Recupero delle cellule immunitarie innate e alterazioni persistenti dell'immunità adattativa nel sangue periferico di donatori di plasma convalescenti a otto mesi dall'infezione da SARS-CoV-2 Parte 1

Astratto:

Alterazioni persistenti e firme immunitarie uniche sono state precedentemente rilevate nel sangue periferico di donatori di plasma convalescente (CP) circa due mesi dopo l'infezione iniziale da SARS-CoV-2. Questo articolo presenta i risultati dell'analisi sequenziale di 47 donatori di CP a un tempo mediano di otto mesi (intervallo 7,5-8,5 mesi) dopo l'infezione, valutati mediante citometria a flusso.

Con lo scoppio della nuova epidemia di polmonite coronarica, sempre più persone hanno iniziato a prestare attenzione all'impatto del plasma convalescente sull'immunità. Il plasma convalescente è attualmente un mezzo efficace per trattare la nuova polmonite coronarica. Può migliorare l'immunità dei pazienti, migliorare la resistenza del corpo e aiutare i pazienti a riprendersi il prima possibile.

Il plasma convalescente è una sostanza estratta dal plasma di pazienti guariti con nuova polmonite coronarica, che contiene un gran numero di anticorpi e cellule immunitarie, che possono aiutare il sistema immunitario a riconoscere e attaccare il virus, svolgendo quindi un ruolo antivirale. Pertanto, il plasma convalescente può migliorare l'immunità in una certa misura e aumentare la resistenza del corpo.

Al momento, molti ospedali hanno iniziato a utilizzare il plasma convalescente per trattare i pazienti con nuova polmonite coronarica e hanno ottenuto alcuni effetti curativi. Gli studi hanno dimostrato che la terapia al plasma convalescente può ridurre notevolmente il tempo di ospedalizzazione dei pazienti, alleviare la condizione e ridurre il tasso di mortalità. Pertanto, dovremmo sostenere attivamente e partecipare al trattamento del plasma convalescente per aiutare più pazienti a riprendersi il prima possibile.

Inoltre, nella vita quotidiana, dobbiamo anche prestare attenzione al rafforzamento della nostra immunità per prevenire l'insorgenza di malattie come la nuova polmonite coronarica. Ad esempio, presta attenzione a una dieta equilibrata e mangia cibi più nutrienti come verdure, frutta e pesce; rafforzare l'esercizio per migliorare la forma fisica e l'immunità; prestare attenzione all'igiene, lavarsi spesso le mani e ridurre il rischio di infezione.

In breve, il plasma convalescente ha un impatto positivo sull'immunità, che può aumentare in una certa misura la resistenza del corpo e aiutare i pazienti a riprendersi il prima possibile. Dovremmo sostenere e partecipare attivamente al trattamento del plasma convalescente e prestare attenzione all'assistenza sanitaria nella vita quotidiana in modo che i nostri corpi siano più sani e pieni di vitalità! Quindi, in sintesi, dobbiamo migliorare la nostra immunità. Cistanche può migliorare significativamente l'immunità perché i polisaccaridi nella carne possono regolare la risposta immunitaria del sistema immunitario umano, migliorare la capacità di stress delle cellule immunitarie e rafforzare l'effetto battericida delle cellule immunitarie.

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È interessante notare che i nostri risultati mostrano una variazione significativa nella composizione del sottogruppo immunitario pertinente tra i donatori di CP. Per quanto riguarda l'immunità innata, sia i monociti non classici che i granulociti CD11b si erano completamente ripresi otto mesi dopo l'infezione da COVID-19. I monociti intermedi e le cellule natural killer (NK) erano già stati ripristinati alla valutazione di due mesi e sono rimasti stabili. Per quanto riguarda l'immunità adattativa, la polarizzazione distorta delle cellule Th1 e Th2 correlata al COVID-19-è rimasta agli stessi livelli di due mesi. Tuttavia, sono stati rilevati bassi livelli di cellule B totali anche dopo otto mesi di infezione.

Anche una riduzione persistente di CD8 più Treg e cambiamenti nel compartimento delle cellule NKT sono stati notevoli. I donatori CP presentano un panorama immunitario unico a otto mesi dall'infezione post-COVID-19, che è caratterizzato dal notevole ripristino dei componenti dell'immunità innata insieme a un'impronta persistente di SARS-CoV-2 nelle cellule dell'immunità adattativa.

Parole chiave:

SARS-CoV-2; COVID-19; donatori di plasma di convalescenza; profilazione immunitaria; ripristino immunitario; 8 mesi.

