Studio del meccanismo di tipo estrogenico dei glicosidi delle cistanche mediante metabolomica

introduzione

Gli estrogeni svolgono un ruolo importante in molti processi di sviluppo, fisiologici e correlati, compreso lo sviluppo dell’utero.1–3 Tuttavia, l’uso a lungo termine di estrogeni può avere molti effetti collaterali, come l’aumento del rischio di cancro al seno, cancro dell’endometrio e altri tumori ginecologici.4,5 Pertanto, i ricercatori si sono impegnati a cercare sostituti degli estrogeni che potrebbero evitare questi effetti collaterali, noti come modulatori selettivi dei recettori degli estrogeni, di cui i fitoestrogeni costituiscono una categoria importante.6 I composti fitoestrogeni si trovano naturalmente nelle piante con potenza estrogenica e possono legarsi ai recettori degli estrogeni per esercitare la loro attività. Pertanto, i fitoestrogeni potrebbero stimolare la crescita dell’utero combinandosi con gli abbondanti recettori degli estrogeni nell’utero, il che significa che il test uterotrofico potrebbe essere utilizzato per lo screening preliminare e la valutazione dei fitoestrogeni.

Cistanchedeserticola (CD), conosciuta come Rou Cong-Rong in Cina, è presumibilmente efficace per le funzioni di riproduzione, sviluppo e fertilità ed è stata utilizzata come tonico per più di 1800 anni.8,9 Recentemente, studi farmacologici hanno dimostrato che questa il tonico ha ampie funzioni medicinali, come ad esempioattività di regolazione ormonale, aperiente, immunomodulante, antiossidante, antiapoptotica, neuroprotettiva, antinocicettiva, antinfiammatoria, antifatica ed estrogenica.10 I glicosidi delle cistanche (GC) estratti dalla CD sono tra i principali componenti attivi e mostrano varie attività biologiche.11 Sebbene i costituenti attivi della CD siano stati chiariti in precedenza,12 il meccanismo di tipo estrogenico dei GC non è mai stato studiato.

CISTANCHE NATURALI TUBULOSA PER PREVENIRE L'OSTEOPOROSI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

In questo studio in corso, abbiamo mirato a confermare il possibile utilizzo dei GC come fitoestrogeni ed effettuare un'analisi metabolomica per esplorare il meccanismo di tipo estrogenico dei GC. Innanzitutto, sono stati utilizzati un test uterotrofico e un'analisi istologica per confermare l'attività estrogenica dei GC. Ancora più importante, ci siamo concentrati sui cambiamenti metabolici nel siero e nelle urine di ratto utilizzando l’analisi metabolomica basata su UPLC-MS/MS. A causa delle carenze della metabolomica non mirata, come la ripetibilità e la complicata influenza della matrice, è stato utilizzato uno pseudo metodo basato sulla modalità MRM per monitorare specificamente i metaboliti e gli indici (inclusi metabolismo energetico, stress ossidativo, metabolismo lipidico e metabolismo amminico) correlato agli effetti estrogenici, alla crescita e allo sviluppo è stato selezionato come biomarcatori per il rilevamento. I nostri risultati fanno luce sul meccanismo di tipo estrogenico dei GC, che aiuterà lo sviluppo e l’utilizzo dei GC.

Sperimentale

Reagenti

L-leucina, L-chinurenina, L-triptofano, 5-HTP, acido colico, Nfenilacetilglicina, 5-HT, glutatione (GSH) e 2,4-dinitrofenilidrazina ($99.{{ 8}}%, HPLC) sono stati acquistati da Dalian Melone Biology Technology Co. (Dalian, Cina). N-etilmaleimide ($98%, HPLC), L-glutatione ossidato (GSSG, $98%, HPLC) e 1,1,3,3-tetraetossipropano (TEP) sono stati acquistati da Sigma (Madrid, Spagna). La L-fenilalanina (Ring-D5, 98%, DLM-1258-5) è stata acquistata dai laboratori di isotopi di Cambridge (MA, USA). Metanolo e acetonitrile di grado MS sono stati acquistati da ACS (Houston, USA). Dietilstilbestrolo (purezza, $ 99,0%), acido formico, acido acetico glaciale ed ematossilina ed eosina (H&E) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA). La naringenina (purezza, $ 98% (HPLC)) è stata acquistata da Shanghai Jingchun Aladdin Reagent Co. (Shanghai, Cina). I GC sono stati preparati nel nostro laboratorio e la loro purezza è stata determinata pari al 60% mediante spettrofotometria ultravioletta utilizzando acteoside come marcatore per la determinazione.

