progressione della insufficienza renale cronica dopo la sua diagnosi agli stadi da 2 a 3, evitando o almeno posticipando interventi drastici come la dialisi.

Figura 10|Effetto della metformina su Yap1 e sui suoi bersagli a valle del fattore di crescita del tessuto connettivo (Ctgf) e dell'induttore angiogenico ricco di cisteina 61 (Cyr61). Espressione Yap1 (a,b), espressione Ctgf (c,d) ed espressione Cyr61 (e,f) in ratti con malattia renale cronica trattati con metformina o veicolo a partire da 4 (a,c,e) o 5 settimane (b,d ,f) dopo l'induzione di malattia renale cronica. I dati sono presentati come media SEM.***P < 0.001 rispetto al veicolo. P < 0,05 rispetto alle settimane 4 e 5. #P < 0,05 rispetto agli animali di controllo con funzionalità renale normale.

Per quanto riguarda l’istologia renale, la metformina è stata in grado di arrestare la progressiva espansione dell’interstizio, indipendentemente dal fatto che la somministrazione sia iniziata precocemente (4 settimane) o successivamente (5 settimane) dopo l’induzione della CKD. Inoltre, l'infiammazione è generalmente riconosciuta come una componente essenziale della CKD.40 Nel nostro studio, a differenza degli animali trattati con il veicolo, nessuno degli animali trattati con metformina ha mostrato un aumento significativo dell'infiammazione interstiziale (infiltrazione leucocitaria) alla fine dello studio rispetto all'inizio del trattamento (settimana 4 o 5), indicando che l'effetto renoprotettivo della metformina, almeno in parte, consiste nella riduzione dell'infiltrazione di cellule infiammatorie nell'interstizio.40,41 Resta da determinare se ciò sia dovuto alla protezione delle cellule epiteliali tubulari dalle lesioni, attenuando quindi il rilascio di fattori proinfiammatori o per un effetto diretto sulle cellule infiammatorie.

La straordinaria efficacia terapeutica della metformina osservata in questo studio ci ha spinti a eseguire un’analisi proteomica imparziale per esplorare ulteriormente i complessi e i percorsi di segnalazione. Sebbene non sorprenda che l'introduzione della metformina in uno scenario patologico possa influenzare gli aspetti del metabolismo energetico (ad esempio, segnalazione dell'AMPK, metabolismo del piruvato), abbiamo anche cercato di indagare se questa attività terapeutica regolasse ulteriori complessi di segnalazione e vie di segnalazione. L'esposizione alla metformina nel modello di CKD è stata associata alla via di segnalazione Hippo, una cascata multiproteica di chinasi altamente conservata che controlla lo sviluppo dei tessuti, le dimensioni degli organi, la proliferazione cellulare e l'apoptosi.42 Al centro di questa rete si trovano il bersaglio della Hippo chinasi e l'effettore della via a valle. Proteina associata a Sì (Yap) e il suo paralogo Taz (dominio WW contenente il regolatore della trascrizione 1 o Wwtr1). Nella sua forma fosforilata, lo Yap citoplasmatico è sequestrato in uno stato inattivo. Quando la cascata Hippo è inattivata, Yap/Taz agisce come coattivatore trascrizionale nel nucleo e migliora la trascrizione di geni come Ctgf e Cyr61.43 L'effetto renoprotettivo della metformina sembra consistere nell'attivazione della via di segnalazione Hippo e quindi nell'inibizione dell'accumulo nucleare di Yap/Taz e quindi diminuendo l'espressione di Ctgf e l'espressione del gene Cyr61 (Figura 13). Questi risultati sono in linea con studi precedenti che indagavano sulla diafonia tra l’omeostasi energetica, che coinvolge l’AMPK, e la via Hippo. Infatti, Wang et al.44 hanno scoperto che l'AMPK attivo (met per min è generalmente noto come attivatore dell'AMPK) fosforila direttamente Yap e quindi sopprime l'attività trascrizionale di Yap. Inoltre, Mo et al.45 hanno descritto che l'attività di Yap è regolata negativamente dallo stress energetico cellulare. Hanno dimostrato che Yap è inibito direttamente dalla fosforilazione mediata da AMPK e indirettamente tramite l'attivazione delle grandi chinasi soppressori del tumore (Lats).45 Inoltre, la serina/treonina-proteina chinasi (Pak1) fosforila e inattiva la neurofibromina 2 (Nf2) dell'attivatore della ki nasi a monte /Merlin), che causa l'inattivazione di Lats1/2 e, di conseguenza, la traslocazione nucleare di Yap/Taz.46 Il trattamento con metformina ha sottoregolato Pak1, come menzionato nell'elenco DEP (Tabella supplementare S2), prevenendo l'inibizione della fosforilazione di Yap mediata da Lats . Inoltre, il trattamento con metformina ha sovraregolato la Ste20-chinasi 2 MST2 dei mammiferi (cioè il gene della serina/treonina chinasi 3 [Stk3] nell'elenco DEP), che causa una maggiore fosforilazione di Yap mediata da Lats. L'effetto della metformina sulla via Hippo è stato ulteriormente confermato dall'espressione dell'mRNA di Yap e su due importanti geni bersaglio della segnalazione Hippo/Yap (Ctgf e Cyr61) già alla settimana 8. Nel complesso, queste osservazioni hanno identificato la via Hippo come interessante per svelare la modalità di azione terapeutica della metformina.

