Ripensare il blocco dei checkpoint immunitari: “oltre le cellule T”

ASTRATTO

Il successo clinico degli inibitori del checkpoint immunitario ha evidenziato il ruolo centrale del sistema immunitario nel controllo del cancro. Gli inibitori dei checkpoint immunitari possono rinvigorire l’immunità antitumorale e sono ora lo standard di cura per diverse neoplasie. Tuttavia, la ricerca sul blocco dei checkpoint immunitari è stata in gran parte basata sul dogma centrale secondo cui le terapie dei checkpoint colpiscono intrinsecamente le cellule T, innescando il potenziale tumoricida del sistema immunitario adattivo. Sebbene le cellule T rimangano senza dubbio un elemento fondamentale della storia, prove crescenti, qui esaminate, indicano che gran parte dell’efficacia delle terapie checkpoint può essere attribuibile al sistema immunitario innato. Ricerche emergenti suggeriscono che gli anticorpi del checkpoint diretti alle cellule T, come la proteina antiprogrammata della morte cellulare-1 (PD-1) o il ligando della morte programmata-1 (PD-L1), possono avere un impatto sull'immunità innata mediante entrambi percorsi diretti e indiretti, che possono in definitiva modellare l’efficacia clinica. Tuttavia, i meccanismi e gli impatti di queste attività devono ancora essere completamente chiariti e le terapie checkpoint hanno effetti potenzialmente benefici e dannosi sull’immunità antitumorale innata. Ulteriori ricerche sul ruolo dei sottoinsiemi innati durante il blocco dei checkpoint potrebbero essere fondamentali per lo sviluppo di terapie combinate che aiutino a superare la resistenza ai checkpoint. Il potenziale delle terapie checkpoint per amplificare l’immunità antitumorale innata rappresenta un nuovo campo promettente che può essere tradotto in immunoterapie innovative per i pazienti che combattono tumori maligni refrattari.

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INTRODUZIONE

La ricerca sul cancro è stata trasformata con la scoperta che la disfunzione delle cellule T tumore-specifiche era reversibile con il blocco del checkpoint immunitario.1 Anticorpi antagonisti che prendono di mira la proteina citotossica T-linfocita-associata 4 (CTLA-4) e la proteina della morte cellulare programmata{{7 }} (PD-1) ​​o il ligando di morte programmato-1 (PD-L1) stimolano l'immunità antitumorale e sono ora terapie approvate in molti tipi di cancro, tra cui il melanoma metastatico e il cancro polmonare non a piccole cellule. 2 Questi successi clinici evidenziano l’immenso potenziale dell’immunoterapia diretta contro le cellule T nel cancro; tuttavia, stiamo appena iniziando a comprendere l’intera attività molecolare di tali agenti. I notevoli risultati ottenuti da queste terapie in clinica hanno elevato le cellule T al di sopra di tutte le altre linee immunitarie nel campo dell’immunità antitumorale. Pertanto, l’ambito della ricerca sul blocco del checkpoint immunitario potrebbe essere stato limitato dal “centrismo delle cellule T”. Prove crescenti, esaminate di seguito, evidenziano la crescente consapevolezza che le cellule immunitarie innate mediano aspetti chiave della biologia della terapia del checkpoint. Nonostante i numerosi successi clinici, molti pazienti non rispondono alle terapie checkpoint e alcuni tipi di cancro sono quasi del tutto resistenti. Una migliore comprensione dei meccanismi attraverso i quali funzionano gli attuali inibitori dei checkpoint consentirà ai medici di ampliare i benefici di questi trattamenti a un numero maggiore di pazienti.

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Tenere sotto controllo le cellule T

Il PD-1 e i suoi ligandi sono fondamentali per la regolazione dell'infiammazione e della tolleranza periferica. Topi PD-1- null sviluppano spontaneamente una sindrome simile al lupus dovuta in parte alla proliferazione incontrollata di cellule T autoreattive.3 PD-1 limita l'attività delle cellule T quando impegnate dai suoi ligandi, PD-L1 e PD- L2.4 L'espressione di PD-L1 è inducibile in una varietà di tipi cellulari, comprese le cellule immunitarie adattative e innate, le cellule mesenchimali e le cellule tumorali.4 Al contrario, l'espressione di PD-L2 è limitata alle cellule presentanti l'antigene (APC) e un sottoinsieme più piccolo di tipi di cellule tumorali.4 La segnalazione PD-1/PD-L1 modula profondamente la secrezione di citochine delle cellule T, smorza la segnalazione del recettore delle cellule T (TCR) e accorcia il coinvolgimento delle sinapsi tra le cellule T e le APC, con conseguente compromissione dell'azione antitumorale immunità.5 Il blocco PD-1/PD-L1 inverte parzialmente questi effetti negativi, aumentando la proliferazione delle cellule T, l'infiltrazione tumorale e la citotossicità.4

CTLA-4 è un altro recettore coinibitore cruciale delle cellule T, che è sovraregolato nelle cellule T attivate ed espresso in modo nativo dalle cellule T regolatorie (Tregs).6 Nelle cellule T a riposo, CTLA-4 è immagazzinato all'interno degli endosomi citosolici. 6 Dopo l'impegno del TCR e la segnalazione costimolatoria tramite CD28, le molecole CTLA-4 si traslocano sulla superficie cellulare, dove superano CD28 per i suoi ligandi, B7.1 e B7.2, espressi nelle APC, frenando la proliferazione e l'attivazione delle cellule T .6 CTLA-4 ha un ruolo immunosoppressivo non ridondante; Topi carenti di CTLA-4-muoiono a 1 mese di età a causa di una malattia linfoproliferativa letale.7 In diversi modelli, il blocco di CTLA-4 determina il rigetto del tumore mediato dalle cellule T.1 Questi risultati hanno stimolato studi clinici che hanno dimostrato l'efficacia dell'anti-CTLA-4 in più tumori come agente singolo o in combinazione con l'anti-PD-1.