1. Introduzione

La malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) è causata dalla trasmissione aerea potenzialmente fatale e altamente contagiosa della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARSCoV-2). La gravità del COVID-19 varia ampiamente tra le persone infette, da casi completamente asintomatici [1], a condizioni più lievi con febbre, tosse e stanchezza e a casi più gravi affetti da polmonite che porta alla sindrome da distress respiratorio acuto e insufficienza multiorgano sfrenata, che sono spesso fatali [2].

I casi sintomatici di COVID-19 sono caratterizzati da una risposta immunitaria iperinfiammatoria sistemica e ora vi sono ampie prove che le variazioni nella gravità dei sintomi a seguito dell'infezione da SARS-CoV-2 sono direttamente correlate alla precedente stato immunitario dell'ospite [3-5]. Fattori correlati a profili immunitari immunocompromessi più disfunzionali e, di conseguenza, a un rischio più elevato di mortalità, tra cui l'aumento dell'età e alcune condizioni mediche croniche sottostanti, come il diabete di tipo 2, la cardiomiopatia, l'obesità, la broncopneumopatia cronica ostruttiva e la malattia renale cronica [6,7] .
Ricerche approfondite su COVID-19 hanno rivelato informazioni importanti sulle cascate immunitarie e su particolari cambiamenti in vari sottoinsiemi immunitari che accompagnano l'infezione da SARS-CoV-2 [3,4,8,9]. Tuttavia, ci sono ancora informazioni limitate riguardo alle alterazioni che possono persistere nel sistema immunitario dell'ospite nel tempo dopo la completa risoluzione dell'infezione.

Recentemente, è stato dimostrato che componenti distinti della memoria immunologica per SARS-CoV-2 possono avere cinetiche diverse nel tempo [9,10]. Ad esempio, la memoria anti-SARS-CoV-2 e le cellule T citotossiche sembrano diminuire più rapidamente rispetto all'immunità delle cellule B, mentre sia le cellule B di memoria che i livelli di immunoglobulina (Ig)G contro la proteina spike di SARS-CoV{ {8}} persistono per almeno sei mesi dopo l'insorgenza di COVID-19 [10].

In una coorte diversa, Breton et al. hanno mostrato che le cellule T CD4 plus e CD8 plus della memoria centrale diminuivano, ma le cellule T antigene-specifiche persistevano sei mesi dopo l'infezione [11]. Per quanto riguarda le cellule dell'immunità innata, il loro profilo sembra essere dipendente dall'età e sono state osservate alterazioni nei monociti e nei neutrofili fino a ca. due mesi dopo l'infezione [12].

Recentemente abbiamo anche segnalato particolari alterazioni persistenti e firme immunitarie uniche nel sangue periferico (PB) di donatori di plasma convalescente (CP) a circa due mesi dall'infezione iniziale da SARS-CoV-2. Queste firme immunitarie erano correlate sia con la capacità dei pazienti di attivare una risposta umorale protettiva, cioè di produrre anticorpi anti-SARS-CoV-2 IgG e/o IgA sufficienti e rilevabili, ma anche con la gravità dei sintomi riscontrati , con donatori di CP precedentemente ospedalizzati che sono meno immunocompetenti rispetto ai donatori di CP che hanno manifestato sintomi più lievi [13].
Seguendo lo stesso approccio e per esplorare le impronte a lungo termine sul profilo immunitario dei donatori di CP recuperati da COVID-19-, presentiamo qui i risultati dell'analisi sequenziale di 47 donatori di CP in un tempo mediano di otto mesi (intervallo 7,5– 8,5 mesi) post-infezione.

2. Materiali e metodi

2.1. Selezione dei partecipanti

Il presente rapporto include test sequenziali di donatori di CP che hanno partecipato a uno studio di fase 2 (NCT04408209) e hanno fornito campioni PB accoppiati per analizzare il loro profilo immunitario a due e otto mesi, dopo l'infezione da SARS-CoV-2. Tutti i partecipanti erano stati infettati da SARS-CoV-2 e sono stati diagnosticati dopo tamponi nasofaringei e/o orofaringei positivi con RT-qPCR, come precedentemente descritto [14].

Prima della donazione di CP, avevano due test PCR negativi con un intervallo di almeno sette giorni. Il secondo test negativo è stato eseguito 1-7 giorni prima della plasmaferesi. Hanno anche sviluppato anticorpi IgG anti-SARS-CoV-2 rilevabili contro la proteina spike domain 1 (S1) di SARS-CoV-2 se esaminati con un enzima sensibile disponibile in commercio e approvato dalla Food and Drug Administration -linked immunosorbent assay (Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG, Lubecca, Germania), descritto in dettaglio in precedenza [14].