Nel 2019, la Food and Drug Administration statunitense ha approvato l'uso di canagliflozin per rallentare la malattia renale correlata al diabete. Più recentemente, nel 2021, la Food and Drug Administration statunitense ha approvato l'inibitore SGLT2, dapagliflozin, per ridurre il rischio di progressione della malattia in pazienti con insufficienza renale cronica indipendentemente dallo stato di diabete.28,29 Per quanto riguarda il suo effetto sull'animale con insufficienza renale cronica modelli, Ali et al.47 hanno dimostrato che il trattamento preventivo con canagliflozin potrebbe attenuare lo sviluppo di grave insufficienza renale cronica indotta da adenina mediante la somministrazione concomitante della dieta adenina e del trattamento con canagliflozin (10 mg/kg e 25 mg/kg, sonda gastrica) per 35 giorni consecutivi. Il trattamento preventivo con agliflozin, a entrambe le dosi, ha migliorato la funzionalità renale, soppresso l'infiammazione e lo stress ossidativo e migliorato l'aspetto istologico.47 Inoltre, Yamato et al.48 hanno riportato un effetto renoprotettivo preventivo della somministrazione di ipragliflozin a basse dosi (0,03 o 0,1 mg/kg). nei topi con insufficienza renale cronica indotta da adenina: la somministrazione concomitante di adenina e ipragliflozin ha migliorato i livelli di creatinina plasmatica e i cambiamenti morfologici, rispetto alla sola somministrazione di adenina. Al contrario, Ma et al.49 hanno concluso che le azioni renoprotettive preventive dell'inibitore SGLT2, empagliflozin (10 mg/kg, per 14 giorni), non si applicavano ai topi con nefrocalcinosi non diabetica correlata all'ossalato. Inoltre, Zhang et al.50 hanno valutato l'effetto di dapagliflozin (0,5 mg/kg, due volte al giorno, 12 settimane) in 5/6 ratti nefrectomizzati, nei quali la progressione della malattia non era influenzata dall'inibizione del SGLT2. Queste discrepanze in tali studi preventivi ci hanno ispirato a confrontare l’efficacia terapeutica della metformina con quella di canagliflozin in un contesto non diabetico di insufficienza renale cronica accertata. Il trattamento con canagliflozin si è rivelato incapace di arrestare la progressiva perdita della funzionalità renale. Inoltre, dal punto di vista istologico, nessuno degli animali trattati con canagliflozin, rispetto agli animali con insufficienza renale cronica trattati con veicolo, ha mostrato una percentuale di area interstiziale ridotta, né