Preparazione dei GC

Briey,polvere di cistana(100 g) sono stati immersi in etanolo al 75% (1000 mL) per 1 ora, quindi estratti nuovamente per 2,5 ore tre volte. Il surnatante è stato concentrato sotto vuoto per ottenereestratto di cistanza(23,3 g). L'estratto è stato diluito con acqua a una concentrazione di 0,5 g mL- 1 (solubilità determinata con droga grezza). Dopo l'adsorbimento con resina macroporosa AB-8 per 8 ore, la colonna è stata eluita sequenzialmente con acqua ed etanolo all'85%. L'eluente con etanolo all'85% è stato concentrato per ottenere un estratto etanolico (8,4 g). L'estratto in etanolo (0.02 g) è stato pesato accuratamente e sciolto in metanolo al 50% (10 mL). Un'aliquota da 1 mL della soluzione è stata diluita a 100 mL con metanolo in un recipiente volumetrico. Infine, la soluzione diluita è stata misurata a 330 nm mediante spettrofotometria ultravioletta. L'assorbimento dell'ultravioletto era 0,341 e la relazione lineare per acteoside mediante UV era y ¼ 24,905X + 0 ,0426 (R2 ¼ 0,9982). Quando conteneva 5,04 g di GC, la velocità di purificazione era del 60% (l'acteoside è stato utilizzato come marcatore per la determinazione di GC). La valutazione delle impronte digitali dei GC è mostrata in ESI Fig. S1.

Esperimenti sugli animali e raccolta di campioni

Ratti SD femmine di immaturità sessuale (45–60 g) e maturità sessuale (320–380 g) sono stati forniti dall'Animal Center dell'Harbin Medical University, licenza per animali da laboratorio, SCXK- (Esercito): 2013-001. Gli animali sono stati alloggiati in condizioni di laboratorio SPF e forniti di acqua di rubinetto standard da laboratorio alterata con la dieta, ad libitum. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dalle Linee guida provinciali per il benessere e la cura degli animali di Heilongjiang ed eseguite secondo le linee guida del National Institute of Health relative ai principi della cura degli animali (2004). Tutti i ratti utilizzati in questo esperimento sono stati acclimatati all'ambiente sopra indicato per una settimana.

I ratti SD sessualmente immaturi sono stati divisi casualmente in tre gruppi di 10 ratti: gruppo vuoto, gruppo dietilstilbestrolo e gruppo GC. Nel frattempo, 10 ratti SD della maturità sessuale sono stati selezionati come gruppo di controllo. Al gruppo dietilstilbestrolo è stato somministrato ig con dietilstilbestrolo (0,35 mg kg- 1, 1 ml/100 g), al gruppo GC è stato somministrato ig con la soluzione GC (30 g kg- 1, 1 ml/100 g ), e il gruppo bianco e il gruppo di controllo hanno ricevuto acqua distillata dello stesso volume due volte al giorno (mattina e sera) per 3 giorni. Il terzo giorno, i ratti sono stati alloggiati in gabbie metaboliche dopo la somministrazione e i campioni di urina sono stati raccolti ininterrottamente per 24 ore. I ratti sono stati anestetizzati utilizzando pentobarbital e sono stati ottenuti campioni di sangue raccolti dall'aorta addominale e centrifugati a 3000 × g (15 min, 4 °C) per ottenere il siero. Tutti i campioni sono stati conservati presso - 20. C. Inoltre, l'utero è stato separato, pesato ed esaminato utilizzando formalina al 10%.

Analisi istologica

Dall'utero sono stati tagliati tessuti in serie di 5 mm di spessore. Le sezioni di tessuto sono state quindi incluse in paraffina, colorate con H&E utilizzando metodi di routine e osservate con un microscopio ottico (BZ-9000; Keyence, Osaka, Giappone). L'altezza delle cellule epiteliali uterine è stata misurata con un micrometro al microscopio.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI PER FAVORIRE LA CRESCITA DEL SENO PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Metabolomica

Preparazione del siero strippato con carbone attivo

È stato preparato uno speciale siero bianco da siero di ratto privato dei materiali endogeni utilizzando polvere di carbone attivo. La polvere di carbone attivo (6 g) è stata aggiunta al siero di ratto (100 mL) agitato per 2 ore a temperatura ambiente e centrifugato a 4 . C e 13 500 giri/min per 20 min. Il surnatante è stato alterato utilizzando membrane Millipore express PES (Merck Millipore, Ltd.) collegate a una siringa da 20 ml nella seguente sequenza: 5 mm, 1,2 mm e 0,45 mm. Il siero "stripato" è stato confermato privo di biomarcatori mediante LC-MS/MS.