Figura 1 Regolazione diretta e indiretta dei sottoinsiemi immunitari innati mediante blocco PD-1. La regolazione delle cellule immunitarie innate mediante il blocco del PD-1 è divisa in percorsi diretti (a sinistra) e indiretti (a destra). Nel percorso diretto, il blocco del PD-1 rimodella i fenotipi e le funzioni dei sottoinsiemi del sistema immunitario innato, come TAM, DC, MDSC, cellule NK e ILC2, esprimendo PD-1 (a sinistra). Nella via indiretta, le cellule T attivate dall'anti-PD-1 secernono IFN-y, che a sua volta polarizza fenotipicamente le cellule mieloidi all'interno della TME (a destra). Le frecce in grassetto indicano le interazioni. DC, cellule dendritiche; IFN-y, interferone gamma; ILC, cellule linfoidi innate; MDSC, cellule soppressorie di derivazione mieloide: NK, cellule natural killer; PD-1, proteina programmata della morte cellulare 1; TAM, macrofagi associati al tumore; TEM, microambiente tumorale.

L'impatto degli inibitori del checkpoint sulle cellule immunitarie innate

Negli ultimi due decenni, la ricerca sugli inibitori dei checkpoint si è concentrata sulle cellule T come principale bersaglio terapeutico; tuttavia, studi recenti hanno evidenziato gli effetti significativi degli inibitori del checkpoint sulle cellule immunitarie innate. Il blocco dei checkpoint ha un impatto sia diretto che indiretto sulle linee immunitarie innate (figura 1). Nella via indiretta, l'anti-PD-1/PD-L1 o l'anti-CTLA-4 rinvigorisce l'immunità delle cellule T, che, a sua volta, modella o polarizza fenotipicamente le risposte delle cellule immunitarie innate all'interno del microambiente tumorale (TME ). Nella via diretta, le cellule immunitarie innate sono bersagli diretti del blocco del checkpoint immunitario perché i sottotipi di cellule mieloidi e linfociti innati esprimono PD-1 e/o PD-L1. Questa interazione altamente sfumata di tipi cellulari dopo la terapia del checkpoint testimonia l’importanza di studiare come la biologia del checkpoint influisce sulle popolazioni immunitarie innate.

Macrofagi associati al tumore e altre cellule mieloidi nel blocco del checkpoint PD-1/PD-L1

Regolazione indiretta

La funzione dei macrofagi è orchestrata da cellule T attivate.8 Le citochine associate alle cellule T come l'interferone gamma (IFN-) stimolano i macrofagi ad aumentare l'espressione delle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), dei recettori costimolatori e del Th1-polarizzante citochina IL-12.9 Di conseguenza, le cellule T attivate dal blocco del checkpoint alterano drasticamente i fenotipi dei macrofagi associati al tumore (TAM) e dei monociti. Gubin e colleghi hanno utilizzato il sequenziamento dell'RNA a cellula singola (scRNA-seq) e la citometria di massa per valutare i cambiamenti trascrizionali e funzionali nelle cellule mieloidi infiltranti il ​​tumore dopo il trattamento con anti-PD-1.10 Blocco PD-1 ha comportato una riduzione dei TAM CD206+ e un aumento dei TAM inducibili dell'ossido nitrico sintasi+ (iNOS+).10 Questo cluster INOS+ TAM è stato arricchito per i geni coinvolti nella segnalazione IFN-, nell'elevata attività glicolitica e nell'attività NF-κB, indicativo di un potenziale antitumorale.10 Inoltre, con la neutralizzazione dell'IFN, la ripolarizzazione dei TAM/monociti mediata da anti-PD-1- era significativamente ridotta.10 Questi risultati dimostrano il potenziale delle cellule T attivate dal checkpoint di secernere fattori, come l'IFN -, che rimodellano la TME verso un ambiente ostile al tumore, ricco di iNOS+ TAMS, che sono associati a risultati migliori in molti modelli tumorali. Pertanto, l'anti-PD-1 può essere aggiunto a un elenco crescente di terapie volte a "ripolarizzare" i TAM allontanandoli da un fenotipo permissivo per il tumore.

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Regolazione diretta

Le cellule mieloidi mostrano livelli di PD-1 rilevabili.11 È stato dimostrato che i TAM che esprimono PD-1 promuovono la progressione del tumore in diversi tumori, tra cui il cancro gastrico,12 il cancro del colon-retto,13 e il cancro del polmone.14 La comparsa della PD{ {6}} nei progenitori mieloidi è un evento precoce nella progressione del tumore, poiché il recettore può essere indotto da condizioni infiammatorie.15 Infatti, i macrofagi derivati ​​dal midollo osseo (BMDM) sovraregolano rapidamente il PD-1 dopo il recettore Toll-like ( TLR)−2 impegno16; corrispondentemente, la PD-1 è stata sovraregolata dai macrofagi in un modello murino di sepsi.17 La segnalazione a valle della PD-1 nei macrofagi è controversa e potrebbe dipendere dal contesto. I BMDM PD-1-null esprimono più IL-6 e CCL2 (MCP-1) 4 ore dopo la stimolazione TLR2, suggerendo un ruolo antinfiammatorio del PD-1.16 Al contrario, le prove in vivo hanno riscontrato l’effetto opposto. Topi settici PD-1-null dimostrano livelli ridotti di CCL2 peritoneale, fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-) e IL-1, un'osservazione che è stata abrogata in seguito alla deplezione dei macrofagi peritoneali.17 Questi dati in vivo suggeriscono che l'espressione del PD-1 sui macrofagi aumenta l'infiammazione sistemica. Nonostante la mancanza di un chiaro percorso di segnalazione a valle del PD-1 nei macrofagi, esiste un chiaro legame tra il PD espresso da TAM-1 e l'infiammazione associata al cancro. Nei modelli di cancro, sono stati riscontrati effetti antitumorali sinergici con la combinazione del blocco PD-1/PD-L1 e della neutralizzazione di IL-618 o IL-1, 19 indicando che prendere di mira la TME infiammatoria potrebbe amplificare l'efficacia del blocco del PD-1. Questo effetto probabilmente coinvolge il PD-1 espresso dai macrofagi, poiché gli autori hanno scoperto che l'agonismo del PD-1 sopprimeva la produzione di IL-6 da parte dei TAM portatori di PD-1-, mentre gli anti-PD -L1 ha potenziato la produzione di IL-6.18 Pertanto, potrebbero essere necessarie terapie antinfiammatorie per massimizzare il beneficio del blocco del checkpoint. Questi dati suggeriscono un ruolo complesso della segnalazione mieloide intrinseca del PD-1 ed evidenziano la necessità di delineare le differenze meccanicistiche tra il blocco del PD-1 e la delezione del PD-1. Nuovi sistemi modello hanno consentito di studiare gli effetti specifici del mieloide del blocco del checkpoint. Strauss e colleghi hanno generato un modello murino in cui PD-1 veniva selettivamente eliminato nelle cellule mieloidi.15 Gli autori hanno utilizzato questi topi per analizzare il contributo relativo della segnalazione PD-1 delle cellule mieloidi rispetto a quella delle cellule T nel cancro del colon. 11 È interessante notare che la delezione PD-1 mielo-specifica si è rivelata altrettanto efficace nel limitare la crescita del tumore quanto la delezione PD-1 globale e più efficace dell'ablazione selettiva della PD-1 nelle cellule T.15 Un avvertimento a questi studi è che gli approcci genetici per interrompere la segnalazione PD-1/PDL-1 potrebbero non modellare accuratamente le terapie terapeutiche antagoniste. Tuttavia, gli autori hanno trattato topi privi di gene attivatore di ricombinazione-2-privi di cellule T e B con anti-PD-1 e hanno comunque osservato una significativa riduzione della crescita del tumore,15 sottolineando ancora una volta l'importanza fondamentale del sistema immunitario innato per il blocco del posto di blocco.

