Uno studio quantitativo sulla proteomica svela la via del fibrinogeno nella malattia del fegato policistico Ⅱ
Nov 22, 2023
3. Risultati
3.1. Rene e fegato non seguono gli stessi meccanismi cistici
Studi precedenti hanno dimostrato che l’inattivazione precoce del gene Pkd1 (prima di p12) innesca un rapido sviluppo della malattia policistica (finestra cistica), mentre l’inattivazione dopo p14 porta alla formazione tardiva di cisti dopo 4-5 mesi, con un fenotipo lieve (finestra non cistica). [19]. Utilizzando lo stesso modello ortologo di ADPKD (Pkd1cond/cond; Tam-Cre) [18,19], abbiamo studiato se questa finestra di sviluppo renale corrispondesse nel tempo con una finestra simile di sviluppo epatico. Per tracciare un confronto diretto con i nostri studi precedenti [37], i topi sono stati indotti con tamoxifene a inattivare il gene Pkd1 nei giorni postnatali 14 (p14) e 12 (p12) e sacrificati all'età di 30 giorni (p30). È interessante notare che abbiamo osservato un fenotipo cistico in entrambi i momenti con un diverso grado di malattia (lieve e grave), suggerendo che il rene e il fegato hanno finestre di sviluppo cistico indipendenti (Figura 1a) e/o possibili tempi e progressioni diversi della malattia . Non sono state riscontrate differenze tra maschi e femmine a questa età di macellazione tra entrambe le finestre di inattivazione (è stato utilizzato n=6 per ciascun gruppo di mutanti). Gli animali mutanti p14 presentavano un fenotipo più lieve rispetto al gruppo mutante p12 con valori più bassi di indice cistico, numero di cisti e funzionalità epatica in base al valore sierico ALP (Figura 1b-d). Questo è il primo studio che mostra diverse finestre/meccanismi di sviluppo per il deficit epatico e renale Pkd1. Tali differenze molecolari dovranno essere determinate in studi futuri.
Figura 1. Caratterizzazione del fenotipo del fegato cistico al giorno 30 dagli stadi p12 e p14. La delezione di Pkd1 in p12 comporta una cistogenesi più grave. (a) Immagini macroscopiche e microscopiche rappresentative di ematossilina-eosina colorate da fegati di Pkd1cond/cond; topo Tam-Cre Wild Type (WT, Pkd1cond/cond; Tam-Cre−) e mutante (KO, Pkd1cond/cond; Tam-Cre+ ) con delezione del gene Pkd1 indotta da tamoxifene al giorno 14 (gruppo p14) e 12 (gruppo p12) postnatale. Tutti i topi sono stati sacrificati a p30. Barra della scala, 2 mm (pannello superiore) 100 µm (pannello inferiore). n rappresenta il numero di campioni per gruppo e Bd significa dotto biliare. (b, c) Indice cistico epatico e numero di cisti dei diversi fenotipi. (d, e) Valori ALP e ALT nel siero del sangue. Le barre rappresentano le medie ± SEM in tutti i casi. p < 0,05 mediante il test t di Student (a due code) è stato considerato un risultato significativo. ns rappresenta non significato. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
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3.2. Analisi proteomica Shotgun e SWATH-MS in PLD
Come indicato nella Figura 2, abbiamo eseguito analisi differenziali del proteoma in entrambi gli stadi cistici (p12—malattia cistica grave e p14—malattia cistica lieve) dei mutanti (KO) rispetto agli animali Wild Type (WT), al fine di identificare e caratterizzare i meccanismi molecolari rilevanti sottoposti a cistogenesi epatica e progressione della malattia.