Preparazione di soluzioni standard

L-triptofano (Try), L-chinurenina (Kyn), GSSG, N-fenilacetilglicina (N-Phe), 5- HTP, L-leucina (Leu), 5-HT e acido colico ( CA) soluzioni madre (1 mg mL- 1) ​​sono state preparate utilizzando 100% di metanolo. Il GSH è stato preparato a 0,5 mg mL- 1 in tampone NEM PBS 10 mM e conservato a - 40. C in bottiglie marroni. I calibratori sono stati generati utilizzando la combinazione di L-triptofano, L-chinurenina, GSSG, N-fenilacetilglicina, 5-HTP, L-leucina, 5-HT, acido colico e GSH-NEM che sono stati diluiti in serie con distillati acqua. La soluzione madre IS di L-fenilalanina-d5 (d5-Phe) è stata preparata in metanolo al 100% ed è stata preparata la soluzione di lavoro di d5-Phe (10 ng mL- 1 ) in metanolo al 100% e conservato presso - 40. C.

Durante l'analisi, è stata necessaria una fase di derivatizzazione per evitare la degradazione del GSH, che ha migliorato la stabilità per il rilevamento e la quantificazione del GSH. Il GSH è stato determinato dopo la reazione con NEM.15,16 Secondo il rapporto precedente, per GSH è stato selezionato NEM 50 mM.

preparazione del campione

Per i campioni di siero, al campione (200 mL) è stato aggiunto NEM 10 mM (200 mL), seguito da metanolo (1000 mL contenente IS Phe-d5 a 10 ng mL- 1) e incubato per 20 minuti a { {9}}. C. Dopo la centrifugazione a 4°C e 12 000 giri al minuto per 10 minuti, i surnatanti (1000 mL) sono stati trasferiti in centritubi da 2 mL ed evaporati a secchezza. Il residuo essiccato è stato ricostituito in acqua distillata (100 mL) dopo centrifugazione per 15 minuti a 4°C. C e 13 500 giri al minuto e un'aliquota da 10 mL del surnatante è stata iniettata per l'analisi.

Per i campioni urinari, 100 mL di campione sono stati posti in una provetta da 2 mL e a ciascun campione urinario è stato aggiunto 1 volume di PBS (m/v) contenente 50 mM NEM. Quindi è stato aggiunto metanolo (1000 mL contenente IS a 10 ng mL- 1) e il campione è stato incubato a - 20. C per 20 minuti, quindi centrifugare a 12 000 giri/min per 10 minuti a 4 . C. Il surnatante (1000 mL) è stato evaporato a secchezza sotto un leggero flusso di azoto a temperatura ambiente, quindi il residuo è stato sciolto in 60 mL di fase mobile e agitato nel vortex per 1 minuto prima della centrifugazione a 13 500 giri al minuto e 4 . C per 15 minuti. Per l'analisi è stata iniettata un'aliquota di surnatante da 10 ml.

Convalida della metodologia

La validazione del test è stata eseguita secondo la "Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation" (Food and Drug Administration, settembre 2013). I calibratori sono stati generati utilizzando una matrice surrogata per Trp, Kyn, GSH, GSSG, 5-HT, 5-HTP, N-Phe e CA da soluzioni di lavoro standard nel siero "stripped". Ciascun calibratore di concentrazione è stato duplicato. La curva standard è stata calcolata mediante regressione lineare dei minimi quadrati ponderati 1/X delle concentrazioni del calibratore della curva standard e dei rapporti dell'area del picco per l'analita rispetto all'IS.