L'impegno del PD-1 sulle cellule mieloidi influenza l'infiltrazione, la differenziazione, la funzione effettrice e il metabolismo cellulare. Alcuni di questi percorsi e risultati sono evidenziati nella Figura 2. Il coinvolgimento del PD-1 sposta il metabolismo attivato dei monociti umani verso la fosforilazione ossidativa. Il blocco di PD-1/PD-L1 è in grado di ripristinare la glicolisi, che è correlata con una maggiore fagocitosi anticorpo-dipendente.20 Le cellule mieloidi carenti di PD-1- mostrano uno sviluppo alterato a partire dai progenitori mieloidi comuni, con un ridotto accumulo di granulociti /macrofagi nel midollo osseo e una maggiore espansione dei monociti Ly6C+ e delle cellule dendritiche (DC) all'interno del tumore.15 Questi dati suggeriscono che la segnalazione PD-1 nei progenitori mieloidi può dirigere la mielopoiesi verso la linea granulocitica, determinando un numero maggiore di MDSC granulocitiche immunosoppressive. Questi risultati suggeriscono che le terapie checkpoint possono trarre beneficio da combinazioni di farmaci che limitano l’infiltrazione tumorale da parte di sottogruppi mieloidi. Per quanto riguarda la funzione effettrice, i TAM che esprimono PD-1 dimostrano alti livelli di CD206, arginasi 1 (ARG1) e IL-10, che attenuano le risposte immunitarie antitumorali. 13 Al contrario, il deficit di PD-1 nei TAM sposta il loro fenotipo verso un profilo antitumorale, con livelli più elevati di TNF, iNOS e MHCII.21 In più modelli di cancro, l'infiltrazione di TAM è sbilanciata verso CD206+, ARG1macrofagi alti22; tuttavia, la terapia anti-PD-1 inverte questa tendenza, aumentando l'espressione di iNOS, TNF- e IL-6, che possono aumentare l'immunità antitumorale.14 Questi risultati confermano i risultati scRNA-seq di Gubin et al. al e evidenziano in modo sorprendente che a livello trascrittomico, la terapia checkpoint ha un impatto concomitante, se non maggiore, sul fenotipo TAM rispetto al fenotipo delle cellule T. Insieme, questi dati suggeriscono che il blocco del PD-1 riprogramma i TAM verso un fenotipo antitumorale.

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Effetti specifici mieloidi del blocco PD-L1

Canonicamente, PD-L1 interagisce con il suo recettore PD-1 sulle cellule T tumore-specifiche e limita la loro attività antitumorale. 23 La terapia anti-PD-L1 blocca questa interazione, rinvigorendo così la proliferazione delle cellule T e le funzioni effettrici come la secrezione di IFN.24 Tuttavia, come l'anti-PD-1, il blocco PD-L1 può anche modulare direttamente e indirettamente le cellule mieloidi funzione. È stato dimostrato che l'anti-PD-L1 ripolarizza indirettamente i TAM verso un fenotipo proinfiammatorio, in un processo mediato dall'IFN- -dipendente dalle cellule T.25 Questi TAM trattati con anti-PD-L1- mostrano una ridotta espressione di ARG1 e una maggiore espressione di iNOS, MHCII e CD40, indicativi di un fenotipo antitumorale.25 Nella via diretta, i TAM possono interagire con le cellule T attivate che esprimono PD-L1. Il PD-L1 delle cellule T si lega al PD-1 espresso da TAM e induce un fenotipo tollerogenico.26 Questi risultati indicano che l'anti-PD-L1 può interrompere più assi di coinvolgimento del PD-1 per ripristinare il potenziale antitumorale dei TAM .

Figura 2 Vie di segnalazione dirette e indirette a valle del blocco PD-1 nelle cellule mieloidi. Il blocco PD-1 si traduce in esiti di segnalazione diretta (sinistra) e indiretta (destra). Il blocco diretto del PD-1 nelle cellule mieloidi che esprimono il PD-1- attiva le vie di segnalazione NF-kB e pSTAT1 e riprogramma il glicometabolismo (a sinistra). Nel percorso indiretto, le cellule T attivate anti-PD-1 secernono IFN-y che attiva le vie di segnalazione NF-kB e pSTAT1 nelle cellule mieloidi (a destra). Le frecce indicano gli esiti a valle del blocco PD-1. IFN-, interferone gamma; PD-1, proteina 1 della morte cellulare programmata.

