Studio sulla funzione protettiva di Cistanche sul rene: differenze androgeni-dipendenti nelle quantità di CYP MRNA nel rene di maiale
Mar 13, 2022
Differenze androgeni-dipendenti nelle quantità di mRNA del CYP nel rene di maiale
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In precedenza abbiamo riportato differenze di sesso e razza androgeni-dipendenti nelle quantità di mRNA delle isoforme CYP nel fegato di maiale. Per chiarire se ci sono tali differenze di sesso e razza nelrene, abbiamo esaminato le quantità di diversi mRNA di CYP nel rene utilizzando entrambi i sessi di maiali Landrace, Meishan e/o di maiali incrociati F1 (LM e ML) di 5- mesi. Sono state riscontrate differenze di sesso significative nelle quantità di diversi mRNA di CYP: maschio < femmina="" per="" cyp2a19="" e="" cyp3a29;="" e="" maschio=""> femmina per CYP4A24/25 in tutte le razze. Sono state osservate differenze di sesso anche nella quantità di mRNA di CYP2B22 (maschio < femmina)="" e="" negli="" mrna="" di="" cyp2c33="" e="" cyp2c49="" (maschio=""> femmina) in tutte le razze ad eccezione dei suini Landrace. Inoltre, una differenza significativa tra i sessi (maschio
Parole chiave:testosterone; CYP;rene; differenza di sesso; differenza di razza; maiale;renecellula;Cistanche
Misaki Kojima e Masakuni Degawab
Unità di genoma animale, Istituto di scienze del bestiame e dei pascoli, Organizzazione nazionale per la ricerca sull'agricoltura e gli alimenti (NARO); 2 Ikenodai, Tsukuba, Ibaraki 305–0901, Giappone: e bLaboratory of Molecular Toxicology, School of Pharmaceutical Sciences, University of Shizuoka; 52–1 Yada, Suruga-Ku, Shizuoka 422–8526, Giappone. Ricevuto il 16 aprile 2021; accettato il 19 maggio 2021
INTRODUZIONE
Gli enzimi che metabolizzano i farmaci (DME), come CYP, sulfotransferasi (SULT) e uridina 5′-difosfato (UDP)-glucuronosiltransferasi (UGT), svolgono un ruolo importante nel metabolismo degli xenobiotici, inclusi farmaci e composti endogeni come gli ormoni steroidei e lipidi.1,2) I suini domestici (Sus scrofa domesticus), inclusi i maialini, sono importanti negli studi farmacologici e tossicologici a causa della somiglianza della funzione del DME tra l'uomo e i suini, in particolare i CYP.3–7) Abbiamo precedentemente riportato il sesso e differenze di razza nelle quantità di mRNA del DME epatico, comprese le isoforme del CYP, tra i maiali Landrace e Meishan, e abbiamo ulteriormente dimostrato che il livello sierico di androgeni è uno dei fattori critici che producono queste differenze.8)
Cistanchetubulosaprevienemalattie renali,clicca qui per ottenere il campione
Ilreneoltre al fegato è l'importante tessuto responsabile del metabolismo e dell'escrezione di xenobiotici inclusi farmaci e composti endogeni ed è uno dei bersagli più frequenti per la tossicità indotta da farmaci.9,10) È stato riportato che le isoforme del CYP appartenenti al Nel maiale esistono famiglie CYP1, CYP2, CYP3 e CYP4rene.11–15) La maggior parte di queste isoforme del CYP svolgono un ruolo importante nel metabolismo degli xenobiotici e/o dei lipidi negli animali da esperimento e nell'uomo.9,10,16,17) Inoltre, l'espressione delle isoforme Cyp4a e Cyp4b nel toporeneè regolato dagli androgeni.18–21)
Nel presente studio, abbiamo prima esaminato le differenze di sesso e razza nelle quantità di mRNA del CYP (CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29, CYP3A46, CYP4A24/25 e CYP4B1) nelrenedi Meishan, Landrace e dei loro maiali F1 incrociati. Inoltre, abbiamo esaminato se gli androgeni siano un fattore critico che determina le differenze di sesso e razza nelle quantità di quegli mRNA del CYP nel maialerene, mediante esperimenti di castrazione e/o somministrazione ditestosteronepropionato (TP).
