La proporzione del concentrato nella dieta delle vacche da latte all'inizio della lattazione ha effetti contrastanti sui profili trascrittomici globali dei leucociti circolanti, sulla salute e sulla fertilità secondo la parità

Astratto:La funzionalità dei leucociti circolanti nelle vacche da latte viene soppressa dopo il parto, con un bilancio energetico negativo come fattore di rischio. I profili trascrittomici dei leucociti sono stati confrontati separatamente in 44 vacche Holstein-Friesian multipare (MP) e 18 primipare (PP) che ricevevano diete diverse nella proporzione dei concentrati per verificare se la disfunzione immunitaria potesse essere mitigata da un'alimentazione appropriata. Dopo il parto, alle vacche è stato offerto (1) basso concentrato (LC); (2) diete a concentrazione media (MC) o (3) diete ad alta concentrazione (HC) con proporzioni di concentrato e insilato di erba rispettivamente del 30%:70%, 50%:50% e 70%:30%. I dati raccolti sul fenotipo delle mucche includevano metaboliti circolanti, produzione di latte e dati sulla salute e sulla fertilità. È stato eseguito il sequenziamento dell'RNA dei leucociti circolanti a 14 giorni nel latte. La dieta HC ha migliorato il bilancio energetico in entrambi i gruppi di età. C'erano più geni espressi in modo differenziale nelle vacche PP che nelle vacche MP (460 contro 173, confronto HC contro LC) con poche sovrapposizioni. Le vacche MP alimentate con la dieta LC hanno mostrato una sovraregolazione della cascata del complemento e della coagulazione e meccanismi di difesa immunitaria innata contro gli agenti patogeni e hanno avuto un trend verso più casi di mastite e minore fertilità. Al contrario, le vacche PP alimentate con la dieta HC hanno mostrato risposte immunitarie maggiori basate sia sull’espressione genetica che sui dati fenotipici e un intervallo più lungo dal parto al concepimento. I leucociti delle mucche MP e PP hanno quindi risposto in modo diverso alle diete in base all’età, all’apporto di nutrienti e all’immunità, influenzando la loro salute e la successiva fertilità.

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Parole chiave:immunosoppressione postpartum; immunità innata; metabolismo; leucociti; diete per l'allattamento; trascrittoma; riproduzione; mucche

1. Introduzione

All’inizio del postpartum, le vacche da latte sono caratterizzate da immunosoppressione che colpisce l’immunità innata e adattativa, compresa sia l’immunità cellulo-mediata che quella umorale. I leucociti circolanti vengono reclutati in tessuti come la ghiandola mammaria e l'endometrio durante l'infiammazione. Studi precedenti, tuttavia, hanno mostrato una riduzione sia del numero dei leucociti che della loro capacità funzionale durante il periodo peripartum [1,2]. Gli effetti riportati includono una ridotta fagocitosi e un'attività ossidativa [3-5], una ridotta reattività delle cellule T circolanti agli agenti mitogeni e una ridotta produzione di immunoglobuline da parte delle cellule B [6,7]. Le cause sono multifattoriali ma sembrano legate alla ripartizione dei nutrienti a favore della produzione di latte all’inizio della lattazione, compromettendo la funzione immunitaria [8–10]. I leucociti richiedono un adeguato apporto di glucosio, vari acidi grassi e colesterolo o ossisteroli per il loro mantenimento e funzionalità [8,11,12]. L’apporto di nutrienti disponibile, tuttavia, viene dato priorità alla ghiandola mammaria dopo il parto, che richiede circa il 25% in più di energia metabolizzabile e proteine ​​rispetto a quella fornita dall’assunzione di mangime [8,13,14]. Inoltre, il parto è caratterizzato da processi infiammatori associati a cambiamenti nella secrezione di varie prostaglandine, steroidi e citochine e possibili lesioni durante il processo del parto stesso [15-17]. Le risposte infiammatorie al parto e i metaboliti rilasciati durante la mobilizzazione dei tessuti hanno potenti effetti anoressici, diminuendo ulteriormente l’assunzione ed esacerbando il bilancio energetico negativo (NEB) [18]. Quando l’assunzione di mangime non riesce a soddisfare la crescente domanda di energia, le vacche entrano in un periodo di NEB, in cui alcuni individui diventano metabolicamente squilibrati [19–21]. Il NEB è associato alla resistenza all'insulina, alla ridotta espressione del recettore dell'ormone della crescita epatico (GH) e alla minore sintesi epatica di IGF-1 [22,23]. Il disaccoppiamento del GH con l’insulina nelle mucche dopo il parto è un adattamento che dà priorità all’apporto di glucosio a tessuti come le cellule epiteliali mammarie, in cui l’assorbimento è indipendente dall’insulina [8]. In questa situazione, la competizione per l’approvvigionamento energetico tra la ghiandola mammaria e il sistema immunitario è inevitabile poiché entrambi fanno affidamento sugli stessi substrati essenziali ed entrambi sono grandi consumatori di energia. Kvidera et al. [24] hanno dimostrato che l’attivazione di una risposta immunitaria completa nelle mucche richiedeva da 2,5 a 3,1 kg di glucosio al giorno. Ciò è simile al fabbisogno stimato di 2,7 kg/giorno di glucosio assorbito dalle cellule epiteliali mammarie per una produzione di latte di 40 kg/giorno [8].

La mobilizzazione dei tessuti è anche associata ad un aumento delle concentrazioni circolanti di acidi grassi non esterificati (NEFA), beta-idrossibutirrato (BHB) e ad una diminuzione di IGF-1, che contribuiscono tutti alla disfunzione immunitaria [5,9,10,20 ]. Ad esempio, il nostro recente studio ha illustrato che l’adesione cellula-cellula dei leucociti veniva inibita quando la concentrazione di NEFA superava i 750 µM [25]. Sebbene la mobilizzazione dei tessuti sia un normale adattamento dei mammiferi per supportare la lattazione, molti studi hanno dimostrato che un NEB grave ha una grande influenza sulla successiva capacità della mucca di concepire in modo tempestivo [26]. Ciò può essere dovuto a una varietà di fattori, tra cui ritardi nel ripristino di un ambiente uterino appropriato [2]; un lungo periodo di anovulazione [27], un ambiente intrafollicolare inadeguato [28] e una compromissione della qualità degli ovociti [29]. Le manze da latte generalmente partoriscono a circa il 90% del loro peso corporeo maturo [30]. Il nostro studio precedente ha dimostrato che le mucche primipare (PP) avevano concentrazioni più elevate di insulina, IGF-1 e leptina in circolo, concentrazioni più basse di metaboliti nel sangue (BHB, NEFA e urea) e concentrazioni di glucosio più elevate rispetto alle mucche multipare (MP). ) vacche per almeno 7 settimane dopo il parto [31,32]. Ciò indica che vi è un minore disaccoppiamento dell’asse somatotrofico all’inizio della lattazione nelle vacche PP rispetto alle vacche MP, associato a una minore priorità dei nutrienti per la ghiandola mammaria, consentendo così una crescita continua. Anche i profili di espressione genica nei leucociti circolanti differiscono tra le vacche PP e MP durante la prima parte della lattazione [33].

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L’ottimizzazione della gestione nutrizionale durante il periodo di asciutta può aumentare l’assunzione di sostanza secca (DMI), ridurre l’incidenza delle malattie peripartum e migliorare la fertilità [34]. Esistono linee guida generali su come ridurre il rischio di malattie legate all’alimentazione e alla gestione [35]. Ci sono, tuttavia, poche informazioni disponibili sulle formulazioni dietetiche per la singola vacca in uno squilibrio metabolico durante il periodo postpartum che possa migliorare la funzione immunitaria, diminuire l’incidenza della malattia e migliorare le successive prestazioni riproduttive. Formulare diete con un elevato potenziale di apporto di nutrienti è un approccio pratico [36]. Nel presente studio, alle vacche all’inizio della lattazione sono state offerte diete a basso (LC), medio (MC) o alto contenuto (HC) in base alle proporzioni del concentrato rispetto all’insilato di erba e agli effetti sulla salute e malattia metabolica e sull’immunità sistemica ( valutando i profili globali di espressione genica dei leucociti circolanti). I dati delle vacche PP e MP sono stati analizzati separatamente per evitare qualsiasi effetto confondente derivante dalla parità. La nostra ipotesi era che le diete ad alta concentrazione avrebbero migliorato la funzione immunitaria e avrebbero favorito la fertilità.