La maggior parte della ricerca sulla terapia anti-PD-L1 enfatizza l'interazione interrotta tra PD-L1 espresso dal tumore e PD espresso dalle cellule T-1. Tuttavia, PD-L1 è ampiamente inducibile su sottogruppi immunitari, cellule tumorali e persino cellule endoteliali, in un processo IFN- -dipendente.27 Pertanto, sia il tumore che il PD-L1 dell'ospite sono intimamente coinvolti nel blocco del checkpoint.28 In In alcune neoplasie, come il cancro del colon, gli infiltrati immunitari tumorali esprimono PD-L1 a livelli significativamente maggiori rispetto alle cellule tumorali.29 Pertanto, è essenziale studiare il ruolo del PD-L1 estrinseco del tumore. Infatti, le APC residenti nei linfonodi che esprimono PD-L1 possono inibire l'attivazione delle cellule T e prevenire il reclutamento di cellule T innescate nella TME.30 È stato dimostrato che i neutrofili PD-L1+ compromettono l'immunità delle cellule T nel carcinoma epatocellulare.31 In alcuni modelli, l’espressione di PD-L1 da parte delle cellule tumorali è superflua per l’efficacia anti-PD-L1. 28 30 32 L'efficacia del blocco di PD-L1 è stata mantenuta in un modello di adenocarcinoma del colon con deficit di PD-L.30 Tuttavia, l'efficacia veniva persa se il midollo osseo di topi privi di PD-L1- veniva trapiantati in topi portatori di tumore, indicando che una cellula ematopoietica era responsabile della risposta.30 L'efficacia è stata nuovamente persa dopo l'esaurimento delle cellule CD11b+ PD-L1+, presumibilmente a causa dell'assenza di PD-L{{46} }che esprimono APC.30 Questi dati supportano il ruolo essenziale delle cellule mieloidi PD-L1+ nella terapia anti-PD-L1. Altri autori hanno contestato la natura superflua del PD-L1 espresso dal tumore e hanno dimostrato che sia il PD-L1 espresso dal tumore che quello espresso da APC sono coinvolti in aspetti critici ma distinti del blocco del PD-1/PD-L1.{{62 }} Questi risultati hanno ampie implicazioni per l'uso di PD-L1 come biomarcatore per l'efficacia del checkpoint. I pazienti possono trarre beneficio dalla quantificazione separata dell'espressione PD-L1 del tumore e dell'infiltrato immunitario tumorale e diversi tipi di cancro possono avere una biologia divergente in questo caso. Il ritratto dell’impegno mieloide del PD-L1 è ulteriormente complicato dalle prove in vitro che il PD-L1 può avere una propria segnalazione intrinseca. Quando attivato, PD-L1 può indurre proliferazione, espressione di molecole costimolatorie, produzione di citochine e segnalazione mTOR nei macrofagi.33 È interessante notare che i TAM possono esprimere sia PD-L1 che i suoi ligandi PD-1 e B7.1 (CD80 ), che hanno sufficiente affinità per interagire in cis.34 Le prove presentate sopra suggeriscono che gli inibitori PD-L1 possono avere effetti intrinseci sulle cellule mieloidi prevenendo il coinvolgimento diretto in trans o interrompendo le interazioni cis. Sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire la modalità primaria dell’efficacia anti-PD-L1 mieloide-specifica. Le potenziali modalità includono l'inibizione dell'impegno del PD-1 sulle cellule mieloidi, l'interruzione dell'impegno del PD-L1 mieloide con il PD delle cellule T-1 o l'inibizione della segnalazione diretta attraverso il PD-L1 mieloide. Indipendentemente dalla modalità primaria, è sempre più apprezzato il fatto che il blocco di PD-L1 possa avere risultati molto diversi rispetto al blocco di PD-1. In effetti, in un modello di cancro del pancreas, la combinazione di PD-1 e PD-L1 conferisce un beneficio sinergico rispetto a ciascuna delle due terapie da sole.35 Sulla base del ruolo essenziale di PD-1/PD-L1 nel processo mieloide cellule, è probabile che il successo della terapia combinata antiPD-L1 e anti-PD-1 dipenda sia dall'interruzione della diafonia delle cellule TAM-T immunosoppressive sia dal rimodellamento diretto del fenotipo TAM verso un profilo antitumorale.

Collegamento del blocco PD-1/PD-L1 e della funzione DC

Regolazione indiretta

L'efficacia del blocco del PD-1 può dipendere dall'attivazione indiretta delle DC infiltranti il ​​tumore. Le cellule T attivate anti-PD-1- secernono IFN- , che a sua volta mette in moto un drammatico cambiamento trascrittomico nel fenotipo DC, poiché esprimono il meccanismo di presentazione dell'antigene, sovraregolando IL-12, CCR7, MHCII, CD80, CD40, TLR-2 e TLR-4.36 37 CCR7 consente il traffico delle DC verso i linfonodi drenanti il ​​tumore, dove le DC innescano le risposte delle cellule T CD8 e CD4 tramite MHC di classe I e II e il molecole costimolatorie CD80/CD86.36 37 La segnalazione attraverso CD40 e TLR aumenta ulteriormente la produzione di IL-12, che attiva le cellule T CD8 e polarizza le cellule T CD4 innescate verso il sottoinsieme Th1, che a sua volta secernono ulteriore IFN- in un ciclo feed-forward.36-38 In sintesi, le DC stimolate dall'IFN- - sono APC altamente efficienti, specializzate per l'innesco delle risposte delle cellule T in vivo. Studi recenti hanno dimostrato che le DC sono necessarie anche per l'efficacia anti-PD-1. In un modello di fibrosarcoma, la regressione tumorale mediata da anti-PD-1- veniva persa quando le DC erano esaurite o quando IL-12 veniva neutralizzata.38 Inoltre, topi portatori di tumore con DC che esprimevano una mutazione condizionale nell'IFN- i recettori dimostrano una produzione di IL-12 profondamente depressa e perdono la reattività del checkpoint.38 È interessante notare che queste DC di IL-12+ sono arricchite per componenti non canonici del percorso di segnalazione di NF-κB, come CD40, Nfkb2 e Relb. 38 In effetti, l'inattivazione della via non canonica NF-κB annulla anche l'efficacia del checkpoint.38 Queste osservazioni hanno motivato i ricercatori a combinare gli agonisti CD40 con il blocco PD-1/PD-L1 a causa della potenziale sinergia.38 Migliorando la La diafonia DC tramite segnalazione NF-κB non canonica offre l'avvincente possibilità di convertire la TME da immunologicamente fredda a reattiva al checkpoint.