Saggio di precisione e accuratezza

La precisione del test dei campioni QC raggruppati e dei campioni QC di siero/urina di ratto non trattato è stata valutata utilizzando un ciclo analitico intra-day e tre inter-day. I campioni QC con tre diverse concentrazioni sono stati generati aggiungendo L-triptofano, L-chinurenina, GSSG, N-fenilacetilglicina, 5-HTP, L-leucina, 5-HT, acido colico e GSH-NEM soluzioni standard di siero/PBS "stripped", che sono stati poi processati allo stesso modo dei campioni in vivo. Le soluzioni madre standard Try, Kyn, GSSG, N-Phe, 5-HTP, 5-HT, Leu e CA (1 mg mL- 1) sono state preparate in 10 0% di metanolo, eccetto quello di GSH, che è stato preparato a 0,5 mg mL- 1 in tampone NEM PBS 10 mM. Curve standard a otto diverse concentrazioni sono state generate allo stesso modo dei campioni QC e analizzate mediante regressione lineare dei minimi quadrati ponderati 1/X. Per lo studio di validazione del metodo, è stato eseguito simultaneamente un altro metodo di controllo qualità utilizzando un pool di siero/urina (50 mL) da ciascun campione dei gruppi di controllo o modello per ottenere un campione di controllo qualità e quindi elaborato come campioni in vivo. È stata eseguita una serie di campioni di controllo qualità e curve standard per ogni 50 campioni di animali.

Effetti della matrice

La variazione della matrice, definita come la variazione nell'accuratezza del dosaggio per diversi lotti di matrice, è stata valutata utilizzando sei diversi grafici di siero/urina di ratto addizionati per l'analisi e la valutazione del recupero dell'addizione.17 La valutazione dell'intero effetto della matrice per un dosaggio di un composto endogeno è impegnativa . Un modo per verificare se un test ha un effetto matrice (complessivo) è valutare il recupero arricchito. Il test di recupero addizionato prevede l'aggiunta dell'analita ai campioni pre-estrazione, che è diverso dal test dei fattori di matrice (MF), che prevede l'aggiunta dell'analita ai campioni post-estrazione.18 L'MF è stato calcolato come l'area del picco dell'analita in la presenza di una matrice biologica rispetto a quella in assenza di matrice biologica. È stato utilizzato il MF normalizzato IS: MF ¼ rapporto area del picco/IS in presenza di matrice rispetto al rapporto area del picco/IS in assenza di matrice.

Analisi UPLC-MS/MS

Per LC-MS è stata utilizzata un'apparecchiatura MS dotata di una colonna analitica Waters X BridgeTM BEH C18 XP (2,5 mm, 3,0 × 100 mm; Waters, Torrance, CA) /analisi MS. La fase mobile a gradiente lineare Q composta da 0,1% di acqua di acido formico (solvente A) e metanolo (solvente B) è stata utilizzata secondo il seguente programma di gradiente: 0–3.0 min (0–1% B); 3,0–10.0 min (1–3% B); 10.0–14.0 min (3–50% B); 14,0–18,0 minuti (50–95% B); 18,0–22,0 min (95–0% B), il tempo di arresto è di 25 min. Il volume di iniezione era di 10 ml e la velocità era di 0,6 ml al minuto- 1. Il metodo finale utilizzava i seguenti parametri: tipo di scansione, MRM; modalità ionica, ionizzazione elettrospray (ESI) in modalità ioni positivi e negativi; tensione di spruzzatura ionica, ± 4500 V; gas di cortina, 20; temperatura, 450. C; gas sorgente ionica 1, 40; gas sorgente ionica 2, 40. Tutti i dati UPLC-MS sono stati ottenuti utilizzando il software AB Analyst (versione 1.6.2) e m/z 171,1–125,2 per lo standard interno d5-Phe (DP, 63 V; CE , 8 V; CXP, 21 V; EP, 24 V) e le condizioni MS dettagliate sono mostrate nella Tabella S1.

analisi statistica

Tutti i valori sono stati espressi come media ± DS. La significatività delle differenze tra i gruppi è stata confrontata attraverso un test ANOVA unidirezionale seguito dal test di Dunnett utilizzando il programma Statistical Package for Social Sciences (SPSS 20.0, Chicago, IL, USA). In questo test la soglia di significatività è stata fissata a p < 0,05.