Figura 2. Schema di flusso di lavoro illustrato. Abbiamo utilizzato un modello murino di ADPKD (topi Pkd1cond/cond; Tam-Cre) in cui l'inattivazione genetica di Pkd1 è stata indotta dalla somministrazione di tamoxifene al giorno 10 postnatale (p10) e p11 (progressione rapida della malattia) o p15 e p16 (progressione ritardata della malattia). ) in base al cambio di sviluppo della cistogenesi renale, definendo i due gruppi dello studio denominati rispettivamente p12 e p14 [19]. Per entrambi i gruppi, abbiamo utilizzato un n uguale o maggiore di sei individui wild-type (WT) e mutanti (KO) in ciascuna condizione e tutti gli animali sono stati sacrificati a p30. Abbiamo studiato il proteoma differenziale dei fegati WT e KO in entrambe le gravità della malattia cistica epatica (Figura 1), utilizzando sia l'analisi SWATH-MS proteomica quantitativa che l'analisi DDA-MS di acquisizione dipendente dai dati shotgun. Delle proteine con un cambiamento significativo nell'abbondanza, abbiamo utilizzato la bioinformatica Figura 2. Schema di flusso di lavoro illustrato. Abbiamo utilizzato un modello murino di ADPKD (topi Pkd1cond/cond;Tam-Cre) in cui l'inattivazione genetica di Pkd1 è stata indotta dalla somministrazione di tamoxifene al giorno 10 postnatale (p10) e p11 (progressione rapida della malattia) o p15 e p16 (progressione ritardata della malattia ) in base al cambio di sviluppo della cistogenesi renale, definendo i due gruppi dello studio denominati rispettivamente p12 e p14 [19]. Per entrambi i gruppi, abbiamo utilizzato un numero pari o superiore a sei individui Wild Type (WT) e Mutant (KO) in ciascuna condizione e tutti gli animali sono stati sacrificati a p30. Abbiamo studiato il proteoma differenziale dei fegati WT e KO in entrambe le gravità della malattia cistica epatica (Figura 1), utilizzando sia l'analisi SWATH-MS proteomica quantitativa che l'analisi DDA-MS di acquisizione dipendente dai dati del fucile. Delle proteine con un cambiamento significativo nell'abbondanza, abbiamo utilizzato strumenti bioinformatici per individuare nuovi bersagli terapeutici e percorsi coinvolti nella malattia. Infine, abbiamo convalidato tali obiettivi utilizzando prima strategie in silico (analisi DDA vs SWATH) e infine in vivo, nonché RT-qPCR, Western blotting e immunoistochimica. p significa giorno postnatale
Modello di espressione proteica nella cistogenesi epatica Innanzitutto, abbiamo eseguito l'analisi della spettrometria di massa proteomica mediante acquisizione dipendente dai dati DDA-MS o DDA. Questa analisi consente di caratterizzare il proteoma da campioni completi e individuali, fornendo la presenza/assenza di proteine con elevata sensibilità ma senza fornire la loro quantificazione. Abbiamo considerato esclusivamente tutte le proteine espresse in modo differenziale in più di cinque campioni indipendenti da un totale di sei campioni, rispettivamente per gli stadi p14 e p12 degli individui Wild Type e mutanti (Figura S1). A p14, sono state identificate 1 proteina esclusiva WT (o sottoregolata per la malattia) e 7 proteine esclusive MUT (up-regolate), mentre a p12 sono state osservate otto proteine esclusive WT e sei esclusive MUT (Figura S1).
Successivamente, abbiamo utilizzato un metodo che ci ha permesso di quantificare le proteine espresse in modo differenziale. Abbiamo eseguito un'analisi proteomica quantitativa SWATH-MS sugli stessi campioni che abbiamo utilizzato per la DDA, ottenendo circa 1500 proteine per campione e più di 2000 proteine in ciascun gruppo di studio. Innanzitutto, abbiamo eseguito la normalizzazione della somma dell'area totale (TAS) per valutare che i nostri campioni seguissero un modello di distribuzione normale, come mostrato nelle Figure S2 e S3. Successivamente, abbiamo studiato la proteina con differenze significative tra i gruppi Wild Type e Mutant. La tabella 1 mostra le proteine con un cambiamento significativo nell'abbondanza con un aumento di due volte (up-regolato) o una diminuzione (down-regolato) e un valore p aggiustato significativo (secondo il test t di Student parametrico) in WT vs Campioni MUT a p14 e p12. In totale, sei proteine hanno mostrato differenze significative nell'abbondanza proteica tra i gruppi WT p14 e MUT-p14 (cinque proteine sovraregolate e una proteina sottoregolata). Tra WT-p12 e MUT-p12, 26 proteine (20 proteine sovraregolate e 6 proteine sottoregolate) hanno mostrato differenze significative (Figura 3a e Tabella 1). Graficamente, queste variazioni possono essere osservate attraverso i diagrammi dei vulcani, che sono stati generati tracciando i cambiamenti di log(2) per tutte le proteine identificate rispetto al loro valore p -log(10) (Figura 3b). Differenze significative tra i livelli di abbondanza delle proteine possono essere visualizzate nella mappa termica con valori individualizzati in base alle aree della libreria spettrale e il suo livello di clustering nell'analisi della mappa termica del cluster (Figure 3c e S4). Questi cluster rilevati dall'analisi SWATH-MS ci aiutano a identificare quei campioni qualitativamente separati, da considerare per l'analisi quantitativa (Figura S5). È stata eseguita un'analisi statistica multivariata senza supervisione utilizzando l'analisi delle componenti principali (PCA) per confrontare i dati tra i campioni (Figura S6). La mappa termica e i dati PCA hanno dimostrato la riproducibilità tra i triplicati del campione poiché i tre replicati erano strettamente raggruppati in entrambe le analisi. Possiamo osservare sia nella PCA che nell'analisi dei cluster della mappa termica (figure S5 e S6) come alcuni campioni non si sono raggruppati correttamente, sovrapponendosi tra entrambi i cluster. Tuttavia, possiamo vedere la tendenza a separare i dati nei cluster Wild Type e Mutant. Il numero inferiore di proteine con differenze significative in p14 rispetto a p12 potrebbe essere giustificato dal diverso grado di gravità (Figura 2), suggerendo che il numero di proteine e percorsi aumenta in base alla gravità e allo stato della malattia del fenotipo cistico.