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2. Risultati

2.1. Effetto delle diete sull'assunzione di sostanza secca, produzione di latte, bilancio energetico e metaboliti del sangue

I parametri del latte, il peso corporeo (BW), il DMI, il punteggio di condizione corporea (BCS), il bilancio energetico (EBAL) e i metaboliti nel sangue sia per le vacche MP che per quelle PP a circa 14 giorni nel latte (DIM) sono riepilogati nella Tabella 1. DMI per le vacche MP erano significativamente diverse tra i tre gruppi alimentari con l'ordine di HC > MC > LC (p < 0.01–0.0{{11 }}1). La produzione di latte nelle vacche MP che ricevevano le diete HC era significativamente più alta rispetto a quelle che ricevevano le diete LC (p < 0.05). La differenza nella produzione di latte corretta per l'energia (ECM) tra i gruppi LC e HC era significativa (p < 0.05), con valori intermedi nel gruppo MC. I valori EBAL in tutti e tre i gruppi MP erano negativi, ma quelli nelle vacche MC e HC erano significativamente migliori (meno negativi) rispetto alle vacche LC (p < 0,01). Le concentrazioni circolanti sia di glucosio (p < 0,01) che di IGF-1 (p < 0,001) nelle vacche HC erano significativamente più elevate rispetto alle vacche LC. Le vacche MP a cui erano state somministrate diete HC hanno anche prodotto meno urea circolante (p < 0,001), BHB (p < 0,05) e NEFA rispetto a quelle a cui erano state somministrate diete LC con concentrazioni LC > MC > HC, nonostante le differenze delle concentrazioni di NEFA tra i gruppi dietetici non erano statisticamente significativi.

Tabella 1. Assunzione totale di sostanza secca, parametri del latte, peso corporeo, bilancio energetico, punteggio di condizione corporea e metaboliti nel sangue a circa 14 giorni dopo il parto, analizzati in base alla parità e alla dieta 1,2

Nelle vacche PP, quelle che avevano ricevuto la dieta MC o HC avevano un DMI più elevato rispetto a quelle che avevano ricevuto la dieta LC (p < {{0}}.01). Le rese del latte non erano significativamente differenti. L’EBAL era positivo nelle vacche a cui era stata offerta la dieta MC o HC, mentre per quelle a cui era stata offerta la dieta LC era negativo. Le differenze nell’EBAL tra le vacche HC e LC PP erano significative (p < 0,05). Dei metaboliti misurati, solo le concentrazioni di urea differivano tra i gruppi, essendo inferiori nelle vacche HC (LC > MC > HC, p < 0,001 per LC rispetto a HC o MC).

2.2. Effetto delle diete sui parametri infiammatori

Gli effetti della dieta sui parametri infiammatori misurati nell'utero e nella ghiandola mammaria sono presentati nella Tabella 2. Nelle vacche PP, il rapporto tra leucociti polimorfonucleati e cellule epiteliali uterine (PMN: UEC) raccolti dall'utero utilizzando un citospazzola era significativamente più alto per le vacche con dieta HC rispetto a quelle con dieta LC (p < 0.05). Nelle vacche MP, la tendenza era nella stessa direzione, con LC < MC < HC, ma non raggiungeva la significatività statistica. Nel latte, le vacche MP alimentate con la dieta LC avevano un SCC significativamente più elevato rispetto a quelle alimentate con la dieta MC o HC (p < 0,05), mentre nelle vacche PP la tendenza non significativa era nella direzione opposta . Le concentrazioni di N-acetil- -d-glucosaminidasi (NAGase) e lattato deidrogenasi (LDH) nel latte, enzimi del latte indicativi di mastite, seguivano le stesse tendenze generali dei valori SCC ma nessuna differenza era significativa. Questi risultati sono stati supportati dalle cartelle cliniche. Le vacche MP alimentate con la dieta HC non hanno manifestato alcun caso di mastite (0/15), mentre a 4/14 (28,6%) delle vacche alimentate con la dieta LC è stata diagnosticata una mastite clinica entro 16 giorni dal parto. La tendenza era ancora una volta nella direzione opposta per le vacche PP con una su sei (16,7%) nella dieta LC con mastite clinica rispetto a un caso di mastite clinica e due subclinica nella dieta HC (50%).

Tabella 2. Parametri infiammatori a circa 14 giorni dal parto in base alla parità e alla dieta 1,2.

2.3. Dati sulla fertilità

I dettagli dei dati sulla fertilità sono forniti nella Tabella 3. Per le vacche MP, quelle che seguivano la dieta LC impiegavano leggermente più tempo per concepire e richiedevano più servizi per concepimento rispetto alle vacche HC (2,4 ± 0,42 contro 1,6 ± 0.23), anche se la maggior parte delle vacche HC non sono state servite (una decisione del management) o non sono riuscite a concepire affatto (6{{10}}.0% vs 71,4%). Nessuna di queste differenze era, tuttavia, significativa. Per le vacche PP, è vero il contrario, con le vacche LC che hanno avuto l'intervallo più breve dal concepimento di 29 giorni (p < {{20}}.05), con cinque dei sei animali che hanno concepito il loro primo servizio . Al contrario, metà del gruppo HC non è stato servito (n=2) o non è riuscito a concepire (n=1), con i tre che hanno concepito richiedendo 2,0 ± 0,41 servizi per concepimento. Ciò ha portato il gruppo HC ad avere un punteggio "in vitello by" (ICB) significativamente più alto (p < 0,05).

Tabella 3. Dati sulla fertilità in base alla parità e alla dieta 1,2

2.4. I profili trascrittomici dei leucociti nelle mucche offrivano diverse proporzioni di concentrato

Il genoma bovino di riferimento di ARS-UCD 1.2 fornito da RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly, accesso il 1° maggio 2022) contiene 35.158 geni, di cui 19.001 geni leucocitari erano quantificabili quando il sequenziamento indica nei file FASTQ sono stati mappati su di esso. I grafici del vulcano che mostrano i profili di espressione nelle vacche MP e PP che hanno ricevuto le tre diverse diete sono presentati nella Figura 1. Nelle vacche MP, c'erano 173 geni differenzialmente espressi (DEG) nel confronto tra HC e LC, 126 tra MC e LC e 68 per HC rispetto a MC (file supplementare S1A–C). Il diagramma di Venn ha illustrato che nessun gene (DEG comune) era significativo in tutti e tre i confronti dietetici (Figura 2A). Nelle vacche PP, c'erano 460 GRADI nel confronto tra HC e LC, 178 tra MC e LC e 128 tra HC e MC (file supplementare S2A–C). Solo un gene comune (DCN, fold change (FC)=−7,3) era significativo in tutti e tre i confronti dietetici (Figura 2B). Questo codifica per la decorina, una proteina che svolge un ruolo nell'assemblaggio delle fibrille di collagene. Nel complesso è stato evidente che nei confronti dietetici dell'espressione genica dei leucociti nelle vacche PP è stato riscontrato un numero maggiore di DEG rispetto alle vacche MP nonostante le dimensioni più piccole del gruppo, con la maggior parte di questi geni sovraregolati nella dieta HC. Inoltre, c'era poca sovrapposizione nei geni identificati tra i diversi gruppi di età, come illustrato nei diagrammi di Venn nella Figura 3. Ciò suggerisce che le diete avevano effetti diversi sul trascrittoma dei leucociti nelle vacche PP e MP. In entrambi i gruppi di età, le differenze maggiori sono state riscontrate tra le vacche a cui è stata offerta la dieta LC rispetto a quella HC, quindi ci siamo concentrati su questo confronto nelle analisi successive.

Figura 1. I grafici di Volcano mostrano i profili di espressione sia nelle vacche MP che in quelle PP che ricevono tre diete diverse. (A) Vacche MP HC rispetto a LC, (B) Vacche MP HC rispetto a MC, (C) Vacche MP MC rispetto a LC, (D) PP HC rispetto a LC, (E) PP HC rispetto a MC e (F ) PP MC rispetto a LC. HC: concentrazione elevata (n=6 nelle vacche PP e n=14 nelle vacche MP), MC: concentrazione media (n=5 nelle vacche PP e n=15 nelle vacche MP ) e LC: bassa concentrazione (n=6 nelle vacche PP e n=14 nelle vacche MP). Le modifiche alla piegatura sono state trasformate in log2-. I punti verdi indicano i geni sottoregolati con p (BH) < 0.05 e cambiamenti di piega inferiori o uguali a −1,5 e i punti rossi indicano i geni sovraregolati con p (BH) < {{ 16}}.05 e cambi di piega Maggiori o uguali a 1,5. I punti arancioni indicano i geni con p (BH) <0,05 ma variazioni di piega assolute <1,5.

Figura 2. Diagrammi di Venn che mostrano i geni espressi in modo differenziale dai leucociti circolanti tra i tre gruppi alimentari in (A) mucche multipare (MP) e (B) primipare (PP). HC: concentrazione elevata (n=6 nelle vacche PP e n=14 nelle vacche MP), MC: concentrazione media (n=5 nelle vacche PP e n=15 nelle vacche MP ) e LC: bassa concentrazione (n=6 nelle vacche PP e n=14 nelle vacche MP).