Risultati e discussione

Effetto dei GC sull'utero

Il peso uterino e l'analisi istologica sono stati utilizzati per valutare l'effetto dei GC sull'utero. Il peso uterino era significativamente aumentato nei gruppi dietilstilbestrolo, GC e controllo rispetto al gruppo bianco (P < {{0}}.01). Nel gruppo bianco, l'epitelio endometriale era basso colonnare con piccole ghiandole, un epitelio ghiandolare a forma cubica e senza cellule infiammatorie interstiziali. Nel gruppo dietilstilbestrolo, l'epitelio ghiandolare e l'endometrio erano colonnari alti e mostravano iperplasia, con molte cellule infiammatorie interstiziali. Nel gruppo GC, l'epitelio ghiandolare e l'endometrio erano altamente colonnari seghettati e mostravano iperplasia con molte cellule infiammatorie interstiziali e ispessimento intimale. Nel gruppo di controllo, l'endometrio era colonnare alto e l'epitelio ghiandolare era colonnare basso, con poche cellule infiammatorie interstiziali. Rispetto al gruppo bianco, l'altezza delle cellule epiteliali uterine era significativamente aumentata negli altri gruppi (P <0,01) (Fig. 1).

Convalida del metodo del biomarcatore rilevato mediante UPLC-MS/MS

Linearità e campo di calibrazione

Per ciascuna misurazione è stata costruita una curva di calibrazione lineare con un fattore di ponderazione pari a 1/X nella matrice studiata. Le curve di calibrazione per le analisi su siero sono state analizzate in giorni diversi. Gli intervalli di calibrazione per le analisi sono stati distribuiti lungo sette punti di calibrazione, come mostrato nella Tabella 1.

Accuratezza e precisione. Il metodo si è dimostrato appropriato, in termini di accuratezza e precisione, sia inter-day che intra-day, per tutti i campioni studiati. I valori di questi parametri erano inferiori al 5% alle concentrazioni impostate per GSH, GSSG, Leu, Trp, Kyn, 5-HTP, acido colico, 5-HT e N-fenilacetilglicina, con tre repliche di ciascuna concentrazione analizzata. I dati corrispondenti ai valori intergiornalieri e intragiornalieri di accuratezza e precisione sono riportati nella Tabella ESI S2.

Effetti della matrice

Come mostrato nella Tabella ESI S3,† i recuperi addizionati sono stati del 92,5–118,1% aggiungendo 1.000 ng ml- 1 di GSH, 2.000 ng ml- 1 di GSSG, 1.000 ng ml- 1 di Leu , 6000 ng ml- 1 di Trp, 50 ng ml- 1 di Kyn, 2 ng ml- 1 di 5-HTP, 400 ng ml- 1 di acido colico , 8 ng mL- 1 di 5-HT e 2500 ng mL- 1 di N-fenilacetilglicina in tre diversi appezzamenti di siero di ratto e quando si aggiungono 100 ng mL- 1 di GSH, 200 ng ml- 1 di GSSG, 1000 ng ml- 1 di Leu, 6000 ng ml- 1 di Trp, 50 ng ml- 1 di Kyn, 2 ng ml{ {37}} di 5-HTP, 400 ng mL- 1 di acido colico, 8 ng mL- 1 di 5-HT, 2500 ng mL- 1 di N -fenilacetilglicina in tre diversi appezzamenti di urina di ratto con vari livelli basali. I CV delle concentrazioni misurate di Trp e Kyn da questi lotti erano #10% (n=5). Questi risultati hanno indicato che matrici diverse non hanno influenzato in modo significativo il test.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI PER PREVENIRE IL CANCRO UTERINO PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Analisi del profilo dei metaboliti mediante metodo pseudo-mirato

Il metodo pseudomirato è stato sfruttato per studiare la profilazione MRM dei metaboliti sierici e urinari di quattro gruppi (bianco, dietilstilbestrolo, controllo e GC).

Innanzitutto, il modello PCA è stato costruito per mostrare la distinzione metabolica dei quattro gruppi. Dall'analisi multivariata, sono emerse evidenti differenze metaboliche tra i gruppi GC (inclusi dietilstilbestrolo e gruppi di controllo) e il gruppo bianco. I campioni di QC si raggruppavano strettamente nel grafico del punteggio della PCA, il che indicava che la stabilità del sistema era accomodante per questo studio di metabolomica (Fig. 2).