3.3. Clustering, arricchimento del percorso e analisi dell'interazione proteina-proteina dell'espressione genica nel PLD
Per stabilire la funzione correlata alle proteine differenzialmente espresse identificate dall'analisi SWATH-MS, abbiamo utilizzato diversi strumenti bioinformatici e forme di analisi. Le analisi dei termini e dei percorsi di Gene Ontology (GO) sono state eseguite utilizzando FunRich [39,40], String [41] e Reactome [42]. Le proteine sono state selezionate nell'analisi di arricchimento genico FunRich. Per quanto riguarda il processo biologico, il gruppo più arricchito di proteine per il gruppo p14 (cistico lieve) era correlato al trasporto degli acidi grassi e alla biosintesi delle prostaglandine, e per il gruppo p12 (cistico grave) con attività fibrinogeno/fibrina, adesione cellula-cellula/matrice e attività metabolica. processo (Figura 4a, pannello superiore). L'ANXA2 e il complesso del fibrinogeno erano i due componenti cellulari più arricchiti rispettivamente nei gruppi p14 e p12. Inoltre, lo spazio extracellulare era la componente cellulare con la più alta percentuale di proteine in entrambi i gruppi (Figura 4a, pannello inferiore). Allo stesso modo, la stessa analisi è stata stabilita con l'analisi delle stringhe, identificando diversi processi metabolici come il principale processo biologico e lo spazio extracellulare come la componente cellulare più arricchita; coerente con i risultati GO (Figura S7a). Infine, abbiamo ripetuto l'analisi con la piattaforma Reactome, scoprendo che il metabolismo e il sistema immunitario erano i percorsi più arricchiti (Figura S7b).
È stata inoltre eseguita l'analisi proteina-proteina o cluster basata sull'analisi di stringa al fine di indagare le possibili interazioni proteina-proteina (interazioni con evidenze sperimentali). Numerose interazioni proteiche sono state identificate in diversi gruppi (Figura S8), ma un cluster in p14 e un altro in p12 erano i più rilevanti in base al numero di interazioni tra proteine e al livello di espressione (Figura 4b). Il cluster p14- contiene la proteina annessina A2 (ANXA2_P07356) associata a diverse funzioni cellulari, come la fibrinolisi, la motilità cellulare (nelle cellule epiteliali), una proteina correlata all'actina interazioni citoscheletro e cellula-matrice [43], interagendo con altre due proteine coinvolte nel trasporto dei lipidi intracellulari (FABP1_P12710 e FABP5_Q05816). È interessante notare che un altro gruppo rilevante di proteine è stato identificato nel cluster p12-con un'interazione proteina-proteina molto forte tra diversi fibrinogeni (FGL1_Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{{22 }}E9PV24 e FIBGG_Q8VCM7). I fibrinogeni sono coinvolti nella crescita degli epatociti e mediano la diffusione delle piastrine nel sangue, il collagene interstiziale e le lesioni fibrotiche [44]. Inoltre, è stato scoperto che ulteriori proteine interagiscono con i fibrinogeni (Figura S8), come il componente p dell'amiloide sierica (SAMP_P12246), l'emopexina (HEMO_Q91X72) o l'idrossiacido ossidasi 2 (HAOX{ {37}}Q9NYQ2). Coerentemente con i risultati delle stringhe, i complessi ANXA2 e fibrinogeno erano anche i componenti cellulari più arricchiti identificati dall'analisi FunRich (Figura 4a). È interessante notare che, confrontando i dati ottenuti dall'analisi DDA e SWATH, abbiamo confermato che diverse proteine identificate da SWATH sono state identificate anche dall'analisi DDA, comprese diverse correlate alle proteine del complesso del fibrinogeno (SAMP/Apcs e S10A9/S100a9; Tabella S3).