Figura 3. Diagrammi di Venn che mostrano i geni espressi in modo differenziale dai leucociti circolanti tra le vacche PP e MP nei confronti di (A) alta concentrazione (HC) con bassa concentrazione (LC); (B) HC con concentrato medio (MC) e (C) MC con LC. HC: n=6 nelle vacche PP e n=14 nelle vacche MP, MC: n=5 nelle vacche PP e n=15 nelle vacche MP e LC: n {{5 }} nelle vacche PP e n=14 nelle vacche MP

2.5. Confronto dei profili di espressione genica dei leucociti tra vacche multipare che ricevono diete ad alto o basso contenuto di concentrati

I primi 20 DEG sovraregolati e sottoregolati classificati in base ai valori p (BH aggiustati) nelle vacche MP alimentate con una dieta HC rispetto a quelle alimentate con una dieta LC sono forniti nel file supplementare S1D, E. Tra i DEG sovraregolati, la maggior parte era coinvolta nel GO funzioni del processo del sistema immunitario, del metabolismo e della risposta allo stimolo, con molte proteine ​​codificanti che hanno molteplici ruoli. Ad esempio, ALAS2 (che codifica per l'50 -aminolevulinato sintasi 2) ha un ruolo nel processo metabolico, nella risposta allo stimolo e nel processo di sviluppo. COL1A1 (catena alfa 1 del collagene di tipo I) e DAB2 sono coinvolti nel metabolismo, nella risposta allo stimolo, nell'organismo multicellulare, nella locomozione e nello sviluppo. I primi 20 geni sottoregolati illustrano un chiaro tema di cambiamenti nell’immunità con 14 DEG associati. Di questi, DMTB1, FGA, FGB e TF codificano peptidi antimicrobici, ALB e TF codificano proteine ​​di fase acuta negativa (APP) e FGA e FGG codificano APP positive. Otto geni svolgono un ruolo nel metabolismo e 10 sono coinvolti nella risposta allo stimolo.

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I DEG leucocitari derivati ​​dal confronto del gruppo HC con il gruppo LC sono stati successivamente sottoposti ad analisi di arricchimento GO. I 76 DEG sovraregolati sono stati significativamente arricchiti con 208 funzioni, di cui le prime 20 basate sui punteggi di arricchimento sono mostrate nella Figura 4A. Questi erano associati a vari aspetti della funzione cellulare, con in più il legame con il fattore di crescita derivato dalle piastrine. Molte funzioni erano correlate al metabolismo delle proteine ​​e degli aminoacidi (coinvolgendo APLP1, COL1A1, COL1A2, COL3A1, HTR1B e P2RY12 nella maggior parte di essi), alla biomineralizzazione e all'elaborazione del collagene (coinvolgendo COL1A1, COL1A2, SPP1 e TUFT1) e alla comunicazione cellulare. Al contrario, le funzioni superiori dei 97 DEG sottoregolati avevano un chiaro tema di vari processi di difesa immunitaria (Figura 4B) che erano prevalentemente associati a 20 DEG. Di questi, FGA (un'APP positiva) è stato sottoregolato di 85-volte nel confronto HC vs. LC. Uno strumento del browser GO ha riassunto le funzioni biologiche dei DEG sia up che down-regolati in otto categorie significative (Tabella 4). Ad eccezione della biomineralizzazione, tutte le altre funzioni biologiche, in particolare quelle associate alla difesa immunitaria, erano prevalentemente associate ai DEG sottoregolati.

Figura 4. Le 20 principali funzioni GO associate ai DEG derivate dai confronti HC e LC. (A) DEG sovraregolati MP, (B) DEG downregolati MP, (C) DEG sovraregolati PP e (D) DEG downregolati PP.

Tabella 4. Riepilogo delle principali funzioni dell'arricchimento GO dei DEG leucocitari nel confronto tra le vacche multipare che ricevono diete ad alto (n=14) e basso (n=14) concentrato all'inizio della lattazione.

Tabella 4. Continua

I DEG combinati su e giù (n=173) erano significativamente arricchiti con 23 percorsi KEGG che erano principalmente correlati a vari processi immunitari e metabolici (Tabella 5). Le cascate del complemento e della coagulazione erano in cima con otto DEG sottoregolati (CFB, FGA, FGB, FGG, KNG1, PROC, SERPINA1 e VTN). Il percorso infiammatorio della segnalazione simile a NOD era associato a sei DEG (IFNB1, MAPK10, OAS1X, OAS1Y, OAS1Z e OAS2), di cui tutti tranne MAPK10 erano sottoregolati. Il percorso di digestione e assorbimento delle proteine ​​conteneva sei DEG, di cui tre (COL1A1, COL1A2 e COL3A1) erano sovraregolati e tre sottoregolati (CELA2A, COL5A3 ed ELN). Cinque DEG downregolati erano coinvolti nella via di segnalazione dei recettori attivati ​​dal proliferatore del perossisoma (PPAR) (APOA2, APOC3, FABP1, HMGCS2 e PCK1). Le vie di interazione matrice extracellulare-recettore, l’adesione focale e la segnalazione degli sfingolipidi sono tutte coinvolte nel mantenimento della struttura cellulare e tissutale.

Tabella 5. Percorsi significativi identificati dall'arricchimento del percorso KEGG associati ai geni dei leucociti espressi in modo differenziale nelle vacche multipare a cui è stata offerta la dieta ad alto contenuto di concentrazione (n=14) rispetto a quelle a cui è stata offerta la dieta a basso contenuto di concentrazione (n=14).

2.6. Confronto dei modelli di espressione genica dei leucociti tra vacche primipare che ricevono diete ad alto o basso contenuto di concentrati

I primi 20 DEG leucocitari circolanti nelle vacche PP alimentate con HC rispetto alle diete LC sono elencati nel file supplementare S2D, E. Immune, e i processi metabolici predominavano nelle funzioni biologiche dei DEG sovraregolati più alti, contenenti rispettivamente 11 e 12 DEG. Tra questi, ACSL6, MMP9 e SLC11A1 sono coinvolti nella proliferazione dei leucociti e ACSL6, ADGRG3, COL1A2, DUSP1, HCK, MMP9 e PADI4 nel processo di sviluppo. SLC40A1 è un importante trasportatore di ferro che svolge un ruolo chiave nel bilanciamento dei livelli di ferro cellulari e sistemici. Alcuni di questi DEG codificano proteine ​​con molteplici funzioni. Ad esempio, MMP9, DUSP1, SLC11A1 e COL1A2 sono associati alla maggior parte delle funzioni GO sopra menzionate. Le funzioni biologiche dei DEG regolati dall'alto verso il basso erano più diversificate. C'erano otto DEG coinvolti nel processo del sistema immunitario, cinque che svolgono ruoli nel metabolismo e due associati sia alla proliferazione dei leucociti che al processo di sviluppo (EPCAM e FCRL3). Ancora una volta, alcuni DEG, ad esempio CD96 e FCRL3, codificano proteine ​​con ruoli multipli.

Nelle vacche PP, 382 DEG sovraregolati derivati ​​dal confronto HC rispetto a LC erano significativamente associati a 690 funzioni GO, con le prime 20 presentate nella Figura 4C. Tutti questi hanno coinvolto 116 DEG (Supplementary File S2F) con varie attività immunitarie. La funzione principale era la via di segnalazione del recettore della superficie cellulare. Questo era associato a 43 DEG che includevano geni che codificano molti recettori per ligandi immunitari, come CXCR1, CXCR2, IL17RD e IL1RAP. Questa funzione aveva sei sotto-funzioni significative, tra cui la via di segnalazione mediata dal lipopolisaccaride (LPS) (PTAFR, TLR4 e SCARB1) e la via di segnalazione del recettore della superficie cellulare regolata dalla risposta immunitaria. La sottofunzione principale nella regolazione del processo degli organismi multicellulari era la regolazione della produzione di citochine, con 24 DEG sovraregolati, come MARK13, LTF e TLR4. C'erano meno DEG sottoregolati (solo 78) associati a 298 funzioni GO significative, con punteggi di arricchimento inferiori e processi biologici più diversificati. La Figura 4D mostra le 20 funzioni principali. Alcuni di questi erano associati ad aspetti dell'immunità, come l'adesione cellulare, la regolazione della produzione di mediatori della risposta immunitaria, la risposta all'LPS e la risposta a molecole di origine batterica. Altri erano legati al mantenimento dell’omeostasi, come la superficie cellulare, la citolisi, il trasporto transmembrana e l’endopeptidasi di tipo serina. Il riepilogo delle funzioni biologiche significative associate ai DEG sia up che down ha generato sette categorie (Tabella 6), con il processo del sistema immunitario in cima e la maggior parte delle altre funzioni associate anche alla difesa immunitaria. Ad esempio, la locomozione è stata arricchita dai DEG con proprietà chemiotattiche e immunitarie e con l'interazione interspecie tra organismi, che comporta l'uccisione di agenti patogeni invasi. Sia il processo cellulare che la regolazione biologica erano associati a un gran numero di DEG. Il processo cellulare (n=239 DEG) includeva molte sottofunzioni associate all'adesione cellulare, all'uccisione cellulare, all'attivazione delle cellule immunitarie e alla proliferazione della popolazione cellulare. La regolazione biologica (125°) coinvolge anche molte attività immunitarie, come la regolazione dei processi del sistema immunitario, della locomozione e della risposta agli stimoli. Tutte queste funzioni contenevano DEG prevalentemente sovraregolati nella dieta HC.

Tabella 6. Riepilogo delle principali funzioni di arricchimento GO dei DEG nel confronto tra le vacche primipare a cui sono state offerte diete ad alto (n=6) e basso (n=6) concentrato all'inizio della lattazione.