Quindi, il valore P critico è stato impostato su 0.05 per metaboliti significativamente differenziali in questa ricerca. Di conseguenza, come mostrato nella Tabella 2, i metaboliti differenziali rispetto al gruppo bianco sono stati provvisoriamente identificati come segue: 17 nei campioni di siero e

12 in campioni di urina per il gruppo GC, 15 in campioni di siero e 9 in campioni di urina per il gruppo dietilstilbestrolo, 12 in campioni di siero e 11 in campioni di urina per il gruppo di controllo e 11 in campioni di siero e 7 in campioni di urina analizzati contemporaneamente presente nel GC, nel dietilstilbestrolo e nei gruppi di controllo. Per comprendere ulteriormente le differenze metaboliche tra i diversi gruppi, è stata generata una mappa termica di clustering per tutti i metaboliti differenziali, dimostrando il relativo aumento (rosso) o diminuzione (verde) (Fig. 3).

Diciotto metaboliti differenziali presenti simultaneamente nei gruppi GC, dietilstilbestrolo e controllo sono stati descritti come

segue: glucosio, acido citrico, prolina, betaina, ornitina, N-fenilacetilglicina, acido fenilpiruvico, inosina, C16:0LPC, creatinina e xantosina nel siero e benzene acetil glicina, acido piroglutammico, acetilcarnitina e È stato osservato che la N6-acetil lisina nelle urine era significativamente diminuita (P < 0.05); mentre la taurina, l'ornitina, l'acido a-chetoglutarico e la spermidina nelle urine erano significativamente aumentati (P ​​< 0.05). Inoltre, la taurina (siero) era significativamente aumentata, mentre l'acido a-chetoglutarico (siero), C18:0LPC (siero) e la betaina (urina) erano significativamente diminuiti nei gruppi dietilstilbestrolo e GC (P < {{ 19}}.05); La L-chinurenina (siero) era sovraregolata nel gruppo dietilstilbestrolo, ma sottoregolata nel gruppo GC (P < 0,05); l'acido piroglutammico (siero) e la prolina (urina) erano sottoregolati, mentre l'acido citrico (urina) e la nicotinamide (urina) erano marcatamente aumentati nel gruppo di controllo e nel gruppo GC (P < 0,05); e la fenilalanina era sottoregolata nel gruppo GC (P < 0,05).

In questo studio sono stati studiati gli effetti dei GC sull'utero di ratti immaturi. L'utero è l'organo più sensibile per valutare gli effetti ER-dipendenti delle sostanze chimiche.Herba Cistanchesè stato segnalato che induce un aumento del peso uterino potenziando la funzione di rilascio della lutropina dell'ipotalamo-ipofisi-ovaio,20 che è stato osservato anche per i GC in questo studio. Ciò indicava che i GC hanno attività di tipo estrogenico. Recentemente, i lavori si sono concentrati principalmente sul meccanismo predominante attraverso il quale gli effetti estrogenici si esprimono attraverso il legame con gli ER,21-23, ma il meccanismo metabolico non è stato studiato in modo approfondito. In questo studio, è stato utilizzato un metodo pseudometabolomico per esplorare il meccanismo di tipo estrogenico dei GC.

Gli intermedi metabolici di una serie sequenziale di reazioni sono cambiati in modo più pronunciato rispetto alla cinetica enzimatica o alle individualizzazioni.24 Diciassette metaboliti nel siero, inclusi glucosio, acido citrico, taurina, prolina, betaina, ornitina, acido piroglutammico, acido a-chetoglutarico, N- fenilacetilglicina, acido fenilpiruvato, inosina, C18:0LPC, C16:0LPC,