I criteri di inclusione includevano anche almeno 14 giorni dopo un completo recupero dall'infezione da SARS-CoV-2 (nessun sintomo, risoluzione completa della disfunzione d'organo causata da SARS-CoV-2), donatori maschi senza storia di trasfusione , e donne senza una storia di trasfusione o gravidanza, un emocromo completo normale, test sierologici negativi per virus dell'epatite B (HBV), virus dell'epatite C (HCV), virus dell'immunodeficienza umana (HIV), laboratorio di ricerca sulle malattie veneree (VDRL), virus linfotropico delle cellule T umane (HTLV)-1 e negativi per HIV, HBV, HCV con test di amplificazione dell'acido nucleico, e i donatori soddisfacevano tutti i criteri generali per la donazione di sangue in termini di età, condizioni generali, livelli di emoglobina e vitali segni.

Sono stati inoltre valutati e utilizzati come controlli normali dieci individui sani con età (mediana 47 anni, intervallo da 45 a 73 anni) e sesso (6 maschi/4 femmine) simili. Questi soggetti non presentavano problemi di salute noti e avevano un test PCR negativo per SARS-CoV-2 dai tamponi rinofaringei al momento del prelievo di sangue.

Tutti i partecipanti sono stati informati di questo studio e hanno fornito il consenso informato firmato secondo la dichiarazione di Helsinki e il comitato etico locale.

Tutte le procedure dello studio sono state eseguite dalla dichiarazione di Helsinki (18a Assemblea dell'Associazione Mondiale dei Medici), i suoi successivi emendamenti, le linee guida del regolamento greco, nonché le linee guida della Buona Pratica Clinica (GCP) definite dalla Conferenza Internazionale di Armonizzazione. Il protocollo è stato approvato dal comitato etico dell'ospedale generale "Alexandra", Atene, Grecia (rif. n. 245/16 aprile 2020).

2.2. Analisi di citometria a flusso

I campioni di PB sono stati raccolti in provette per la raccolta del sangue rivestite con EDTA (BD Vacutainer, BD Biosciences, San Jose, CA, USA; n. 367841) e sono stati elaborati entro un'ora dopo la raccolta seguendo il protocollo Stain-Lyse-no-Wash (BD Biosciences ). In particolare, per ogni campione di PB, 100 µL di sangue totale anticoagulato sono stati trasferiti in una provetta FACS in polistirene a fondo tondo da 12 × 75 mm e colorati con un pannello costituito da appropriati anticorpi anti-umani coniugati con fluoroforo contro i marcatori di superficie CD{{ 12}}PerCP, CD4-BV510, CD8-PE, CD14-BV605, CD16-APC, CD25-PECF594, CD{{21} }APCH7, CD56- APCR700, CD183-BV421, CD194-BV650, CD196-BB515 e CD11b-BV786 (tutti di BD Biosciences), a temperatura ambiente (RT ) per 20 min al riparo dalla luce. Inoltre, sono stati aggiunti 450 μL di soluzione di lisi FACS 1 × e le cellule sono state incubate per altri 10 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Tutti i campioni sono stati analizzati su un 3-laser BD FACSCelesta (BD Biosciences) e sono stati acquisiti 100000 eventi per campione.

Il 12-pannello a colori a cui si fa qui riferimento era costituito dal nostro pannello di riferimento per l'analisi fenotipica dei donatori di CP due mesi dopo l'infezione e ha consentito l'identificazione e l'analisi di 24 popolazioni immunitarie distinte, tra cui cellule B, CD3 più cellule T , cellule natural killer (NK), monociti, granulociti e loro sottoinsiemi seguendo la strategia di gating precedentemente descritta [13].

Per essere coerenti con le nostre precedenti analisi dei lotti, abbiamo seguito una regolare e ampia performance di set-up. L'impostazione del citometro è stata eseguita utilizzando cellule di controllo non colorate per la configurazione delle tensioni PMT appropriate e con BD CompBeads Set anti-mouse Igκ (BD Biosciences) per la compensazione dello spillover di fluorescenza intercanale. Inoltre, prima di ogni acquisizione è stata applicata una performance giornaliera di CS&T per verificare la condizione stabile del citometro.

Infine, è stato applicato quotidianamente un ulteriore passaggio di standardizzazione utilizzando perline arcobaleno (Spherotech Inc, Lake Forest, IL, USA) per verificare la stabilità del laser attraverso il controllo delle fluttuazioni PMT per rilevare le intensità fluorescenti mirate delle perline.