Tabella 6. Continua

I DEG combinati su e giù (460) nelle vacche PP sono stati arricchiti con 35 percorsi KEGG significativi (Tabella 7). Molti erano associati a processi metabolici che coinvolgono aminoacidi (valina, leucina, isoleucina, arginina e glutatione), proteine, lipidi (acido arachidonico, glicerolipide e colesterolo), vitamina B6 e alcuni ormoni (aldosterone, cortisolo, tiroide e ormone della crescita). ). Queste vie metaboliche erano prevalentemente arricchite con i DEG sovraregolati nella dieta HC. Ad esempio, la biosintesi degli aminoacidi è stata associata a cinque DEG sovraregolati (ARG2, ASS1, GPT2, SDS e SDSL), il percorso di sintesi, secrezione e azione dell'ormone della crescita è stato arricchito con sei sovraregolati (ADCY6, CREB3L2, CREB5, FOS , MAPK13 e SOCS3) e un DEG sottoregolato (BCAR1) e il metabolismo dell'acido arachidonico conteneva cinque DEG sovraregolati (CYP2J2, GGT5, GPX3, PLB1 e TBXAS1). Anche diversi percorsi associati al processo immunitario/infiammatorio sono stati significativamente arricchiti, ancora una volta principalmente con DEG sovraregolati. Questi includevano le vie di segnalazione delle chemochine, delle MAPK e del TNF e le cascate del complemento e della coagulazione. Ad esempio, la via di segnalazione delle chemochine conteneva otto DEG sovraregolati (ADCY6, CCL16, CCR1, CXCL13, CXCR1, CXCR2, GNG7 e HCK) e due DEG downregolati (BCAR1 e CCR5), la via di segnalazione del TNF conteneva sei DEG sovraregolati (CREB3L2, CREB5 , FOS, MAPK13, MMP9 e SOCS3) e le vie di segnalazione MAPK contenevano 12 DEG sovraregolati, inclusi IL1A, MAP3K6 e MAPK13.

Tabella 7. Percorsi significativi identificati dall'arricchimento del percorso Kegg associati ai geni dei leucociti espressi in modo differenziale nelle vacche primipare a cui è stata offerta la dieta ad alto contenuto di concentrazione (n=6) rispetto a quelle a cui è stata offerta la dieta a basso contenuto di concentrazione (n=6).

3. Discussione

Le vacche da latte dopo il parto dispongono di meccanismi omeostatici per controllare la ripartizione dei nutrienti tra la lattazione e altre importanti funzioni vitali, come l’immunità e la crescita [8]. La mobilizzazione dei tessuti è un normale adattamento dei mammiferi per supportare la lattazione, ma alcune mucche presentano uno squilibrio metabolico [35,37]. Tali animali sperimentano un’eccessiva mobilizzazione del tessuto adiposo, resistenza all’insulina e infiammazione sistemica che contribuiscono alla compromissione dell’immunità spesso osservata in questo momento [38]. Questo è associato a mediatori dell’infiammazione come TNF e IL6 [39,40]. Il 14° giorno dopo il parto, quando sono stati raccolti i campioni di leucociti circolanti in questo studio, le cellule erano state quindi esposte ad un periodo di stimolazione infiammatoria. Abbiamo dimostrato, utilizzando il sequenziamento di nuova generazione e l’analisi bioinformatica, che le diete con diverse proporzioni di concentrato hanno prodotto effetti diversi sul trascrittoma dei leucociti circolanti nelle vacche PP e MP all’inizio della lattazione. Ciò era associato a differenze nella loro salute e fertilità. Queste informazioni hanno aggiunto nuove scoperte al nostro precedente rapporto sugli effetti della dieta sulla produzione di latte e sull’immunità [32].

3.1. Confronto degli effetti delle diete ad alto e basso contenuto nelle vacche multipare

Le vacche MP alimentate con diete HC avevano un DMI più elevato rispetto alle vacche MC e LC e questo era associato a concentrazioni circolanti più elevate sia di glucosio che di IGF{{0}}. Ciò ha portato le vacche HC ad avere una NEB meno grave e a produrre più latte. La dieta HC è stata formulata per soddisfare i fabbisogni energetici e proteici sia per la lattazione che per il mantenimento dell’omeostasi corporea e le misurazioni dei metaboliti hanno confermato che il loro stato metabolico era effettivamente migliore rispetto a quello delle vacche LC, con una minore necessità di mobilitazione dei tessuti per soddisfare le richieste energetiche. Ciò dovrebbe aiutare ad accelerare la risoluzione dei processi infiammatori postpartum, poiché molte malattie infiammatorie all’inizio della lattazione sono associate o causate da disordini metabolici [38] e abbiamo dimostrato in precedenza che l’infiammazione uterina si risolve più rapidamente nelle vacche con un migliore stato di bilancio energetico [2]. Nel presente studio, non è stata riscontrata alcuna differenza nel rapporto tra PMN e cellule epiteliali nel lume uterino in base alla dieta delle vacche MP. Questo indice è spesso considerato un indicatore di endometrite citologica [41]. Tuttavia, sono state osservate differenze a seconda della dieta nella ghiandola mammaria poiché le vacche LC avevano un SCC più elevato e questo era associato a una percentuale maggiore di loro che presentavano mastite clinica durante i primi 16 DIM (28,6% contro 0% nelle vacche LC vs gruppi HC).

La maggior parte dei DEG identificati nell'analisi del trascrittoma dei leucociti erano coinvolti nei processi immunitari e/o metabolici, come previsto in una popolazione di cellule immunitarie. Il percorso KEGG più significativo era la cascata del complemento e della coagulazione, che comprendeva sei dei geni maggiormente sottoregolati nelle vacche HC. Di questi, CFB codifica il fattore B del complemento, un componente della via alternativa di attivazione del complemento. FGA, FGB e FGG codificano tre subunità del fattore della coagulazione fibrinogeno, un componente chiave del coagulo sanguigno che è importante anche nel legare i batteri alle piastrine [42]. La forma ad alto peso molecolare del chininogeno, codificata da KNG1, è anche essenziale per la coagulazione del sangue e il chininogeno rilascia bradichinina, un peptide con varie funzioni tra cui attività antibatterica e antifungina. La vitronectina, codificata da VTN, è coinvolta anche nella regolazione del percorso della coagulazione e nella guarigione delle ferite, mentre il suo dominio legante l'eparina fornisce proprietà antimicrobiche. PROC codifica per una glicoproteina plasmatica la cui forma attivata contiene un dominio di serina proteasi che funziona nella degradazione delle forme attivate dei fattori di coagulazione V e VIII, mentre SERPINA1 codifica per un inibitore della serina proteasi i cui bersagli includono plasmina, trombina e attivatore del plasminogeno. La sovraregolazione del complemento e della cascata della coagulazione è stata precedentemente dimostrata nel tessuto mammario come risposta precoce dell'ospite all'E. coli o allo stafilococco. aureus [43]. Poiché questo percorso era maggiormente espresso nelle vacche alimentate con la dieta LC, ciò supporta l’evidenza di una maggiore incidenza di mastite in questi animali.

Cistanche tubulosa: migliora il sistema immunitario

Un'altra funzione principale riassunta dal browser GO era il processo di uccisione degli agenti patogeni (interazione interspecie tra organismi), che era associato a 14 DEG sottoregolati nelle vacche HC (Tabella 4). Ciò includeva una serie di geni coinvolti nell’attività antivirale (IFI6, IFNB1, ISG15, MX2, OAS1Y, OAS1Z, OAS2 e RSAD2) espressi a livelli più bassi. Di questi, IFNB1 codifica per l'interferone beta 1 mentre gli altri sono tutti geni stimolati dall'interferone [44,45]. Fanno tutti anche parte della via di segnalazione del recettore simile al NOD (NLR). Gli NLR sono recettori citosolici di riconoscimento di pattern che vengono attivati ​​da vari componenti non-self tra cui il peptidoglicano batterico, potenzialmente avviando l'espressione NF-kappa B-/AP-1-dipendente di citochine proinfiammatorie, l'espressione di interferoni di tipo I, l'autofagia e infiammazione [46]. Il nostro recente studio ha dimostrato che questo percorso era sovraregolato nei leucociti di mucche infette da E. coli [47]. Un altro gene identificato era l'MPO, che codifica per la mieloperossidasi, un enzima immagazzinato nei granuli azzurrofili dei PMN e dei macrofagi. Viene rilasciato nel liquido extracellulare durante i processi infiammatori ed è stato utilizzato come indicatore di infiammazione e stress ossidativo [48]. IL1R2 codifica per un membro della famiglia dei recettori dell'interleuchina 1 ed è stato uno dei DEG più significativamente sottoregolati identificati nelle vacche MP. Questo può legare IL1A, IL1B e il recettore dell'interleuchina 1, di tipo I (IL1R1/IL1RA), ma agisce come un recettore esca per inibire l'attività del ligando.