3.4. La validazione dell'analisi SWATH-MS smaschera il complesso del fibrinogeno come nuovo meccanismo molecolare correlato al PLD
Sulla base di questi dati, abbiamo selezionato dall'analisi SWATH-MS (Figura S9) le proteine alterate correlate al complesso del fibrinogeno agli stadi p12 e p14 per la validazione in vivo con RT-qPCR, Western blotting e immunoistochimica, per stabilirne la possibile conferma bersagli della malattia. Otto su 10 di queste proteine selezionate sono state convalidate a livello di mRNA mediante RT-qPCR (Figura 5); uno sovraregolato allo stadio 14- (ANXA2_P07356) e al gruppo p12-(SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{ 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO_Q91X72, FIBA_E9PV24 e FIBG_Q8VCM7) e uno in basso- regolato nel gruppo p12 (HAOX2_Q9NYQ2). È interessante notare che l'espressione genica delle due proteine con più o meno interazioni con il gruppo fibrinogeno (ILK e S10A9) erano le uniche a non essere convalidate (Figura 5c).
La sovraregolazione del complesso del fibrinogeno (proteine ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG e HAOX2) è stata ulteriormente confermata dall'analisi Western blotting (WB) (Figura 6). Nel complesso, l'espressione genica e il WB erano altamente coerenti con i dati proteomici SWATH-MS. Infine, abbiamo anche eseguito la validazione immunoistochimica del complesso del fibrinogeno in campioni di fegato mutante e policistico (Figura 7). La colorazione del fibrinogeno era fortemente sovraregolata nelle cellule epiteliali del rivestimento delle cisti e nelle dilatazioni dei dotti biliari (Figura 7a). Questi risultati smascherano, per la prima volta, il complesso del fibrinogeno come possibile via correlata alla cistogenesi epatica e come possibile futuro bersaglio terapeutico per la PLD.
Figura 5. Convalida di possibili obiettivi PLD mediante RT-qPCR. L'espressione genica di 8 su 10 target selezionati era correlata ai dati SWATH-MS. RT-qPCR di annessina A2 bersaglio p14 selezionata sovraregolata (Anxa2) (a); p12 sovraregolato prende di mira la componente amiloide p, il siero (Apcs, gene SAMP), il fibrinogeno-simile 1 (Fgl1), la catena beta del fibrinogeno (Fgb), l'emopexina (Hpx), la catena alfa del fibrinogeno (Fga), la catena gamma del fibrinogeno (Fgg) (b), chinasi legata all'integrina (Ilk) e S10{{30}} proteina legante il calcio A9 (S100a9) (c); e p12 target idrossiacido ossidasi 2 (Hao2) (d) sottoregolato. n=6 è stato utilizzato per ciascun gruppo proteico. Gapdh è stato utilizzato come gene domestico. Le barre rappresentano le medie ± SEM. È stato utilizzato il test t di Student a due code ed è stato considerato significativo un valore di p < 0,05. ns: non significativo (p maggiore o uguale a 0,05), * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Figura 7. Il complesso del fibrinogeno è sovraregolato negli epiteli cistici. (a, b) Immagini rappresentative dell'immunoistochimica del fibrinogeno nel dotto biliare (pannello superiore) e nel parenchima epatico (pannello inferiore) (a) e sua quantificazione (b). n=6 è stato utilizzato per ciascun gruppo. L'analisi immunoistochimica ha mostrato una sovraregolazione del fibrinogeno attraverso gli epiteli cistici. I campioni corrispondevano al gruppo p12. Le barre della scala rappresentano 100 µm. Bd significa dotto biliare. Le barre rappresentano le medie ± SEM. È stato utilizzato il test t di Student a due code ed è stato considerato significativo un valore di p < 0,05. *** p<0,001.
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