Studio sulla funzione neuroendocrino-immune della Cistanche Deserticola e dei suoi prodotti per la cottura a vapore di vino di riso nel modello di ratto indotto da glucocorticoidi-Ⅱ
Aug 16, 2024
3.2.4. Immunoistochimica
L'apoptosi neuronale è controllata da molti geni apoptotici e antiapoptotici, principalmente il gene che promuove l'apoptosi Bax e i geni antiapoptotici della famiglia dei geni Bcl-2. Bcl-2 è localizzato negli organelli reattivi che producono ossigeno come i mitocondri, il reticolo endoplasmatico e le membrane nucleari. Bcl-2 ha un impatto minimo sui radicali liberi dell'ossigeno, ma può farloprevenire il danno ossidativo nelle cellule. Bax trasporta dal citoplasma alla membrana mitocondriale, modifica la struttura della membrana mitocondriale e promuove il rilascio del citocromo ce l'induzione dell'apoptosi.
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C'era un'espressione nel citoplasma surrenale delle proteine Bax e Bcl-2. La colorazione ha mostrato tutte le particelle gialle. Rispetto a quella del gruppo BC, la densità ottica media della proteina Bax nel gruppo MC è aumentata significativamente (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).
La Figura 5(b) mostra che, rispetto a quella del gruppo BC, la densità ottica media della proteina Bcl-2 nel gruppo MC è diminuita significativamente (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).
La proteina caspasi-3 è localizzata principalmente nel citoplasma nella sua forma originale nei tessuti normali e ha una bassa espressione. I segnali positivi sono giallo pallido o giallo brunastro. Rispetto a quella del gruppo BC, l'espressione della caspasi-3 nel gruppo MC è aumentata significativamente (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).
Nei tessuti normali, l'espressione del gene Fas era ridotta e il segnale positivo per l'ibridazione in situ era giallo brunastro. Come mostrato nella Figura 5 (d), rispetto a quella del gruppo BC, la densità ottica media della proteina Fas nel gruppo MC è aumentata (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).
La proteina FasL si trova principalmente nella membrana cellulare o nel citoplasma e i suoi segnali positivi sono marroni. Rispetto a quella del gruppo BC, la densità ottica media del gene FasL nel gruppo MC è aumentata significativamente (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).
I risultati hanno dimostrato che CD e WCD potrebberoinducono l’apoptosi nelle cellule infiammatoriee riducono il danno surrenale promuovendo l'espressione della proteina FasL e legandosi alla proteina Fas, attivando la proteina caspasi-3 e innescando una cascata di caspasi. L'effetto del gruppo WCD-HD è stato il migliore.
3.3. Determinazione della funzione immunitaria
3.3.1. Indice degli organi immunitari
Rispetto a quelli del gruppo BC, il coefficiente del timo e l’indice della milza del gruppo MC sono diminuiti significativamente (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better.
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3.3.2. Rilevazione di sottoinsiemi di linfociti T nel sangue periferico
La percentuale di cellule CD4+ nel quadrante superiore sinistro e di cellule CD8+ nel quadrante inferiore destro nel gruppo BC e in ciascun gruppo di farmaci era superiore a quella del gruppo MC. Rispetto a quello del gruppo BC, il rapporto CD4+ThCD8+ è diminuito significativamente nel gruppo MC (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).
3.3.3. Determinazione del livello di IL-10, IL-6, IL-2, TNF-Α e IFN-C nel siero
La Figura 8 mostra che, rispetto a quello del gruppo BC, il livello di IL-6, TNF- e IFN-c è aumentato significativamente (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.
3.3.4. Risultati dell'esperimento di osservazione al microscopio del tessuto Lymus
La Figura 9 mostra che nel gruppo BC era presente un gran numero di linfociti. Linfociti e reticolociti erano disposti in modo lasco al centro con timociti rotondi o ovali sparsi. Non c'era necrosi, nessuna infiltrazione di cellule infiammatorie e nessun cambiamento anormale.
Il gruppo MC mostrava una grande quantità di tessuto necrotico linfoide, con una disposizione disordinata di linfociti e reticolociti al centro. I timociti rotondi o ovali scomparivano, era evidente una massiccia degenerazione cellulare o necrosi e si verificava un'infiltrazione di cellule infiammatorie con alterazioni patologiche anormali.
Nei gruppi CD, le caratteristiche morfologiche dei linfociti erano tornate alla normalità e la disposizione dei linfociti centrali e dei reticolociti era quasi normale. I timociti rotondi o ovali si erano ripresi, ma rimaneva un piccolo numero di linfociti degenerativi o necrotici e cellule infiammatorie infiltranti.