MATERIALI E METODI
Animali
Sono stati utilizzati maiali Landrace, Meishan e i loro incroci F1 (LM, femmina Landrace × maschio Meishan; ML, femmina Meishan × maschio Landrace), gli stessi utilizzati nei nostri studi precedenti.22) In breve, i maiali sono stati tenuti presso l'Istituto Nazionale di zootecnia e pascoli, Tsukuba, Giappone. Tutti i maiali sono stati nutriti con una dieta a base di cereali commerciale e forniti di acqua ad libitum. I maiali sono stati uccisi mediante stordimento elettrico seguito da dissanguamento tra le 10:{3}} e le 11:{5}} del mattino. Alcuni maiali maschi Landrace e Meishan sono stati castrati all'età di 1 mese ed eutanasia all'età di 5 mesi. Una parte del rene o del fegato di ciascun maiale è stata rapidamente rimossa, congelata in azoto liquido e mantenuta a -80 gradi fino alle analisi successive.
Questo studio è stato approvato dal Comitato per la cura degli animali del National Institute of Livestock and Grassland Science (n. 1711B060, 1811B032, 1911B068, 20B005NILGS). Tutti gli animali sono stati trattati in modo umano secondo le linee guida del Comitato.
Trattamento con androgeni
Come descritto nelle precedenti relazioni,23,24)testosteroneil propionato (TP, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) disciolto nell'olio di mais è stato iniettato per via intramuscolare cinque volte a 48-h intervalli nella coscia posteriore di ciascun maiale, alla dose di 10 mg/kg peso corporeo; i maiali sono stati soppressi 24 ore dopo l'ultima iniezione.
Quantità di sieroTestosterone
La quantità di sierotestosteronenei singoli suini maschi è stata misurata utilizzando ilTestosteroneTest di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) Kit (Enzo Life Sciences Inc., NY, USA) secondo le istruzioni del produttore, come descritto in precedenza.24) Inoltre, sono stati utilizzati anche i dati ottenuti nei nostri studi precedenti.24,25)
Quantità di mRNA del CYP
L'RNA totale è stato preparato dai singoli tessuti utilizzando il reagente TRIzol (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) e utilizzato per determinare le quantità di CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29, CYP3A46, mRNA di CYP4A24/25 e CYP4B1. Le quantità di questi mRNA sono state valutate utilizzando RT-PCR in tempo reale utilizzando un sistema 7500 Real-Time PCR e SYBR green master mix (PE Applied Systems, Tokyo, Giappone), come descritto in precedenza,25) ad eccezione dell'mRNA del CYP3A. Le quantità di mRNA di CYP3A22, CYP3A29 e CYP3A46 sono state esaminate utilizzando Eagle Taq Master Mix con ROX (Roche Molecular Systems, Inc., Branch burg, NJ, USA) come riportato in precedenza.22) I set di primer e le sonde TaqMan utilizzati nel presente studio erano gli stessi dei nostri studi precedenti22,25) ad eccezione di CYP1A1, CYP1A2, CYP4A24/25 e CYP4B1, dove le sequenze di primer erano le seguenti: CYP1A1, 5′-ACT TCA TCC CTA TCC TCC GTT ACC{{53} }′ (avanti) e 5′-GCA TTC TCG TCC ATC CTC TTG TC-3′ (indietro); CYP1A2, 5′-GCT ATC GGG ACT TTG ACA AGA ACT-3′ (avanti) e 5′-CCA GGA GAT GGC TGT GGT AAT TG-3′ (indietro); CYP4A24/25, 5′-CAC CGT GCC GCC AGG ATA-3′ (avanti) e 5′-CAA GGA GGA GGA TGT CCA GGA A-3′ (indietro); CYP4B1; 5′-GAG CAC CAG CAT CGT TGT CG-3′ (avanti) e 5′-TCC CCA GAT CCT CCC CCT G-3′ (indietro). La proteina ribosomiale L7 (RPL7) è stata utilizzata come standard interno. La quantità di ciascun cDNA è stata valutata mediante il metodo della curva standard relativa secondo PE Applied Biosystems User Bulletin n. 2 (1997). Le curve standard per determinare le quantità degli mRNA del CYP sono state generate utilizzando una miscela di reazione RT con RNA totale dal fegato di suini Landrace femmine di 5-mesi, o dal rene di 5-mesi femmine di maiali Landrace o Meishan, a seconda dello scopo
Analisi statistiche
Le differenze statisticamente significative sono state valutate dal test post hoc di Tukey dopo ANOVA o t-test di Student. Le correlazioni tra i parametri indicati sono state determinate mediante analisi di regressione.