Regolazione diretta

Sebbene la regolamentazione indiretta delle DC da parte dell'anti-PD-1 sia ben consolidata, stanno ancora emergendo prove di regolamentazione diretta. I pazienti con carcinoma epatocellulare39 e cancro ovarico40 hanno un numero maggiore di DC portatrici di PD1-, suggerendo che l'espressione di PD-1 da parte delle DC può essere dipendente dal contesto. Prove emergenti indicano che la segnalazione PD-1 nelle DC può inibire la sopravvivenza41 e diminuire la secrezione di IL-12 e TNF-, sopprimendo il potenziale antitumorale delle cellule T CD8+.42 PD{{13} } nelle DC attiva anche la via canonica NF-κB e sopprime il meccanismo di presentazione dell'antigene bloccando l'espressione superficiale di MHCI.40 43 Modelli in vivo di carcinoma epatocellulare supportano un ruolo immunosoppressivo per la PD-1 nelle DC. L'ablazione specifica di PD-1 sulle DC intratumorali ha comportato un potenziamento del priming delle cellule T CD8 tumore-specifiche, che hanno mostrato una maggiore espressione delle molecole citolitiche perforina e granzima-B.39 Inoltre, l'inibizione di PD-1 aumenta le DC espressione delle molecole costimolatorie, CD40, CD80 e CD86,43 che potrebbe essere dovuto a un aumento del segnale MAPK.41 Gli studi di cui sopra dimostrano che PD-1 regola la funzione delle DC sia direttamente che indirettamente all'interno del processo infiammatorio TME. In alcuni modelli, l'efficacia anti-PD-1 richiede indirettamente componenti del percorso non canonico NF-κB e in altri, l'anti-PD-1 guida direttamente la sovraregolazione di componenti come CD40. Pertanto, molteplici linee di evidenza suggeriscono la combinazione di agonisti CD40 e anti-PD-1 come mezzo per migliorare l'immunità antitumorale e superare la resistenza ai checkpoint.

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Effetti specifici della DC del blocco PD-L1

La terapia anti-PD-L1 è ora impiegata per trattare numerosi tipi di tumori solidi; tuttavia, il meccanismo d’azione rimane ancora dibattuto. Un indizio verso questo meccanismo è la recente osservazione che l'espressione di PD-L1 da parte dell'infiltrato immunitario intratumorale è una correlazione migliore con la risposta clinica anti-PD-L1 rispetto al PD-L1.4444 espresso dal tumore. È interessante notare che una firma trascrittomica specifica per DC, calcolata da i livelli di espressione di XCR1, BATF3, IRF8 e Flt3, pazienti con carcinoma a cellule renali e cancro del polmone trattati con anti-PD-L1-stratificato in sopravvissuti a lungo e a breve termine, suggerendo che PD-L1 espresso da DC può essere un obiettivo primario di successo della terapia anti-PD-L1. 45 PD-L1 è ampiamente espresso nei sottogruppi di DC, con una maggiore espressione nel contesto di infiammazione e cancro. 45 46 Il PD-L1 espresso dalle DC agisce come controllo omeostatico dell'autoimmunità e limita direttamente le risposte delle cellule T altamente attive.47 In due recenti pubblicazioni, i ricercatori hanno cercato di studiare il contributo delle DC alla terapia anti-PD-L1 mediante metodi condizionali eliminando PD-L1.48 49 In entrambi i casi, l'ablazione selettiva di PD-L1 sulle DC ha limitato la crescita del tumore con la stessa efficacia dei topi sistemici knockout per PD-L1, indicando che le DC sono probabilmente fondamentali per la risposta delle cellule T valutata rinvigorita dopo l'anti -Immunoterapia PD-L1. 48 49 Nelle fasi iniziali, la delezione PD-L1 specifica delle DC ha portato a una maggiore infiltrazione tumorale delle cellule T effettrici CD8+, ma non alla proliferazione, indicando che potrebbe esserci un aumento del reclutamento delle cellule T.48 Questi risultati evidenziano che i pazienti che rispondono al checkpoint possono essere meglio identificati misurando l'espressione DC di PD-L1 piuttosto che l'espressione del tumore.

A parte il classico asse PD-1/PD-L1, il PD-L1 espresso da APC può anche legare la molecola costimolatoria B7.1 (CD80) in cis con un'affinità maggiore rispetto al recettore costimolatorio canonico CD28.34 delle cellule T. Di conseguenza , L'immunità delle cellule T può essere soppressa sia dagli assi PD-L1−B7.1 che PD-L1−PD1, sia smorzando direttamente la segnalazione del TCR sia limitando un segnale costimolatorio necessario.50 In due recenti pubblicazioni, i ricercatori sono giunti a conclusioni divergenti se il blocco dell'interazione cis di PD-L1 migliora la segnalazione del CD28.45 48 L'interruzione dell'interazione PD-L1−B7.1 può infatti accelerare la crescita del tumore consentendo il coinvolgimento di PD-L1/PD-1; tuttavia, questa osservazione è stata accompagnata da un aumento significativo del numero di cellule T intratumorali, indicando che potrebbe essersi verificato anche un potenziamento del priming tramite CD28-B7.1.48 Sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire il ruolo del cis PD-L1− B7.1 si lega alle DC e se il PD-L1 specifico delle DC coinvolge il PD-1 espresso da altri sottoinsiemi mieloidi come i TAM. Le DC sono APC specializzate in modo univoco che innescano in modo efficiente le risposte naive delle cellule T.51 Le prove di cui sopra dimostrano che le DC sono fondamentali per l'efficacia anti-PD-L1. Pertanto, il blocco di PD-L1 può offrire un approccio mirato per migliorare l’innesco mediato dalle DC delle risposte delle cellule T antitumorali, sia rilasciando B7.1 che disinibendo l’attivazione del TCR a valle.

Il ruolo complesso delle MDSC nel blocco del PD-1/PD-L1

Le MDSC sono un gruppo eterogeneo di cellule mieloidi relativamente immature, che possono svolgere un ruolo immunosoppressivo in molteplici tumori.52 53 Gli effetti del blocco PD-1/PD-L1 sulle MDSC sono molteplici e rappresentano un'operazione a doppio taglio spada perché possono contemporaneamente indurre l’immunità antitumorale e promuovere la tolleranza.