Figura 12|Effetto di canagliflozin sulla funzione renale, istopatologia ed espressione genica. Creatinina sierica (a), clearance della creatinina (b), percentuale di area interstiziale (c), sezioni renali colorate con acido periodico di Schiff (d), espressione di Col1a1 (e), espressione di Tnfa (f), espressione di Tgfb (g), Yap1 espressione (h), espressione del fattore di crescita del tessuto connettivo (Ctgf) (i), espressione dell'induttore angiogenico 61 ricco di cisteina (Cyr61) (j) di ratti con malattia renale cronica trattati con canagliflozin o con il veicolo a partire da 4 settimane dopo l'induzione della malattia renale cronica . I dati sono presentati come media SEM. Barre ¼ 100 mm. *P < 0,05 rispetto al veicolo; #P <0,05 rispetto agli animali di controllo con funzionalità renale normale. Per ottimizzare la visualizzazione di questa immagine, consultare la versione online di questo articolo su www.kidney-international.org.

Il lavoro attuale presenta anche alcune limitazioni. L'uso del modello della CKD indotta da adenina potrebbe essere messa in dubbio per la sua rilevanza perché si tratta di una nefropatia da cristalli con un composto infiammatorio pronunciato e un grave tasso di progressione. Tuttavia, è da notare che l’intero spettro delle caratteristiche funzionali e istopatologiche della CKD sono costantemente presenti in questo modello e risultano anche in comorbidità rilevanti per la CKD umana – disturbi minerali e ossei.14,51 Inoltre, il fatto che la metformina possa attenuare la CKD la progressione in questo modello grave conferma il suo potenziale come renoprotettore terapeutico. Un'altra limitazione di questo studio è la mortalità nei nostri gruppi trattati con metformina. È improbabile che questi decessi siano dovuti a eventi cardiovascolari perché abbiamo precedentemente dimostrato che la metformina previene l'insorgenza e la progressione della calcificazione vascolare in un modello grave di malattia renale cronica renale indotta da adenina 0.25% e di disturbo minerale e osseo attraverso le sue azioni renoprotettive .14 ​​Inoltre, l'uso di metformina in pazienti con malattie cardiache è associato a risultati migliori piuttosto che ad un aumento del rischio.10,52,53 In alternativa, non abbiamo potuto collegare in modo definitivo la mortalità all'aumento dei livelli di lattato perché gli animali morti non mostravano costantemente i livelli sierici più elevati concentrazioni di lattato. Tuttavia, l'acidosi lattica come possibile causa di morte non può essere completamente esclusa perché il giorno della morte non è stato effettuato il prelievo di sangue. È innegabile che il timore dell’acidosi lattica come complicanza della metformina nei pazienti con insufficienza renale cronica ha influenzato negativamente il suo utilizzo in questa popolazione. Sebbene, in retrospettiva, il controllo del dosaggio nel nostro studio avrebbe potuto essere più rigoroso, è chiaro che il pericolo di acidosi lattica è perfettamente gestibile ed evitabile, pur mantenendo i benefici terapeutici. Questa visione è supportata anche da dati umani.23,54

nella complessa rete di vie di segnalazione molecolare alla base degli effetti renoprotettivi della metformina è impegnativa, consente l’identificazione di potenzialmente nuovi bersagli terapeutici. Il coinvolgimento qui suggerito del percorso Hippo potrebbe essere un primo passo in tal senso.

DIVULGAZIONE

Tutti gli autori non hanno dichiarato interessi concorrenti. DICHIARAZIONE DEI DATI I dati della proteomica della spettrometria di massa sono stati depositati presso il Consorzio ProteomeXchange tramite il repository partner PRoteomics IDEntification Database (PRIDE) con gli identificatori del set di dati PXD022687 e 10.6019/PXD022687. RINGRAZIAMENTI La metformina è stata gentilmente fornita da Merck KGaA. Ringraziamo Geert Dams, Hilde Geryl, Ludwig Lamberts, Rita Marynissen e Simonne Dauwe per la loro eccellente assistenza tecnica. Desideriamo anche ringraziare il Dr. Youssef Bennis (Centre Hospitalier Universitaire Amiens Picardie) per aver determinato le concentrazioni sieriche di metformina. RC è finanziato dall'Università di Anversa: borsa di dottorato (DocPro). RC è finanziato da BOF-DOCPRO-34737.

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