RISULTATI
Quantità di mRNA del CYP nel rene di Landrace e Meishan Pigs
Le quantità di mRNA del CYP sono state inizialmente misurate nel rene di entrambi i sessi di suini Landrace e Meishan di 5-mesi. Per confrontare la quantità di ciascun mRNA di CYP tra il rene e il fegato, la quantità di ciascun mRNA di CYP nel rene è stata espressa come rapporto relativo con la quantità corrispondente nel fegato di suini Landrace femmine di 5- mesi, e i risultati sono mostrati nella tabella 1.
In tutti i suini esaminati, le quantità di mRNA di CYP4A24/25 e CYP4B1 nel rene erano molto più elevate di quelle nel fegato, mentre quelle degli altri CYP erano l'opposto (Tabella 1). Inoltre, sebbene gli mRNA di CYP2E1 e CYP3A22 siano stati rilevati nel rene, tali quantità erano inferiori a un millesimo di quelle nel fegato in ciascuna razza (dati non mostrati).
In entrambe le razze di suini, le quantità di mRNA di CYP2A19 e CYP3A29 erano inferiori nei maschi rispetto alle femmine (Tabella 1, Fig. 1). Al contrario, la quantità di CYP4A24/25 mRNA in entrambe le razze di suini era significativamente più alta nei maschi rispetto alle femmine. Inoltre, nei maiali Meishan, le quantità di mRNA di CYP2C33 e CYP2C49 erano significativamente più elevate nei maschi rispetto alle femmine. Non sono state osservate differenze di sesso di questo tipo nelle quantità di mRNA di CYP2C33 e CYP2C49 nei suini Landrace. Non sono state osservate differenze di sesso significative nelle quantità di mRNA di CYP1A1, CYP1A2, CYP2B22 e CYP4B1 in nessuna delle razze di suini, sebbene una differenza di sesso nella quantità di mRNA di CYP2B22 nei maiali Meishan fosse significativa dal test t di Student. Inoltre, l'mRNA del CYP3A46 è stato rilevato in entrambi i sessi dei suini Landrace, mentre era al di sotto del limite di rilevamento in entrambi i sessi dei suini Meishan.
Breed differences in the amounts of several CYP mRNAs were also found. The amounts of CYP2B22 and CYP4B1 mRNAs in Landrace pigs were signifificantly higher than those in sex-matched Meishan pigs, while those of CYP2C49 and CYP3A29 mRNAs were the opposite. A significant breed difference (Meishan > Landrace) in the amounts of CYP2C33 and CYP4A24/25 mRNA was also observed in males, but no such difference was found in females. Furthermore, the breed differences (Landrace >Meishan) sono state osservate anche le quantità di mRNA di CYP1A1, CYP1A2 e CYP2A19 tra suini Landrace e Meishan abbinati per sesso.