Regolazione indiretta

Sebbene le terapie anti-PD-1/PD-L1 abbiano dimostrato il potenziale di indurre attività mieloide antitumorale, possono anche avere esiti protumorigenici complessi, come il reclutamento di MDSC immunosoppressori.54 Le MDSC circolanti sono associate a una scarsa sopravvivenza nei pazienti con melanoma che hanno ricevuto terapia checkpoint.53 La frequenza di MDSC infiltranti il ​​tumore è significativamente elevata nelle biopsie di melanoma metastatico ottenute da pazienti sottoposti a terapia anti-PD-1. 55 Questo reclutamento può essere guidato da cellule T attivate anti-PD-1-che secernono IFN-, che attiva parzialmente l'inflammasoma NLRP3 intrinseco al tumore.54 L'attività NLRP3 guida il reclutamento mediato da CXCL5-di MDSC granulocitiche.54 Pertanto , la terapia anti-PD-1 può portare alla resistenza anti-PD-1, in un apparente circolo vizioso di feedback negativo. Oltre all'IFN-, le cellule T CD8+ attivate dal checkpoint secernono più TNF-, entrambi i quali portano alla produzione tumorale di CSF1. Il CSF1, a sua volta, induce la differenziazione e la sopravvivenza dei TAM e delle MDSC protumorigeni, amplificando così la resistenza ai checkpoint.56 Sulla base di questi dati, una strategia chiara per migliorare l'efficacia dei checkpoint è limitare l'infiltrazione delle MDSC. Infatti, in modelli di cancro al pancreas, cancro al colon e cancro al seno, il blocco di CXCR2 sopprime il reclutamento di MDSC, innescando l'immunità antitumorale, aumentando il numero di cellule T e sensibilizzando i tumori alla terapia antiPD-1. 57 Gli studi di cui sopra dimostrano chiaramente che il blocco dei checkpoint PD-1/PD-L1 può indirettamente stimolare la resistenza ai checkpoint espandendo e reclutando MDSC. Il trattamento di tumori solidi multipli può trarre vantaggio dalla combinazione della terapia checkpoint con strategie mirate per limitare la chemiotassi delle MDSC.

Regolazione diretta

Le MDSC possono esprimere sia PD-1 che PD-L1, il che può portare a un'inversione dell'immunosoppressione correlata alle MDSC quando colpite dal blocco dei checkpoint.58-60 Come con altri lignaggi mieloidi, l'espressione delle MDSC di PD-1 e PD-L1 è inducibile in contesti infiammatori.58 Le cellule T attivate possono promuovere l'espressione MDSC di PD-L1 attraverso l'asse IFN- −IFNGR1−STAT1−IRF1.59 MDSC con elevata espressione di PD-1/PD-L1 dimostrano alti tassi di proliferazione, portando alla loro robusta espansione nella TME di molti tumori.58 L'espressione congiunta di PD-1 e PD-L1 da parte delle MDSC suggerisce che sia l'anti-PD-1 che l'antiPD-L1 dovrebbero essere valutati per il loro potenziale di rimodellamento delle MDSC. In effetti, in un modello di mieloma multiplo, la terapia congiunta con anti-PD-1 e anti-PD-L1 ha prevenuto la promozione del cancro mediata dalle MDSC in misura maggiore rispetto a quella utilizzata singolarmente.60 A differenza di tumori come il melanoma, e il carcinoma a cellule squamose del collo (HNSCC) dimostra una ridotta infiltrazione granulocitica delle MDSC post-blocco PD-1/PD-L1.61 Non è chiaro se questo modello coinvolga diversi meccanismi di reclutamento delle MDSC o se il blocco diretto del PD{{40 }} sta inibendo la proliferazione delle MDSC. È stato dimostrato che l'antagonismo di PD-L1 nelle MDSC riduce la polarizzazione immunosoppressiva delle cellule T. Negli esperimenti di cocoltura, il trattamento delle MDSC con antiPD-L1 ha portato ad un aumento dei tassi di proliferazione delle cellule T e di produzione di IFN, che potrebbe essere il risultato di una ridotta produzione di IL6 e IL10.62 63 Gli studi discussi sopra evidenziano le sfumature e complesse effetti della terapia checkpoint sulle MDSC. Il blocco di PD-1/PD-L1 può migliorare i risultati attraverso un'inversione diretta dell'immunosoppressione correlata alle MDSC, guidando in modo sincrono la resistenza ai checkpoint attraverso il reclutamento delle MDSC.

Linfociti innati e blocco PD-1/PD-L1

Studi recenti hanno identificato i linfociti innati come nuovi bersagli degli inibitori del checkpoint.64 65 I linfociti innati sono divisi in due grandi rami: cellule natural killer (NK) e cellule linfoidi innate (ILC). Le ILC sono ulteriormente suddivise in ILC1, ILC2, ILC3 e cellule induttrici del tessuto linfoide (LTi).66 Le cellule NK rispecchiano funzionalmente le cellule T CD8+ perché mostrano attività citotossica antitumorale. In confronto, i sottoinsiemi ILC sono popolazioni residenti nei tessuti con ruoli analoghi ai sottoinsiemi di cellule CD4+ T helper (Th). Le ILC1 producono IFN- per controllare i patogeni intracellulari, le ILC2 producono IL-4, IL-5 e IL-13 per colpire i parassiti e le ILC3 secernono IL-17 e IL{{16 }} per difendersi da batteri e funghi extracellulari.67 Le cellule LTi sono fondamentali per la formazione di tessuti linfoidi secondari.67