Il gene con l’espressione differenziale più significativa tra le vacche MP alle diverse diete era FCER1A, con un’espressione inferiore nelle vacche HC. Questo codifica per una subunità del recettore IgE, che è l’iniziatore delle risposte allergiche che potrebbero essersi evolute per promuovere la difesa dell’ospite contro i parassiti attraverso il rilascio di mediatori come l’istamina [49]. È interessante notare che FCER1A era uno dei soli 18 geni il cui livello di espressione è stato identificato come discriminante tra la fertilità delle manze da carne [50]. Il suo ruolo preciso nei bovini rimane indeterminato, ma in uno studio vaccinale su vitelli infettati sperimentalmente con il nematode parassita economicamente importante Ostertagia ostertagi, i suoi livelli di espressione nel sangue erano correlati positivamente con la conta dei mastociti e negativamente con il numero di vermi [51]. Altri tre geni sovraregolati nelle vacche HC con qualche funzione immunitaria erano ALAS2, GZMB e LIF. ALAS2 codifica l'50 -aminolevulinato sintasi 2, un enzima eritroide-specifico localizzato mitocondrialmente che catalizza il primo e limitante passaggio nella via biosintetica dell'eme. L’eme è un cofattore essenziale in una varietà di processi chiave compreso il trasporto dell’ossigeno, mentre le mutazioni in questo gene sono state collegate a una varietà di malattie umane inclusa l’anemia [52]. GZMB codifica per una preproproteina che viene secreta dalle cellule killer naturali e dai linfociti T citotossici e viene elaborata per generare una proteasi attiva che induce l'apoptosi delle cellule bersaglio e processa anche le citochine e degrada le proteine ​​della matrice extracellulare [53]. Il fattore inibitorio della citochina leucemia, codificato da LIF, è stato inizialmente identificato attraverso il coinvolgimento nella differenziazione dei macrofagi, ma è stato anche dimostrato che svolge un ruolo importante nello sviluppo dell'embrione e nell'instaurazione della gravidanza in una varietà di specie, compresi i bovini [54].

I DEG derivati ​​dal confronto HC vs. LC nelle vacche MP erano inoltre arricchiti con diversi percorsi significativi associati al metabolismo del glucosio, delle proteine ​​e degli acidi grassi. Questi includevano quattro DEG sottoregolati coinvolti nelle vie di segnalazione PPAR (APOA2, APOC3, FABP1 e PCK1). In questo studio sono state rilevate tre principali isoforme PPAR (A, D, G) nella popolazione leucocitaria. Sebbene l’espressione dei PPAR stessi non sia influenzata dalla dieta, questa via può influenzare l’espressione dei geni coinvolti nel metabolismo del glucosio e dei lipidi, nella differenziazione degli adipociti e nelle risposte infiammatorie [55,56] e contribuisce all’adattamento metabolico a un apporto limitato di nutrienti da parte di geni induttori coinvolti nella -ossidazione [57]. Anche la via metabolica del retinolo era sottoregolata nelle vacche HC, con una minore espressione di RBP4 e TTR (che codificano rispettivamente per la proteina legante il retinolo e la transtiretina), che agiscono entrambi come trasportatori del retinolo nel sangue. L’interazione del retinolo con la via di segnalazione PPAR influenza la trascrizione di molti altri geni a valle [58]. Anche APOA2 e APOC3 insieme ad APOH fanno parte della via metabolica del colesterolo. Il colesterolo è un componente importante della membrana plasmatica e ne influenza sia l'organizzazione che la funzione [59,60]. Studi recenti hanno sottolineato un ruolo emergente del colesterolo come importante modulatore dell’attività immunitaria innata e adattativa [61].

Il percorso della glicolisi/gluconeogenesi era associato a tre DEG sottoregolati nelle vacche alimentate con HC (ADH1C, ALDOB e PCK1). Di questi, PCK1 codifica la fosfoenolpiruvato carbossichinasi 1 che funge da principale punto di controllo per la regolazione della gluconeogenesi. Questo enzima, insieme al GTP, catalizza la formazione di fosfoenolpiruvato a partire dall'ossalacetato, con rilascio di anidride carbonica e GDP. L’attivazione delle vie immunitarie/infiammatorie promuove la trascrizione dei geni gluconeogenici tramite il recettore toll-like 4 (TLR4) [62]. Ciò può far sì che le cellule immunitarie cambino il loro metabolismo del glucosio dalla fosforilazione ossidativa alla glicolisi per produrre sia l’energia che i nutrienti necessari per la proliferazione e la produzione di molecole immunitarie [12,63]. Ciò porta ad un aumento della domanda di glucosio che compete con il fabbisogno di produzione di lattato [64].

In sintesi, le differenze di espressione genetica tra le vacche MP alle diete HC e LC forniscono la prova di una maggiore attività immunitaria sovraregolata e di un’infiammazione nelle vacche LC. Ciò è stato accompagnato da una maggiore incidenza di mastite. Al contrario, i geni che codificano per alcune proteine ​​che potrebbero apportare benefici alla salute e alla fertilità, come ALAS2 e LIF, erano sovraregolati nelle vacche HC. Ciò supporta gli indici metabolici misurati che mostrano un miglioramento dello stato EBAL nelle vacche MP alimentate con diete HC, il che probabilmente ha contribuito a proteggerle dallo sviluppo di malattie infettive o metaboliche.

3.2. Confronto degli effetti delle diete ad alto e basso contenuto nelle mucche primipare

Analogamente alle vacche MP, anche le vacche PP alimentate con la dieta HC avevano un DMI più elevato, di circa 4 kg/giorno, ma la produzione di latte non aumentava in modo significativo. Non sono state riscontrate differenze significative nelle concentrazioni circolanti di glucosio, NEFA, BHB o IGF-1, con solo l'urea che risultava più elevata nella dieta LC. Al contrario, ci sono state differenze più significative nell’espressione genica dei leucociti tra i gruppi dietetici rispetto alle vacche MP, con 460 contro 173 DEG identificati nei confronti HC contro LC, di cui l’83% era sovraregolato nelle vacche PP con dieta HC. Solo una piccola percentuale dei DEG si sovrapponeva tra i due gruppi di età (Figura 3), suggerendo che i cambiamenti nella funzione dei leucociti dovuti alla dieta di prima lattazione erano più sensibili nelle vacche PP che in quelle MP. Ci aspettavamo che la dieta HC avrebbe apportato benefici alle vacche PP aumentando il loro DMI e soddisfacendo pienamente i fabbisogni di proteine ​​alimentari non degradabili e metabolizzabili calcolati. L’EBAL è stato effettivamente migliorato con la dieta HC, ma l’analisi dell’espressione genica ha mostrato una sovraregolazione molto maggiore dei geni coinvolti nella difesa immunitaria. Le vacche alimentate con HC avevano anche un rapporto più elevato di PMN: UEC nell’utero insieme a un SCC numericamente maggiore e a più casi di mastite. Ciò suggerisce che in realtà erano più, e non meno, inclini alle malattie. Abbiamo precedentemente scoperto che i neutrofili raccolti dalle mucche PP in questo studio nelle prime tre settimane di lattazione avevano un indice fagocitico e un indice di burst ossidativo significativamente più alti rispetto alle mucche MP, ma gli effetti 2-della dieta e della parità sulla queste misurazioni non sono state riportate [32].

I processi del sistema immunitario identificati nel confronto HC vs. LC includevano la sovraregolazione dei recettori della superficie cellulare e le vie di segnalazione del riconoscimento dei pattern, la chemiotassi, la produzione di citochine e la migrazione dei leucociti nelle mucche alimentate con HC. I DEG identificati erano associati a una varietà di meccanismi di difesa immunitaria, tra cui una varietà di peptidi antimicrobici (AMP) (CATHL6, CXCL13, DEFB1, LTF, PGLYRP1, PGLYRP4, SA100A8, SA100A9, S100A1 e SLC11A1). Questi non solo possono uccidere direttamente gli organismi invasi, ma possono anche aiutare modulando altri processi immunitari e antimicrobici [65-67]. La sovraregolazione dei peptidi antimicrobici nei profili trascrittomici dei leucociti è stata precedentemente dimostrata in vacche con mastite clinica [47,68] e metrite/endometrite [69,70]. La funzione di adesione dei leucociti era associata a 16 DEG sovraregolati e cinque sottoregolati negli animali alimentati con HC. L’adesione dei leucociti alle pareti dei capillari è un primo passo fondamentale per consentire loro di trasmigrare dal sangue e di spostarsi verso siti di danno tissutale, infezione e infiammazione [71]. Sia le interazioni cellula-cellula che cellula-matrice influenzano il fenotipo dei leucociti e la disregolazione delle vie di adesione può portare all’attivazione persistente dei leucociti con infiammazione irrisolta [72]. Dei DEG sovraregolati identificati, ADAM8, ANGPTL3, CD24, ICAM3 e THY1 sono tutti coinvolti nello stravaso [73,74] mentre FN1, NRP1, TNFAIP6 e VCAN hanno ruoli potenziali nel traffico di cellule leucocitarie e funzionano nei tessuti infiammati [72, 75]. Anche i geni che codificano per i recettori delle chemochine CXCR1 e CXCR2 erano sovraregolati nelle mucche alimentate con HC; questi sono entrambi importanti per stimolare la chemiotassi dei PMN verso i siti di infezione e per attivare i processi biochimici che uccidono i batteri invasori [76].