Effetto degli androgeni sull'espressione genica dei CYP rappresentativi legati al sesso Per chiarire la dipendenza dagli androgeni dell'espressione genica dei CYP (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49 e CYP3A29) nel rene, gli effetti della castrazione e/o del trattamento con TP sono stati esaminato utilizzando maiali Meishan e Landrace di 5-mesi (Fig. 1). Nei maschi castrati di entrambe le razze, la quantità di mRNA del CYP2A19 era superiore a quella dei corrispondenti maschi intatti. Inoltre, il trattamento con TP di maschi castrati e femmine intatte di entrambe le razze di suini ha comportato una diminuzione della quantità di mRNA. Le quantità di mRNA di CYP2B22 e CYP3A29 sono aumentate nei suini Meishan castrati, ma non nei suini Landrace castrati, rispetto ai corrispondenti maschi intatti. Il trattamento con TP di maschi castrati e femmine intatte di entrambe le razze di suini ha comportato una diminuzione delle quantità di tali mRNA, sebbene non siano stati osservati effetti significativi di TP sull'mRNA di CYP2B22 nel Meishan castrato e sull'mRNA di CYP3A29 nei suini Landrace castrati a causa dell'ampia inter- differenza individuale.
Tabella 1. Quantità relative di mRNA delle isoforme del CYP renale in 5- Landrace di un mese e maiali Meishan
Fig. 1. Effetti della castrazione e/o della somministrazione di TP sulle quantità di mRNA del CYP in 5-rene di maiale di un mese
TP è stato iniettato per via intramuscolare in maiali Landrace e Meishan maschi castrati di {{0}} mesi e femmine intatte, come descritto in Materiali e metodi. La quantità di ciascun CYP mRNA nel rene è stata determinata mediante RT-PCR in tempo reale e normalizzata a quella di RPL7 come standard interno. Le curve standard sono state generate utilizzando una miscela di reazione RT con RNA totale dai reni di suini Landrace femmine di 5- mesi, ad eccezione della determinazione della quantità di mRNA del CYP2C49, dove le curve standard sono state generate utilizzando una miscela di reazione RT con RNA totale dai reni di maiali Meishan femmine di 5-mesi. Ogni colonna rappresenta la media di ciascun gruppo sperimentale e ogni barra rappresenta la deviazione standard (DS) della media (n= 6 per suini Landrace e Meishan maschi e femmine intatti; n= 3 per gli altri). a,b Differenze significative rispetto ai corrispondenti suini maschi intatti sono state valutate mediante il test post hoc di Tukey: ap < 0.{{20}}5,="" bp="">< 0,01.="" c,d="" differenze="" significative="" rispetto="" ai="" corrispondenti="" suini="" tp="" non="" trattati,="" come="" valutato="" dal="" test="" t="" di="" student:="" cp="">< 0,05,="" dp="">< 0,01.="" i="" quadrati="" in="" cyp2b22="" e="" cyp3a29="" indicano="" i="" maiali="" meishan="" e="" landrace,="" rispettivamente,="" con="">
La quantità di mRNA del CYP2C33 è diminuita nei maiali Meishan castrati, ma non nei suini Landrace castrati, rispetto ai corrispondenti maschi intatti, e il trattamento TP dei maschi castrati e delle femmine intatte di entrambe le razze di suini ha comportato un aumento della quantità di mRNA. Nei maiali Meishan, anche la quantità di mRNA del CYP2C49 è stata ridotta dalla castrazione e il trattamento con TP dei maschi castrati e delle femmine intatte ha portato ad un aumento della sua quantità. Non sono stati osservati tali effetti della castrazione o del trattamento TP nei suini Landrace.