2.3. Analisi statistica

I dati sono stati analizzati utilizzando il software GraphPad Prism 8.0.2 (San Diego, CA, USA). I risultati sono espressi come media ± deviazione standard (SD). Per l'analisi statistica, è stato utilizzato un test t di Student per confrontare i controlli e i donatori di CP otto mesi dopo l'infezione da SARSCoV-2, mentre i cambiamenti nei donatori di CP a due e otto mesi dopo l'infezione sono stati confrontati utilizzando il test t di Student accoppiato. i valori p < 0.05 sono stati considerati statisticamente significativi.

3. Risultati

3.1. Caratteristiche dei donatori CP

La presente analisi ha incluso 47 donatori di CP con campioni PB accoppiati raccolti a una mediana di due e otto (intervallo 7,5-8,5) mesi dopo l'infezione da COVID-19. Le caratteristiche cliniche dei partecipanti sono presentate nella Tabella 1.

3.2. Il profilo immunitario a otto mesi dopo l'infezione da SARS-CoV-2 non è correlato alle caratteristiche cliniche dei donatori di CP

Coerentemente con la nostra precedente analisi a due mesi dall'infezione da SARS-CoV-2 [13], a otto mesi, abbiamo osservato una variazione significativa della composizione del sottogruppo immunitario pertinente tra i donatori di CP. Questa variazione ha superato le caratteristiche demografiche e cliniche della nostra coorte, in quanto non è stato possibile associare differenze significative con il sesso, l'età, il numero di sintomi riscontrati o i valori degli anticorpi sierici anti-SARS-CoV-2-specifici contro il virus S1 antigene.

Da notare che non sono state ottenute differenze significative nella profilazione immunitaria dei donatori di CP che erano stati precedentemente ricoverati in ospedale e di quelli che presentavano sintomi più lievi e non soddisfacevano i criteri per il ricovero in unità di terapia intensiva (ICU) (dati non mostrati). Pertanto, non abbiamo ulteriormente suddiviso i donatori di CP in più categorie nella nostra successiva analisi delle dinamiche della profilazione immunitaria nel tempo (Tabella 2).

3.3. Recupero dell'immunità innata a otto mesi dopo il COVID-19

Abbiamo ulteriormente valutato per valutare la dinamica di particolari profili immunitari confrontando le composizioni rilevanti dei vari sottogruppi immunitari nel tempo. L'analisi delle principali popolazioni immunitarie appartenenti ai bracci dell'immunità innata e adattativa e delle loro sottopopolazioni è presentata nelle Figure 1 e 2. In generale, i nostri risultati mostrano che entro otto mesi dall'infezione, la maggior parte dei sottoinsiemi di cellule immunitarie innate si è ripresa a livelli simili a quelli del gruppo di controllo, contrariamente alle cellule dell'immunità adattativa, in cui specifici sottoinsiemi di linfociti hanno mostrato evidenza di attivazione persistente a lungo termine.

Per quanto riguarda i sottoinsiemi di monociti, abbiamo precedentemente riportato un aumento di {{0}} volte dei monociti intermedi e un aumento di 2.2- volte del compartimento non classico (a scapito dei monociti classici) durante il malattia COVID-19 attiva [11]. Entro due mesi dall'infezione, i livelli di monociti intermedi e classici hanno mostrato evidenza di recupero e si erano praticamente completamente ripristinati entro otto mesi dall'infezione. Anche le percentuali di monociti non classici, che sono rimaste aumentate a due mesi dopo l'infezione (percentuale media: 1,16% contro 0,27% nel gruppo di controllo, p=0.01), si sono completamente riprese entro otto mesi e hanno raggiunto i livelli del gruppo di controllo.

Osservazioni simili sono state registrate per i granulociti. Sebbene la loro percentuale totale a otto mesi fosse leggermente ridotta rispetto ai controlli, a otto mesi dopo l'infezione, la prevalenza dei sottoinsiemi CD11b plus e CD11b- è diminuita e aumentata significativamente, rispettivamente, risultando in un rapporto CD11b plus/CD11b-granulociti simile a quello dei normali donatori sani, rispetto all'espansione deregolata dei granulociti alla valutazione di due mesi [13].

Per quanto riguarda le cellule NK, le nostre analisi non hanno mostrato alcuna fluttuazione significativa tra due e otto mesi, dopo l'infezione. Le percentuali delle cellule NK totali e dei loro sottoinsiemi sono state quasi ripristinate a due mesi dalla risoluzione della malattia dopo l'attivazione, e lo stesso profilo è stato osservato anche a otto mesi, con percentuali che rimanevano a livelli quasi normali.

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