Dei geni sottoregolati associati all’adesione nelle mucche alimentate con HC, BCAR1 codifica una proteina multifunzionale nota come cas con coinvolgimento nella motilità cellulare, nell’apoptosi e nel controllo del ciclo cellulare [77]. I polimorfismi in BCAR1 sono stati precedentemente associati alla resistenza al SCC e alla mastite [78]. ADGRG1 (noto anche come GPR56) codifica per un recettore accoppiato a proteine ​​G che lega il collagene 3 e la transglutaminasi 2, entrambi componenti dello stroma tissutale. È stato dimostrato che ADGRG1 svolge un ruolo nelle cellule umane natural killer (NK), in cui inibisce la loro citotossicità [79]. La sua stessa espressione viene sottoregolata in seguito all'attivazione indotta dalle citochine, il che sarebbe in accordo con i risultati mostrati qui. La proteina CD96 agisce anche come recettore del checkpoint inibitorio sulle cellule NK [80]. Precedenti studi sui cambiamenti nel trascrittoma dei leucociti durante il periodo di transizione hanno anche riscontrato cambiamenti nell'espressione genica relativa alla migrazione transendoteliale, sebbene con conclusioni divergenti, riportando rispettivamente l'attivazione dopo il parto [81] o l'inibizione [82]. La nostra analisi ha inoltre identificato una serie di differenze nelle vie di segnalazione dei segni del metabolismo degli aminoacidi nelle vacche PP con dieta HC rispetto a quelle con dieta LC, associate ad enzimi codificati da cinque DEG sovraregolati (ARG2, ASS1, GPT2, SDS e SDSL) . Di questi, ASS1 codifica l'arginina succinato sintasi 1, che catalizza il penultimo passaggio della via biosintetica dell'arginina, mentre ARG2 codifica l'arginasi, catalizzando l'idrolisi dell'arginina in ornitina e urea. La L-arginina può anche essere convertita in ossido nitrico, una molecola di segnalazione che svolge un ruolo chiave nella patogenesi dell’infiammazione [83]. La transaminasi glutammico-piruvica 2 (GPT2) è un enzima mitocondriale che catalizza la transaminazione reversibile tra alanina e 2-ossoglutarato per generare piruvato e glutammato. Questo gene è sovraregolato in condizioni di stress metabolico e svolge un ruolo nel guidare la gluconeogenesi dal metabolismo degli aminoacidi [84]. La serina deidratasi (SDS) codifica un enzima che converte la L-serina in piruvato e ammoniaca, mentre si prevede che la serina deidratasi (SDSL) sia coinvolta nella via della biosintesi dell'isoleucina dalla treonina.

Il percorso del metabolismo del colesterolo era associato a quattro DEG sovraregolati nella dieta HC (ANGPTL3, LRP1, SCARB1 e SORT1). Ciò potrebbe portare all’accumulo di colesterolo nei leucociti delle mucche alimentate con HC e promuovere l’infiammazione, compreso l’aumento della segnalazione TLR, l’attivazione dell’inflammasoma e una maggiore produzione di monociti e neutrofili nel midollo osseo e nella milza [85]. Il percorso del metabolismo dell'acido arachidonico con cinque DEG sovraregolati (come elencato in precedenza) porta alla produzione di cascate di prodotti pro- e antinfiammatori, come prostaglandine e leucotrieni [86]. La via del metabolismo dei glicerolipidi era associata a quattro DEG sovraregolati (DGAT2, DGKG, GK e GPAT3) che codificano per i geni lipogenici coinvolti nella sintesi del triacilglicerolo. Il suo accumulo può indurre l’attivazione e l’infiammazione dei leucociti [87,88]. Tutti questi risultati supportano la conclusione che la dieta HC ha sovraregolato le vie metaboliche dei leucociti nelle vacche PP in un modo che ha aumentato le loro risposte immunitarie/infiammatorie. Precedenti lavori sulle vacche si sono concentrati principalmente sul periodo in asciutta e hanno dimostrato che la sovralimentazione e un elevato BCS in questo periodo promuovono la successiva mobilizzazione dei lipidi e un’aumentata risposta infiammatoria durante il periodo peripartum [34]. Nel presente studio, il rapporto PMN:UEC uterino e la tendenza verso un SCC più elevato supportano l’ipotesi che vi fosse un aumento della migrazione dei leucociti verso l’utero e la ghiandola mammaria nelle vacche PP che ricevevano la dieta HC. Sebbene questa sia una componente essenziale della difesa immunitaria, l’iperattivazione può contribuire all’iperinfiammazione. Sono necessari ulteriori studi con un campione più ampio per confermare questi risultati.

3.3. Somiglianze nella risposta alla dieta delle mucche multipare e primipare

In terms of metabolic changes, both the MP and PP cows had higher circulating concentrations of urea when on the LC diet. Blood urea in both late pregnancy and early lactation may rise following mobilization of amino acids stored in skeletal muscle [89] or when dietary protein supply exceeds energy availability or protein needed [90], so these situations could have applied here. Elevated levels of urea have been associated with reduced fertility, but only at >4,5 mmol/L, superiore alle concentrazioni raggiunte negli animali alimentati con LC nel presente studio [91]. Per quanto riguarda i dati sulla trascrizione genica dei leucociti, è interessante notare che i DEG derivati ​​dal confronto HC vs. LC in entrambi i gruppi di età sono stati arricchiti con il percorso di digestione e assorbimento delle proteine, in cui i geni che codificano varie isoforme del collagene svolgono un ruolo importante . Tra questi, erano presenti tre geni del collagene sovraregolati (COL1A1, COL1A2 e COL3A1) sia nelle vacche MP che in quelle PP, e un gene del collagene sottoregolato (COL5A3) nelle vacche MP. I loro valori di espressione nei campioni erano piccoli, ma le differenze erano significative. Parte di questo RNA potrebbe provenire dai fibrociti, una popolazione cellulare che comprende solo il 0,1–0,5% delle cellule non eritrocitiche nel sangue periferico [92,93]. Il collagene è un potenziatore immunitario di lunga data coinvolto in molti processi immunitari/infiammatori [93,94]. La sua produzione sovraregolata nel sangue circolante mediante la dieta HC può quindi influenzare la funzione dei leucociti.

3.4. Implicazioni per la fertilità

Molti studi precedenti hanno riportato che lo stato metabolico e immunitario interconnesso e l'incidenza delle malattie delle vacche all'inizio della lattazione hanno un'influenza importante sulla loro successiva fertilità (ad esempio, [38,95]). Il nostro lavoro ha dimostrato che le vacche MP con una bassa concentrazione di IGF-1 a 14 DIM avevano meno probabilità di concepire [37]. Più recentemente, abbiamo riportato che il 63% delle vacche con IGF-1 basso in questo momento ha sperimentato più di un problema di salute durante i primi 35 DIM rispetto a solo il 26% delle vacche con IGF-1 alto. Ciò includeva più animali con infezioni uterine e mastite clinica [10]. Foley et al. [69] hanno differenziato tra vacche sane, che sono state in grado di ripristinare l'omeostasi entro 3 settimane dal parto, e altre che hanno sperimentato una risposta infiammatoria più grave e prolungata che ha poi sviluppato un'endometrite clinica. Un'associazione con il sangue periferico è stata dimostrata da Galvão et al. [96] che hanno dimostrato che i neutrofili delle mucche con EBAL peggiore avevano un contenuto di glicogeno inferiore a sette DIM e questi animali presentavano più malattie uterine, potenzialmente associate alla ridotta disponibilità di combustibili ossidativi per le risposte immunitarie. La mastite clinica all’inizio della lattazione è anche associata ad un aumento dei tassi di perdita di embrioni pre-impianto, con alcune indicazioni che un BCS basso aumenta ulteriormente il rischio [97]. Sono stati suggeriti numerosi meccanismi associati alla produzione di citochine e prostaglandine e ad altri mediatori dell'infiammazione che potrebbero influenzare l'ovaio e/o causare un ambiente uterino sfavorevole [98,99]. I dati sulla fertilità ottenuti dalle mucche nel nostro studio hanno supportato i risultati relativi al loro stato immunitario e alla salute nelle prime fasi della lattazione. Le vacche MP con dieta LC richiedevano numericamente più S/C in accordo con il loro EBAL più povero insieme all'evidenza derivante dall'analisi del trascrittoma dei leucociti di una difesa immunitaria più attiva in corso, come supportato dalla loro maggiore incidenza di mastite. Al contrario, le vacche PP alimentate con la dieta HC hanno impiegato molto più tempo per concepire e un numero inferiore di bovine sono rimaste gravide rispetto alle vacche alimentate con LC. Avevano più prove di infiammazione all'inizio della gravidanza anche se il loro EBAL calcolato era migliore. Al momento, i meccanismi sottostanti che causano il loro cattivo stato di salute e fertilità sono incerti, sebbene abbiamo anche trovato prove basate sull’espressione genetica globale di un aumento dell’infiammazione epatica e della fibrosi (Cheng, Little, Ferris, Takeda, Ingvartsen, Crowe e Wathes, osservazioni non pubblicate) .

3.5. Limitazioni dello studio

Erano disponibili meno vacche PP per gruppo e ciò riduceva la potenza statistica delle analisi relative ai fenotipi. Sono quindi necessari ulteriori studi con un campione più ampio per confermare gli effetti della dieta sulla riproduzione e sulla malattia. Nel presente studio, abbiamo estratto tutto l'RNA dal sangue periferico intero utilizzando provette Tempus e il suo sistema di isolamento. Ciò offre facilità di raccolta per uno studio agricolo su larga scala ma non separa i tipi di cellule, che includeranno linfociti T e B, cellule natural killer, piastrine, monociti, granulociti (neutrofili, eosinofili e basofili) e fibrociti. I dati sull'espressione genica presentati sono stati quindi influenzati dai possibili effetti del trattamento sulle proporzioni relative di particolari tipi di cellule oltre ai loro cambiamenti trascrizionali individuali. Questi risultati si basano anche sui livelli di trascrizione genetica e non includono informazioni sulla loro elaborazione post-traduzionale, che influenzerà anche la quantità di proteine ​​funzionali prodotte.