Fig. 2. Effetti della castrazione e/o della somministrazione di TP sulle quantità di mRNA di CYP4A24/25 e CYP4B1 nel rene e nel fegato di 5- suini di un mese
TP è stato iniettato per via intramuscolare in maiali Landrace e Meishan maschi castrati di {{{{10}}}} mesi di età, come descritto in Materiali e metodi. La quantità di ciascun mRNA del CYP nel rene e nel fegato è stata determinata mediante RT-PCR in tempo reale e normalizzata a quella di RPL7 come standard interno. Le curve standard sono state generate utilizzando una miscela di reazione RT con RNA totale dai reni di suini Landrace femmine di 5- mesi. Ogni colonna rappresenta la media in ciascun gruppo sperimentale e ogni barra rappresenta la SD della media (n= 6 per i maiali Landrace e Meishan maschi e femmine intatti; n= 3 per gli altri). Differenze significative rispetto ai corrispondenti suini maschi intatti sono state valutate mediante il test post hoc di Tukey: ap < 0.01.="" b,c="" differenze="" significative="" rispetto="" ai="" corrispondenti="" suini="" tp="" non="" trattati,="" come="" valutato="" dal="" test="" t="" di="" student:="" bp="">< 0,05,="" cp=""><>
To date, there are no reports concerning the constitutive amounts of CYP4A24/25 and CYP4B1 mRNAs and sex differences in their amounts in the pig liver, although a clear sex difference (male >femmina) nella quantità di CYP4A24/25 mRNA si osserva qui nel rene di maiale (Tabella 1). Pertanto, per chiarire gli effetti degli androgeni sull'espressione di quegli mRNA nel rene e nel fegato dei maiali Landrace e Meishan, abbiamo esaminato non solo gli effetti della castrazione ma anche gli effetti del trattamento con TP di maschi castrati e femmine intatte ( Fig. 2). La quantità di CYP4A24/25 mRNA nel rene è stata ridotta sia nei maiali Landrace che Meishan dalla castrazione e il trattamento TP dei maschi castrati e delle femmine intatte di entrambe le razze di suini ha comportato un aumento della sua quantità. Tuttavia, nel fegato di entrambe le razze di suini, non sono stati osservati tali effetti di castrazione, e inoltre non è stata osservata alcuna differenza di sesso nella quantità di CYP4A24/25 mRNA. Allo stesso modo, non è stato osservato alcun effetto significativo del trattamento con TP sulla quantità di mRNA epatico di CYP4A24/25 in entrambe le razze di suini, sebbene l'aumento della sua quantità con il trattamento con TP sia stato osservato solo nei maschi castrati di suini Landrace. Inoltre, l'mRNA di CYP4B1 non ha mostrato differenze di sesso sia nel rene (Fig. 2 e Tabella 1) che nel fegato per ciascuna razza di suino. In entrambe le razze di suini, la quantità di mRNA del CYP4B1 non è stata modificata in modo significativo dalla castrazione e/o dal trattamento con TP (Fig. 2).
In precedenza abbiamo scoperto che il trattamento con TP ha comportato un aumento della quantità di mRNA del CYP3A46 nel fegato dei suini Landrace.22) Pertanto, gli effetti del trattamento con TP e della castrazione sulla quantità di mRNA nel rene sono stati ulteriormente esaminati utilizzando {{3} }Suini Landrace di un mese (Fig. 1). Sebbene la castrazione dei maschi non abbia avuto effetti significativi sulla quantità di mRNA del CYP3A46 nel rene, il trattamento con TP dei maschi castrati e delle femmine intere ha comportato una diminuzione della quantità di mRNA del CYP3A46. Inoltre, l'mRNA del CYP3A46 era al di sotto del limite di rilevabilità sia nel rene che nel fegato di tutti i maiali Meishan trattati con castrazione e/o TP.22)
Fattori genetici responsabili dell'espressione legata al sesso degli mRNA del CYP
We have previously reported that sex-related expression of CYP mRNAs in the pig liver is, at least in part, dependent on the amount of serum testosterone,8) and that the amount is determined by autosomal dominant inheritance.25) Therefore, using F1 progeny (LM and ML) of Landrace and Meishan pigs, the amounts of sex-related CYP mRNAs in the kidney were measured (Fig. 3). Incidentally, the amounts of serum testosterone in 5-month-old male LM and ML pigs, as well as Meishan pigs, were >40 ng/mL e quelli nei suini Landrace maschi di 5-mesi lo erano<23 ng>