cellule NK

I tumori solidi, come il carcinoma a cellule renali, possono essere fortemente infiltrati dalle cellule NK.66 Questi linfociti innati sono regolati da recettori attivanti e inibitori espressi costitutivamente, che riconoscono ligandi indotti dallo stress e vari motivi conservati su molecole MHC di classe I e non canoniche. .68 Esistono rapporti contrastanti sul fatto che le cellule NK esprimano livelli significativi di PD-1. Alcuni gruppi suggeriscono che né le cellule NK di topo né quelle umane esprimono la PD-1;69 tuttavia, altri gruppi hanno segnalato cellule NK che esprimono PD-1- in diversi tipi di cancro.70 È probabile che la PD-1 è espresso dalle cellule NK in determinate condizioni infiammatorie. Le cellule NK istruite dal tumore sovraregolano il PD-1 che, quando impegnato da PD-L1, attenua l'immunità antitumorale mediata dalle cellule NK. 71 Prove emergenti suggeriscono che il blocco PD-1/PD-L1 aumenta sia il reclutamento delle cellule NK che la citotossicità contro le cellule del mieloma multiplo.64 Inoltre, la terapia anti-PD-1 è in grado di innescare l'attivazione delle cellule NK e la produzione di IFN-. 72 Per complicare ulteriormente le cose, le cellule NK possono esprimere PD-L1, che induce una maggiore funzionalità antitumorale quando agonizzate.73 Studi in vivo suggeriscono che l'uso di antiPD-L1 non solo blocca l'impegno negativo del PD-1 sulle cellule NK ma anche attiva le cellule NK PD-L1+, portando ad un maggiore rigetto del tumore.73 Sebbene le cellule NK rappresentino probabilmente un ulteriore bersaglio del blocco PD-1/PD-L1, sono necessarie ulteriori ricerche per determinare se le cellule NK il blocco specifico PD-1/PD-L1 è clinicamente rilevante nei tumori solidi e se esiste un ruolo fisiologico per la segnalazione PD-L1 in queste cellule immunitarie innate.

Cellule linfoidi innate

Gli inibitori del checkpoint sono anche in grado di rimodellare le risposte dell'ILC in condizioni patologiche come il cancro.74 Mentre un'elevata espressione di PD-1 sui progenitori dell'ILC viene persa durante la differenziazione, i livelli di PD-1 possono essere sovraregolati in risposta a cellule tessuto-specifiche. spunti. PD-1 è sovraregolato nelle ILC2 residenti nei tessuti nel contesto dell'infiammazione polmonare.75 La deplezione delle ILC2 ad alto effettore PD1 riduce l'infiammazione durante l'esposizione all'influenza e agli allergeni.75 L'espressione di PD1 sulle ILC è rilevante anche per l'immunità antitumorale. Gli ILC2 infiltranti il ​​tumore (TILC2) sono predittivi della sopravvivenza a lungo termine nei pazienti con cancro del pancreas.76 I TILC2 esprimono livelli significativi di PD-1 e la densità di TILC2 aumenta dopo la terapia anti-PD-1. 76 In un modello ortotopico di cancro del pancreas, i TILC2 trasferiti adottivamente in ospiti carenti di ILC2- erano parzialmente responsabili della riduzione del carico tumorale post-terapia anti-PD-1.76 Oltre agli ILC2, gli ILC3 sono colpiti anche dalle terapie checkpoint. Gli ILC3 esprimono PD-1 nei tumori primari e metastatici,65 e l'asse PD-1/PD-L1 negli ILC3 regola la secrezione di citochine e la tolleranza immunitaria.77 Sebbene sia ancora nelle fasi iniziali, la ricerca sul ruolo di Gli ILC durante la terapia checkpoint rappresentano un nuovo campo promettente per l'immunoterapia antitumorale.

L'impatto del blocco CTLA-4 sulle cellule immunitarie innate

Sebbene l'espressione di CTLA-4 sia in gran parte limitata alle linee di cellule T e ad alcuni tumori, esistono numerosi effetti indiretti della terapia anti-CTLA-4 sui sottogruppi del sistema immunitario innato. Il blocco anti-CTLA-4 riduce il numero di MDSC infiltranti il ​​tumore e di TAM protumorigenici in un modello spontaneo di HNSCC.78 Inoltre, i pazienti con melanoma avanzato trattati con anti-CTLA-4 mostrano una diminuzione del numero di MDSC intratumorali con un'inversione dei loro profili tollerogenici.79 Come accennato in precedenza, Gubin et al hanno dimostrato la capacità del blocco dei checkpoint, inclusa la terapia anti-CTLA-4, di rimodellare il compartimento mieloide.10 Terapia anti-CTLA-4 polarizza indirettamente i TAM, in un processo dipendente dall'IFN- -, verso un fenotipo antitumorale caratterizzato dall'aumentata espressione di geni correlati a NF-κB.10 Da notare che una recente pubblicazione ha dimostrato che l'efficacia dell'anti-CTLA umano{{ 20}} era parzialmente attribuibile alla porzione Fc dell'anticorpo e alla sua affinità con i recettori Fc come CD32a, espressi da più sottogruppi innati.80 Il trattamento con anti-CTLA-4 ha portato alla deplezione di CTLA{{26} } che esprimono Treg, evidenziando un ruolo aggiuntivo dei sottoinsiemi innati responsabili della citotossicità cellulare anticorpo-dipendente durante il blocco del checkpoint.80 Tuttavia, questi effetti possono dipendere fortemente dalla classe IgG dell'anticorpo bersaglio CTLA-4. Esistono prove più limitate dell'impegno diretto del CTLA-4 sulle linee immunitarie innate. Sottogruppi di cellule NK infiltranti il ​​tumore esprimono CTLA-4 e CD28, ed è stato riscontrato che il blocco di CTLA-4 inibisce il rilascio di IFN da parte delle cellule NK in cocoltura con DC mature.81 In sintesi, come anti-PD1/ Terapie PD-L1, la terapia anti-CTLA-4 è in grado di indurre cambiamenti globali nei sottogruppi immunitari innati infiltranti il ​​tumore. Rapporti sull'espressione di CTLA-4 e CD28 nelle cellule NK infiltranti il ​​tumore suggeriscono che sono necessari ulteriori sforzi per valutare se gli effetti specifici delle cellule NK del blocco anti-CTLA-4 siano stati attribuiti erroneamente alle cellule T .