4. Materiali e metodi

4.1. Animali e diete

Tutte le procedure sono state eseguite ai sensi della legge sugli animali (procedure scientifiche) del 1986 e coperte dalla licenza di progetto dell'Home Office numero PPL2754 e da un certificato di designazione per l'istituzione. Il lavoro è stato approvato anche dal Comitato Etico e Benessere dell’Agri-Food and Biosciences Institute (AFBI, Belfast, Irlanda del Nord, Regno Unito). Sessantadue mucche da latte Holstein-Friesian sono state reclutate dalla mandria dell'AFBI. Tra questi, 18 erano PP (lattazione 1) e 44 MP con numeri di lattazione 2–7 (3,5 ± 1,28) e tutte le vacche erano sane come esaminato dal veterinario. Il peso al parto era 680 ± 62 (media ± STD) kg per le vacche MP e 550 ± 39 kg per le vacche PP. Dopo il parto, le vacche PP e MP sono state assegnate separatamente a tre gruppi dietetici, con l'assegnazione in ciascun gruppo di età bilanciata in base alla capacità di trasmissione prevista di grasso più proteine ​​(kg), peso corporeo pre-parto e BCS. Le vacche MP sono state bilanciate anche per la parità e la produzione di latte in 305-giorni di lattazione precedenti. Alle mucche è stato offerto (1) basso concentrato (LC, 30% concentrato più 70% insilato di erba, n=6 per PP e n=14 per MP); (2) concentrazione media (MC, 50% concentrato più 50% insilato di erba, n=6 per PP e n=15 per MP) o (3) concentrazione elevata (HC, 70% concentrato più 30% insilato di erba, diete n=6 per PP e n=15 per MP) (percentuali sulla base della sostanza secca). Il concentrato per ciascun trattamento è stato formulato per ottenere una concentrazione comune di proteina grezza (CP) totale della dieta per ciascuno di LC, MC e HC (rispettivamente 152, 152 e 154 g/kg DM), mentre l'energia metabolizzabile totale della dieta calcolata ( ME) erano 12,0, 12,4 e 12,8 MJ/kg DM. Si stima che le diete forniscano 1556, 1997 e 2420 g/giorno di proteine ​​efficaci degradabili nel rumine; 559, 733 e 888 g/giorno di proteine ​​alimentari non degradabili e 1.346, 1.817 e 2.275 g/giorno di proteine ​​metabolizzabili per LC, MC e HC, rispettivamente. L'accesso alle razioni di trattamento era controllato da un sistema di alimentazione Calan Broadbent (American Calan Inc., Northwood, NH, USA) collegato a un sistema di identificazione elettronica, che consentiva di registrare quotidianamente l'assunzione di singole vacche. Le diete per ciascun trattamento sono state offerte al 107% dell'assunzione dei giorni precedenti per garantire un consumo ad libitum. A tutte le mucche è stato inoltre offerto un ulteriore concentrato di 0,5 kg ad ogni mungitura tramite un sistema di alimentazione in sala per aiutare a mantenere un flusso efficiente delle mucche. Il presente studio faceva parte di un progetto più ampio e i dettagli completi delle diete offerte, della gestione dell’alimentazione e della composizione dei mangimi erano stati descritti in precedenza [32].

4.2. Raccolta dati sul fenotipo della mucca

I pesi corporei sono stati registrati due volte a settimana utilizzando bilance. Il BCS è stato stimato a circa 14 DIM [100]. Tutte le mucche venivano munte due volte al giorno e le loro rese giornaliere venivano registrate. I campioni di latte sono stati analizzati due volte alla settimana utilizzando l’analisi nel medio infrarosso per le concentrazioni di proteine, grassi e lattosio e sono state contate le cellule somatiche del latte. Ulteriori campioni di latte del mattino (2 × 8 mL) sono stati raccolti due volte a settimana e conservati a -18 ◦C per l'analisi di LDH (EC. 1.1.1.27) e NAGase (EC 3.2.1.30) utilizzando test fluorimetrici [101]. La produzione di latte corretta dal punto di vista energetico (ECM; kg/giorno) è stata calcolata seguendo i metodi utilizzati nel nostro gruppo [32]. L’EBAL di ciascuna mucca è stato stimato utilizzando il metodo descritto in precedenza [102].

La mastite clinica è stata diagnosticata utilizzando metodi standard basati sull'osservazione quotidiana di cambiamenti anomali nell'aspetto del latte (ad es., scaglie, coaguli), qualità, produzione di latte e risposte infiammatorie mammarie (arrossamento, gonfiore, calore o dolore). Le letture dell'SCC del latte insieme alle diagnosi cliniche sono state utilizzate per classificare le mucche in tre gruppi. Le vacche sane erano definite come aventi un SCC < 100,000 cellule/mL di latte e senza sintomi clinici. Le vacche mastitiche subcliniche erano definite come aventi un SCC compreso tra 100,000 e 400,000 cellule/mL di latte e nessun sintomo clinico apparente. Le mucche a cui era stata diagnosticata una mastite clinica avevano un SCC > 400,000 cellule/mL di latte e mostravano alcuni dei sintomi clinici sopra menzionati. Le mucche sono state inseminate al momento dell'estro osservato utilizzando la normale pratica della mandria e i dati sulla fertilità per la durata della lattazione successiva o fino al recupero dell'animale dai registri della mandria. I dati riportati includevano i giorni al primo servizio (DFS), i giorni al concepimento (giorni di apertura), i servizi per concepimento e la percentuale di vacche che hanno concepito. Inoltre, i dati del concepimento sono stati valutati utilizzando un punteggio 4-point in vitello secondo (ICB) come (1)<100 days, (2) 100–200 days, (3) >200 giorni, o (4) non sono riusciti a concepire o sono stati eliminati.

4.3. Analisi citologica uterina

Un campione di citospazzola uterina (Minitube, Minitüb GmbH, Tiefenbach, Germania) è stato prelevato da ogni mucca intorno a 14 DIM per valutare la citologia endometriale, come descritto in precedenza [103]. Un citospazzolino a doppia protezione è stato guidato manualmente attraverso la cervice nell'utero, la protezione interna è stata estrusa da quella esterna e lo spazzolino è stato ruotato delicatamente contro la parete endometriale. La spazzola veniva quindi ritirata nella protezione interna e rimossa. I vetrini per l'esame citologico sono stati preparati facendo rotolare il citospazzola su un vetrino da microscopio in vetro pulito e fissando il campione con il fissativo citologico Fisherbrand™ CytoPrep™ (Fishers Scientific, Blanchardstown, Irlanda). I vetrini fissati sono stati inviati alla UCD School of Veterinary Medicine, University College Dublin, Irlanda per l'elaborazione e colorati con la colorazione Giemsa modificata. La valutazione citologica è stata eseguita contando gli UEC dei PMN con un ingrandimento di 400× (Leitz Labourlux-S, Wetzlar, Germania) e determinando il loro rapporto, calcolando una media di 10 campi ad alto ingrandimento per vetrino.

4.4. Analisi dei metaboliti circolanti e dell'IGF-1

A 14 ± 2 (media ± STD) giorni dopo il parto, 10 ml di campioni di sangue sono stati raccolti dalla vena giugulare di tutte le mucche in provette con Na eparina per il plasma e provette semplici per il siero. Dopo la separazione del plasma o del siero mediante centrifugazione, sono stati conservati a -20 ◦C fino all'analisi. Le concentrazioni di glucosio plasmatico, urea, BHB, NEFA e colesterolo sono state misurate utilizzando i metodi descritti in precedenza [20,25]. In breve, la concentrazione sierica di NEFA è stata determinata con il metodo ACS-ACOD utilizzando i kit NEFA C (Wako, Neuss, Germania). Il glucosio plasmatico è stato quantificato con un metodo enzimatico (ADVIA 1800 Clinical Chemistry System, Siemens Healthcare Diagnostics, Ballerup, Danimarca). Il BHB sierico è stato determinato misurando l'assorbanza a 340 nm dovuta alla produzione di NADH a pH alcalino in presenza di BHB deidrogenasi. L'urea sierica è stata analizzata mediante spettrofotometria. I coefficienti di variazione (CV) intra e inter-test erano in tutti i casi inferiori al 3 e al 4%, rispettivamente, sia per i campioni di controllo bassi che per quelli alti. Le concentrazioni di IGF-1 nel siero sono state quantificate con test radioimmunologici dopo l'estrazione con etanolo acido [104]. Il CV intra-analisi è stato pari a 12,4, 7,5 e 9,9% rispettivamente per i campioni di controllo basso, medio e alto.