creatinina, fenilalanina, L-chinurenina e xantosina e 12 metaboliti nelle urine, tra cui benzene acetil glicina, betaina, taurina, acido citrico, ornitina, acido piroglutammico, acetilcarnitina, N6-acetil lisina, nicotinamide, a-chetoglutarico si è scoperto che acido, spermidina e prolina sono coinvolti nel meccanismo di tipo estrogenico dei GC. Diversi metaboliti alterati erano di particolare interesse perché erano presenti sia nel siero che nelle urine. Ad esempio, l’acido citrico, formato dalla condensazione dell’acetil coenzima A e dell’acido ossalacetico e che svolge un ruolo importante nel ciclo dell’acido citrico correlato al metabolismo energetico,25 era sottoregolato nel siero del gruppo GC ma sovraregolato nelle urine . Inoltre, l'acido a-chetoglutarico con una struttura di carbonio glutammina, che può mantenere l'equilibrio totale dell'azoto e promuovere la sintesi proteica, ed è il materiale centrale del ciclo dell'acido citrico, era sottoregolato nel siero del gruppo GC, ma sovraregolato nelle urine.26 Il ciclo dell'acido citrico non è solo la via metabolica finale di tre principali nutrienti (carboidrati, lipidi e aminoacidi), ma anche il collegamento tra il metabolismo degli zuccheri, dei lipidi e degli aminoacidi e il modo principale per ottenere energia per il corpo.27,28 Ciò ha dimostrato che il meccanismo di tipo estrogenico dei GC era correlato al metabolismo energetico, che è lo stesso del dietilstilbestrolo. Pertanto, esisteva un chiaro legame tra il ciclo dell’acido citrico e l’aumento del peso uterino nei ratti immaturi trattati con GC. Essendo un importante donatore di metile, la betaina svolge un ruolo importante nella crescita e nello sviluppo del feto, indicando che la betaina è coinvolta nell'aumento del peso uterino.29 È interessante notare che la taurina era sovraregolata sia nel siero che nelle urine, il che potrebbe favorire la digestione e l'assorbimento dei lipidi. e l'assorbimento e l'utilizzo del glucosio da parte delle cellule promuovendo il metabolismo del glucosio. È stato anche riportato che la carenza di taurina porta alla perdita di peso negli animali giovani, suggerendo che la taurina svolge un ruolo importante nella crescita e nello sviluppo.30 Inoltre, l'effetto di regolazione della betaina e della taurina da parte dei GC ha seguito la stessa tendenza utilizzando il dietilstilbestrolo, ma con un aumento effetto rispetto al dietilstilbestrolo.

Inoltre, numerosi aminoacidi erano significativamente alterati. I nostri risultati hanno suggerito che i GC causavano anomalie metaboliche negli aminoacidi. Il metabolismo degli aminoacidi potrebbe essere utilizzato per la sintesi di specifiche proteine, peptidi e altri composti azotati, o per la decarbossilazione mediante deaminazione, transaminazione, combinata con la decomposizione dell'ammoniaca, o per il rilascio di energia attraverso il ciclo dell'acido citrico.31,32 Pertanto, alterazioni di questi i composti possono essere coinvolti negli importanti eventi di segnalazione che innescano l’aumento del peso uterino.

Inoltre, per un'analisi dettagliata del percorso, i metaboliti differenziali sono stati classificati in diversi percorsi principali tra cui il ciclo del citrato (ciclo TCA), il metabolismo del glutatione,

metabolismo dell'arginina e della prolina, metabolismo della D-glutammina e del D-glutammato, biosintesi di fenilalanina, tirosina e triptofano, metabolismo della fenilalanina e altri percorsi utilizzando il software Pathway Analysis of MetaboAnalyst (http://www.metaboanalyst.ca), come mostrato in Fig. 4. Il percorso correlato al metabolismo energetico, compreso il ciclo dei TCA e il metabolismo del glutatione (sia nel siero che nelle urine), era uno dei principali bersagli degli effetti estrogenici. Il ruolo critico delle sostanze chimiche estrogeniche nel metabolismo energetico è stato verificato dagli ER che regolano i geni necessari per la funzione mitocondriale, il ciclo TCA e altro, secondo studi precedenti.33,34 Si potrebbe concludere che il meccanismo simil-estrogenico dei GC era simile a quello del dietilstilbestrolo, essendo entrambi correlati, in una certa misura, al ciclo dei TCA e al metabolismo del glutatione, ma con i GC che funzionano meglio del dietilstilbestrolo.

Sebbene in questo studio non sia stato possibile chiarire i possibili meccanismi, sono stati selezionati alcuni metaboliti che potrebbero essere utilizzati in futuro per esplorare altri meccanismi estrogenici dei GC nell’utero. Pertanto, per esplorare meglio il meccanismo, nella ricerca futura verranno applicate altre tecnologie, come la proteomica.

Conclusioni

Per riassumere, è stato creato un metodo metabolomico pseudomirato su siero e urina basato su UPLC-QTRAP MS per esplorare i meccanismi di tipo estrogenico dei GC, che ha fornito risultati robusti e affidabili. Utilizzando l'approccio pseudo-mirato consolidato, è stata rivelata una visione olistica dei cambiamenti nella metabolomica del siero e delle urine del meccanismo di tipo estrogenico (GC).

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI PER MIGLIORARE LA FUNZIONE SESSUALE PHGS75% ECH 30% ACT 12%