Cistanche pianta che aumenta il sistema immunitario

Inibitori emergenti dei checkpoint e loro impatto sulle cellule immunitarie innate

Il successo clinico delle terapie checkpoint mirate al PD-1/PD-L1 e al CTLA-4 ha stimolato un intenso interesse nell'identificazione di ulteriori recettori coinibitori e costimolatori come potenziali bersagli terapeutici. Dopo PD-1 e CTLA-4, il gene di attivazione dei linfociti 3 (LAG3) è stato il terzo recettore inibitorio ad essere clinicamente mirato.82 Nelle linee linfoidi, LAG3 è altamente espresso nelle cellule T attivate, Treg e Cellule NK.82 Nei sottogruppi mieloidi, LAG3 si trova nelle DC plasmacitoidi (pDC), che sono fondamentali per l'attivazione delle risposte antivirali,83 e nei TAM in alcune condizioni specifiche del cancro, come il linfoma a cellule B.84 È interessante notare che LAG{{ 17}}topi null hanno un numero maggiore di macrofagi, granulociti e pDC; quindi, il recettore può svolgere un ruolo nella regolazione dell'ematopoiesi.83 Una popolazione di Treg che coesprimono LAG3 e la molecola contenente immunoglobulina e mucina delle cellule T-3 (TIM3) sopprime l'attivazione proinfiammatoria dei macrofagi,85 suggerendo che il blocco di LAG3 potrebbe creare sinergia con gli effetti indiretti delle terapie anti-PD-1/PD-L1 e/o anti-CTLA-4, che spostano il fenotipo TAM verso uno stato antitumorale. Nonostante il noto ruolo immunosoppressivo di LAG3 nelle cellule T, la ricerca sulla regolazione dei sottoinsiemi mieloidi da parte di LAG3 è ancora limitata.

Come LAG3, il recettore immunorecettore delle cellule T con domini Ig e ITIM (TIGIT) è un recettore coinibitore espresso principalmente nelle cellule T e nelle cellule NK. TIGIT interagisce con una varietà di molecole simili alla nectina espresse nelle APC e in vari tumori, portando a un'alterata proliferazione delle cellule T e NK e alla produzione di IFN.86 È interessante notare che la soppressione delle cellule NK mediata dalle MDSC può essere parzialmente dipendente da TIGIT poiché un anticorpo anti-TIGIT è stato in grado di invertire la disfunzione delle cellule NK negli esperimenti di cocoltura di MDSC.87 Il meccanismo alla base di questa scoperta può comportare una diminuzione dell'espressione di Arg1 nelle MDSC, come è stato riportato nel contesto delle cellule T.88 Come con PD{{16 }} topi null, i topi TIGIT null hanno ridotto la crescita del tumore in vari modelli di cancro,89 e le cellule NK isolate da questi topi dimostrano una maggiore secrezione di IFN-y quando attivate dalle cellule bersaglio.90 Sono necessarie ulteriori ricerche per valutare gli effetti indiretti degli anti -Blocco TIGIT sui sottoinsiemi mieloidi. A differenza di TIGIT e LAG3, TIM3 è ampiamente espresso e regola direttamente sia i sottoinsiemi immunitari innati che quelli adattativi.91 Nello specifico, TIM3 si trova nelle cellule T, nelle cellule NK, nei macrofagi, nei TAM, nelle DC e nei mastociti.91 L'agonismo di TIM3 riduce la segnalazione infiammatoria in entrambi tipi di cellule adattative e innate e, come tale, è un bersaglio attraente per future immunoterapie.92 Nelle cellule T, il blocco di TIM3 aumenta la proliferazione di Th1 e la produzione di IFN.93 Risultati recenti evidenziano che la citotossicità delle cellule NK è attenuata anche dall'espressione di TIM3, che può svolgono un ruolo nella tolleranza materno-fetale.91 Nei macrofagi, la segnalazione TIM3 smorza l'infiammazione e limita la capacità fagocitaria.91 Inoltre, il blocco di TIM3 riduce il reclutamento delle MDSC e rallenta la crescita del tumore in un modello di HNSCC.94 All'interno della linea DC, TIM3 è espresso principalmente dalle DC CD8+ /CD103+, che sono specializzate per innescare le risposte delle cellule T CD8+ attraverso la presentazione incrociata.91 Il risultato della segnalazione TIM3 nelle DC è vario e può avere entrambi effetti immunosoppressori e protumorigeni. Il trattamento di una linea cellulare DC con lipopolisaccaride e il ligando TIM3 galectina-9 ha aumentato significativamente la produzione di TNF.95 Tuttavia, è stato anche dimostrato che TIM3 smorza l'infiammazione interferendo con l'impegno dei TLR specifici del DNA.96 Il blocco di TIM3 migliora l'azione antitumorale Interazione tra cellule DC-T migliorando la presentazione incrociata da parte delle DC CD103+,91 e aumentando l'espressione DC di CXCL9, un chemiotattico delle cellule T.97 È interessante notare che, in un modello di fibrosarcoma, le DC erano necessarie per l'anti-TIM{{61 }}miglioramento dell'efficacia della chemioterapia. Questi risultati suggeriscono che TIM3 può inibire l'attivazione delle DC, la presentazione dell'antigene e la diafonia delle DC nel contesto della morte cellulare immunogenica indotta dalla chemioterapia.96 Nel loro insieme, l'ampia espressione di TIM3 nei sottogruppi innati e adattativi e il suo ruolo dimostrato nella diafonia tra i due , evidenziano TIM3 come un promettente bersaglio immunoterapeutico. L’emergere di nuovi recettori coinibitori richiederà un’attenta valutazione di quali obiettivi sinergizzano con le terapie checkpoint esistenti e migliorano ampiamente l’immunità antitumorale sia nei compartimenti innati che in quelli adattivi.

CONCLUSIONI

Gli studi evidenziati in questa revisione dipingono un quadro complesso della relazione tra il blocco dei checkpoint e l’immunità innata. Le cellule mieloidi e i linfociti innati contribuiscono sia all’efficacia che alla resistenza del checkpoint, attraverso meccanismi sia diretti che indiretti. La sfida per ricercatori e medici è bilanciare gli effetti vari, e talvolta opposti, delle terapie checkpoint, in modo che possano impiegare e combinare in modo intelligente le immunoterapie nella lotta contro il cancro. Spostare il focus del blocco dei checkpoint dal “centrismo delle cellule T” a una visione più olistica della TME complessa e interconnessa può rivelare nuove opportunità per ampliare i benefici del blocco dei checkpoint ai numerosi pazienti che necessitano di terapie che alterano la prognosi.

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