In both LM and ML pigs, the mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, and CYP3A29 in males were much lower than those in females, while the converse was observed for CYP2C33 and CYP4A24/25. For CYP2C49 mRNA, a significant sex difference (males >femmine) è stata osservata nei suini ML, ma non è stata osservata alcuna differenza significativa nei suini LM a causa delle notevoli differenze interindividuali tra i suini LM maschi. L'mRNA di CYP3A46 è stato rilevato nei suini LM e ML, così come nei suini Landrace, e una differenza di sesso (maschi< females)="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was observed in lm and ml pigs ="">
Fig. 3. Differenze di sesso nella quantità di mRNA del CYP nel rene di 5- suini LM e ML di un mese
La quantità di mRNA di ciascun CYP nel rene è stata determinata mediante RT-PCR in tempo reale e normalizzata a quella di RPL7 come standard interno. Le curve standard sono state generate utilizzando una miscela di reazione RT con RNA totale dai reni di suini Landrace femmine di 5- mesi, ad eccezione della determinazione della quantità di mRNA del CYP2C49, dove le curve standard sono state generate utilizzando una reazione RT miscela con RNA totale dai reni di maiali Meishan femmine di 5-mesi. Ciascun cerchio mostra un singolo suino (n= 6 e 9 per suini ML maschi e femmine, rispettivamente; n= 7 e 10 per suini ML maschi e femmine, rispettivamente). La barra indica la media in ogni gruppo. a,b Differenze significative tra maschi e femmine in ciascuna razza sono state valutate mediante il test t di Student: ap < 0.05,="" bp=""><>
Relazione tra quantità di testosterone sierico ed espressione di mRNA CYP correlati al sesso nel rene
Si ritiene che la concentrazione di androgeni sierici sia uno dei fattori critici che producono differenze di sesso e razza nelle quantità di diversi mRNA del CYP nel rene di maiale. Pertanto, la relazione tra la concentrazione sierica di androgeni e l'espressione legata al sesso degli mRNA del CYP (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A29, CYP3A46 e CYP4A24/25) nel rene è stata ulteriormente esaminata utilizzando 1-, { {17}} e 5-maiali di un mese. Alcuni dei 1-maiali di un mese (immaturi,< 10 ng testosterone/ml ="" serum) ="" were ="" treated ="" with ="" tp="" and="" used="" as="" samples="" for="" the="" present="" experiments.="" the="" concentrations="" of="" serum="" testosterone="" in="" the="" tp-treated="" pigs="" were ="" 28–59 ng/ml. ="" in ="" addition, ="" serum ="" testosterone ="" amount ="" increased="" in="" an="" age-dependent="" manner="" in="" males25) ="" but ="" not ="" in ="" females="" of="" all="" the="" pigs=""><7 ng testosterone/ml ="" serum) ="" used. ="" therefore,="" as="" representative="" samples="" of="" females,="" 1-month-old="" and ="" 5-month-old ="" pigs ="" but ="" not ="" 3-month-old ="" pigs ="" were ="" used ="" for ="" the="" present="">
The mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29, and CYP3A46 in all the pigs with high concentrations (>ca. 30 ng/mL) di testosterone sierico erano bassi rispetto a quelli di tutti i suini con basse concentrazioni di testosterone sierico (<30 ng l). ="" in ="" particular, ="" the ="" amount ="" of ="" cyp3a29="" mrna="" decreased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent ="" manner ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig ="" examined ="" (fig. ="" 4). ="" furthermore,="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent="" decrease="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was also observed ="" in="" all="" the="" pigs="" except="" meishan="">
Le quantità di CYP2C33 e CYP4A24/25 mRNA, tuttavia, sono aumentate in modo dipendente dalla concentrazione sierica di testosterone in tutte le razze suine esaminate (Fig. 5). La quantità di mRNA del CYP2C49 è aumentata in modo dipendente dalla concentrazione di testosterone sierico nei suini Meishan, LM e ML ma non nei suini Landrace. Inoltre, è stato osservato un lieve aumento della quantità di mRNA del CYP2C49 nei suini Landrace e Meishan di 1-mesi trattati con TP. Ciò suggerisce che l'espressione di tale effetto associato a TP dipende dal livello di espressione dei fattori trascrizionali TP-reattivi per l'espressione del gene CYP2C49, che è coinvolto nella maturazione.