4.5. Estrazione dell'RNA dal sangue

I campioni di sangue per l'estrazione dell'RNA sono stati raccolti tramite venipuntura giugulare da tutte le mucche a 14 ± 2 DIM in provette per RNA del sangue Tempus (Thermo-Fisher Scientific, Loughborough, Regno Unito). Le provette sono state agitate vigorosamente per 15–20 secondi immediatamente dopo la raccolta, quindi congelate e conservate a -80 ◦C per l'estrazione dell'RNA. L'RNA del sangue intero è stato estratto utilizzando i kit di isolamento dell'RNA Tempus Spin (Thermo-Fisher) seguendo le istruzioni del produttore come descritto in precedenza [20]. Per valutare la quantità e l'integrità dell'RNA è stato utilizzato un Agilent BioAnalyzer 2000 (Agilent Technologies UK Ltd., Cheadle, Regno Unito) con il kit Agilent RNA 6000 Nano (Agilent Technologies UK Ltd., Cheadle, Regno Unito). Inoltre, la quantità e la purezza sono state convalidate con un NanoDrop 1000 (Thermo Fischer). I dati sulla qualità sono riepilogati nel file supplementare S3. Ciò ha dimostrato che tutti i campioni di RNA avevano un'integrità (numero RIN > 8,7, 9,3 ± 0,3) e una purezza ragionevoli (260/280 tra 2,01 e 2,15, media ± STD 2,10 ± 0,03), quindi nessun animale è stato rimosso dall'analisi. L'RNA è stato conservato a -80 ◦C per il successivo sequenziamento dell'RNA.

4.6. Sequenziamento, mappatura e quantificazione dell'RNA

L'RNA leucocitario estratto è stato sequenziato sulla piattaforma Illumina NextSeq 500 come descritto in precedenza [68]. In breve, utilizzando la workstation per la gestione dei liquidi epMotion (Eppendorf, Amburgo, Germania), 750 ng di RNA totale sono stati trascritti al contrario in librerie di sequenziamento di cDNA con il kit Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Ribo-Zero Gold (Illumina, San Diego, CA, USA ). Le librerie di cDNA in pool sono state sequenziate su un sequenziatore Illumina NextSeq 500 a letture single-end di 75 nucleotidi di lunghezza per raggiungere una media di 33,5 milioni di letture per campione. I file FASTQ grezzi sono stati depositati nell'Archivio europeo dei nucleotidi (E-MTAB-9347 e E-MTAB-9431). Tutte le analisi di sequenziamento sono state eseguite utilizzando CLC Genomic Workbench v21 (Qiagen, Manchester, Regno Unito). Ogni campione conteneva le letture da quattro corsie e venivano unite in un unico file fastq. La qualità dei file fastq sia grezzi che tagliati è stata valutata seguendo una pipeline Illumina 1.8 e tutte le letture non riuscite sono state rimosse. Le letture sono state quindi mappate su un gruppo genomico di Bos taurus di riferimento (ARS-UCD1.2 fornito da RefSeq su https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly, accessibile il 1° gennaio 2021) e quantificate come letture per gene, letture per milione di kilobase (RPKM) e trascrizioni per milione di kilobase (TPM). Questi sono stati archiviati come file di espressione genica (GE) nel CLC Genomics Workbench per essere utilizzati per la successiva analisi dell'espressione genica differenziale.

4.7. Analisi dell'espressione genica differenziale tra i gruppi dietetici

Prima dell'analisi dell'espressione differenziale per l'effetto della dieta, abbiamo utilizzato l'analisi delle componenti principali (PCA) con i valori RPKM per identificare i valori anomali e ciò ha dimostrato che due mucche (Blood020009, MP e Blood020103, PP) erano valori anomali della popolazione e sono stati quindi esclusi da ulteriori analisi (file supplementare S4A). L'analisi delle componenti principali ha inoltre mostrato che vi era solo una sovrapposizione limitata nel modello di espressione genetica complessiva tra le vacche PP e MP (file supplementare S2B). Ciò ha supportato il disegno dello studio originale per analizzare ciascun gruppo di età separatamente. I file GE derivati ​​da tutti i singoli campioni sono stati quindi separati per fascia di età (PP, n=5–6 per gruppo e MP, n=14–15 per gruppo). I DEG tra i gruppi dietetici nelle vacche PP o MP sono stati identificati con CLC Genomics Workbench V21 tramite una procedura unidirezionale simile all'ANOVA. I tassi di falsa scoperta (FDR) per test multipli sono stati aggiustati con Benjamini-Hochberg (BH) e la significatività è stata considerata p <0,05. I cambiamenti di piega (FC) sono stati calcolati come il rapporto di espressione genica del gruppo con concentrazione più alta rispetto al gruppo con concentrazione più bassa (ad esempio, HC vs. LC, MC vs. LC o HC vs. MC) se il valore del gruppo con concentrazione più alta era maggiore di quello del gruppo con concentrazione inferiore (cambiamento di piega positivo, sovraregolazione). Se il valore del gruppo con concentrazione più bassa era maggiore di quello del gruppo con concentrazione più alta, veniva utilizzato il rapporto tra il gruppo con concentrazione più bassa e il gruppo con concentrazione più alta (ad esempio, LC vs. HC, MC vs. HC e LC vs. MC ) (cambiamento di piega negativo, downregulation). I DEG sovraregolati e sottoregolati con un cambiamento di piega assoluto maggiore o uguale a 1,5 tra i gruppi dietetici sono stati selezionati per ulteriori analisi.

4.8. Analisi dell'arricchimento dell'ontologia genetica (GO).

I DEG derivati ​​dai confronti di coppie tra i gruppi dietetici sono stati immessi nella Partek Genomics Suite V7.1 (Partek Incorporation, Chesterfield, MO, USA) per l'analisi di arricchimento GO per lo studio delle funzioni biologiche e delle interazioni tra i DEG e l'enciclopedia di Kyoto associata di Percorsi di geni e genomi (KEGG) con un genoma di Bos taurus ARS-UCD1.2. È stato utilizzato il test esatto di Fisher con aggiustamento BH e la significatività statistica è stata considerata p <0,05.

4.9. Analisi statistica dei dati fenotipici

I dati derivati ​​da tutte le vacche sono stati prima suddivisi per gruppo di età (vacche PP e MP), secondo il disegno dello studio. I valori di DMI, BW, parametri del latte, EBAL, BCS, metaboliti circolanti (glucosio, urea, BHB, NEFA, colesterolo e IGF{{0}}), SCC (trasformato logaritmicamente) e conta delle cellule uterine e i loro rapporti sono stati riassunti come media ± errore standard della media (SE). L'analisi statistica è stata utilizzata per confrontare le differenze tra i gruppi dietetici utilizzando un'ANOVA unidirezionale integrata nel pacchetto software SPSS V28 (Chicago, IL, USA). L'omogeneità della varianza per ciascuna variabile è stata testata con la statistica di Levene prima dell'ANOVA. I risultati hanno mostrato che l’omogeneità tra i gruppi per ECM, EBAL, glucosio, urea, BHB e IGF-1 nelle vacche PP non è stata raggiunta, quindi per queste variabili è stata applicata la trasformazione logaritmica. Laddove l'ANOVA ha mostrato significatività, sono stati effettuati confronti multipli con il metodo LSD di Fisher per identificare la fonte delle differenze. Poiché non è stato possibile ottenere l'omogeneità della varianza per i dati relativi al SCC del latte e alla citologia uterina dopo la trasformazione logaritmica, queste variabili sono state testate utilizzando un'ANOVA unidirezionale Kruskal-Wallis con confronti multipli di Dunn. I dati sulla fertilità sono stati testati con il metodo Wilcoxon. In tutti i casi, la significatività è stata considerata p < 0,05.

5. Conclusioni

Questo studio supporta il lavoro precedente volto a dimostrare chiari collegamenti tra lo stato metabolico delle vacche all’inizio della lattazione e la loro funzione immunitaria. La maggior parte delle ricerche precedenti mirate a migliorare la salute postpartum attraverso una migliore alimentazione si sono concentrate sul periodo prepartum e hanno dimostrato che la sovralimentazione e un elevato BCS in questo momento promuovono la successiva mobilizzazione dei lipidi e un aumento della risposta infiammatoria durante il periodo peripartum [34]. Abbiamo invece valutato se sia possibile alterare la funzionalità immunitaria dopo il parto modificando la dieta di allattamento. Abbiamo scoperto che la risposta all'inclusione di un concentrato aggiuntivo, che forniva una dieta formulata per soddisfare i fabbisogni energetici e proteici dell'animale, produceva effetti diversi sul trascrittoma dei leucociti nelle mucche MP e PP. Nelle vacche MP, la dieta HC era chiaramente benefica, poiché i leucociti della mucca LC presentavano una sovraregolazione della cascata del complemento e della coagulazione e meccanismi di difesa immunitaria innata contro i patogeni. Al contrario, i leucociti nelle vacche PP alimentate con dieta HC hanno mostrato maggiori risposte immunitarie/infiammatorie e avevano un rapporto PMN:UEC più elevato, suggerendo un aumento della migrazione dei leucociti verso l’utero. Queste mucche hanno successivamente avuto un intervallo tra il parto e il concepimento più lungo, indicando una fertilità inferiore. Sono necessari ulteriori studi con un numero maggiore di vacche per confermare la scoperta di un effetto della dieta sulla fertilità e per comprendere più a fondo come le risposte metaboliche della dieta postpartum differiscono negli animali più giovani.

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