Nei gruppi WCD e nel gruppo PC, le caratteristiche morfologiche dei linfociti erano meglio riparate. I linfociti e i reticolociti al centro erano ben allineati, i timociti rotondi o ovali erano quasi normali, ma rimaneva un piccolo numero di linfociti infiltranti e degenerativi.
3.4. Espressione genica della proteina CaM
Il valore RQ (mRNA CaM - mRNA di actina) è stato considerato per esaminare l'espressione dell'mRNA CaM. L'RQ del gruppo BC era 1. L'espressione dell'mRNA di CaM nell'ipotalamo nel gruppo MC è aumentata significativamente (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.
4. Discussione
La Farmacopea Cinese [2] riporta che CD e WCD possono essere utilizzati in clinica come i principali tipi di pezzi da decotto. Dopo essere stato cotto a vapore con vino di riso, ileffetti antietà e tonificanti del rene-yangsono stati potenziati. Attraverso UPLC-QqQ-MS, abbiamo rilevato i cambiamenti quantitativi nella base del materiale chimico durante il processo di cottura a vapore del vino di riso. I glicosidi iridoidi erano instabili e il contenuto di questi glicosidi diminuiva fino a diventare non rilevabile. Anche il contenuto dei glicosidi del feniletanolo è cambiato, il che potrebbe indurre cambiamenti nella farmacodinamica e nell’effetto clinico.
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Il classico modello di deficit del rene-yang è stato replicato mediante iniezione sottocutanea di corticosterone [19]. Un sovradosaggio di corticosterone potrebbe inibire il segreto del CRH nell'ipotalamo. Nel frattempo anche il segreto dell’ACTH è stato inibito. Il livello dell’ormone della corteccia surrenale è diminuito e quindi la funzione dell’asse HPA è stata ridotta. L'ipofunzione dell'asse HPA è una caratteristica comune del deficit del rene-yang [20]. Poi i ratti mostrano fenomeni di "deplezione" e i sintomi sono in accordo con quelli della carenza di rene-yang riscontrata in clinica.
Nel gruppo MC, i livelli di CRH, ACTH, T e CORT nel siero di ratto sono diminuiti significativamente (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.
La modulazione della proporzione dei membri della famiglia Bcl-2 è uno dei meccanismi principali attraverso i quali FasThFasL media il percorso del recettore della morte e la famiglia Bcl-2 regola il percorso mitocondriale [21]. Il fattore che inibisce l'apoptosi Bcl-2 e i fattori che inducono l'apoptosi, come Bax, appartengono tutti alla famiglia Bcl-2 [22]. L'apoptosi cellulare può essere determinata dal rapporto relativo tra fattori che inibiscono l'apoptosi e fattori che inducono l'apoptosi [23]. I mitocondri hanno la funzione di punti di controllo centrali per molte forme di apoptosi [24]. Il presente studio ha dimostrato che CD-MD e WCD potrebbero dedurre l'espressione di Bax e aumentare Bcl-2 amigliorare la carenza di rene-yang. Fas è il principale recettore di morte che induce l'apoptosi mediante legatura con il ligando Fas (FasL) [25]. L'espressione di Fas e FasL nel gruppo MC è aumentata, mentre questa espressione è aumentata significativamente nel gruppo WCD-MD (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).
Il deficit della funzione immunitaria è una delle manifestazioni importanti del deficit del rene-yang [28]. In questo studio, abbiamo scoperto che l’indice della milza e del timo del gruppo WCD-MD ha recuperato significativamente (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).
L’asse HPA è il sistema regolatore più importante perché regola la secrezione di glucocorticoidi e il sistema endocrino per mantenere la funzione secretoria della corteccia surrenale [32]. La sovraespressione dell'mRNA di CaM nel tessuto dell'ipotalamo era correlata alla carenza di yang renale. CD e WCD potrebbero bloccare i canali del calcio, inibire l'espressione dell'mRNA del CaM nell'ipotalamo e diminuire l'afflusso di calcio, diminuendo così l'attività del complesso Ca2+·CaM.
La formazione del deficit del rene-yang è un processo di sviluppo di una malattia cronica. Il rene non è più un concetto puramente anatomico, ma è un termine generale per l'immunità neuroendocrina e il sistema genito-urinario. La rete neuroendocrino-immune (NEI) è un importante sistema di regolamentazione integrato [33]. CD e WCD possono regolare la funzione dell'asse HPAT e migliorare il recupero del deficit del rene-yang. Questo risultato fornisce la base sperimentale per la prevenzione clinica e il trattamento del deficit del rene-yang.
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