DISCUSSIONE
Nel presente studio, inizialmente abbiamo riscontrato differenze di sesso e razza nelle quantità di diversi mRNA del CYP nel rene utilizzando maiali Landrace e Meishan di 5-mesi e la loro progenie F1 (LM e ML). Successivamente, per chiarire l'effetto degli androgeni sulle quantità di mRNA dei CYP renali, abbiamo esaminato gli effetti della castrazione e/o del trattamento con TP su tali quantità. Questi risultati sono riassunti nella Tabella 2. Analizzando tali differenze di sesso e razza in relazione alla concentrazione di testosterone sierico, abbiamo qui dimostrato che il testosterone sierico è almeno uno dei fattori critici che producono quelle differenze nella quantità di ciascun CYP mRNA nel rene.
Fig. 4. Correlazioni negative tra le concentrazioni sieriche di testosterone e le quantità di CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29 e CYP3A46 mRNA nel rene di maiale
Le concentrazioni sieriche di testosterone e le quantità di CYP mRNA sono state misurate come descritto in Materiali e metodi. Alcune delle concentrazioni sieriche di testosterone dei singoli suini sono state ricavate da dati ottenuti in precedenza.24,25) Ogni simbolo rappresenta ogni singolo suino. Quadrati aperti e losanghe, 1- maschi e femmine di un mese, rispettivamente, di maiali Landrace e Meishan (n= 3 per entrambi i sessi di maiali Landrace e Meishan); quadrati grigi, 3-maiali maschi Landrace e Meishan di un mese (n= 4 per maiali Landrace e n= 6 per maiali Meishan); quadrati chiusi e losanghe, 5-maschi e femmine di un mese, rispettivamente, di maiali Landrace e Meishan (n= 6 per entrambi i sessi di maiali Landrace e Meishan); triangoli chiusi e aperti, suini LM maschi e femmine di 5-mesi rispettivamente (n= 6 per i maschi e n= 9 per le femmine); triangoli inversi chiusi e aperti, 5-suini maschi e femmine ML di un mese, rispettivamente (n= 7 per i maschi e n= 10 per le femmine); cerchi chiusi e aperti, 1-suini maschi e femmine Landrace e Meishan di un mese trattati rispettivamente con TP (n= 3 per entrambi i sessi di suini Landrace e Meishan). Le correlazioni sono state esaminate utilizzando i dati di tutti gli animali testati e determinate mediante analisi di regressione, dove r è il coefficiente di correlazione.
In precedenza abbiamo trovato differenze di sesso (maschio< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp1a1="" and="" cyp1a2="" mrnas="" in="" the="" liver="" of="" meishan, lm, and ml pigs but not in landrace pigs.23–25) however, ="" no ="" such ="" sex ="" differences were ="" observed in the ="" kidney ="" of landrace="" and="" meishan="" pigs.="" on="" the="" contrary,="" there="" was="" a="" sex="" difference="" (male="" >="" female)="" in="" the="" amount="" of="" cyp4a24/25="" mrna="" in ="" the ="" kidney ="" but ="" not ="" in ="" the ="" liver. ="" sex ="" differences ="" in ="" the ="" amounts="" of="" cyp2a19,="" cyp2c33,="" and="" cyp2c49="" mrnas="" in="" the="" pig="" kidney,="" especially="" in="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs,="" correlated="" with="" the="" previous="" results="" in="" the="">< female="" for="" cyp2a19;="" male="" >="" female="" for="" cyp2c33="" and="" cyp2c49.="" interestingly, ="" sex ="" differences ="">< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp2b22,="" cyp3a29, and/or cyp3a46="" mrnas="" in="" the="" kidney="" of="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs="" were="" the="" opposite="" of="" that="" previously obtained in the liver.22) sex differences in the amount of ="" cyp2a19,="" cyp3a29,="" and="" cyp4a24/25 ="" mrnas ="" were ="" observed ="" in the kidney of all the breeds of pig examined. although ="" sex ="" differences ="" in cyp2b22,="" cyp2c33, ="" and/or cyp2c49 ="" were ="" observed in meishan, lm, ="" and ml ="" pigs, ="" no ="" such ="" sex ="" differences ="">
Tabella 2. Riepilogo delle differenze di sesso e razza dipendenti dagli androgeni nell'espressione genica delle isoforme CYP nel rene di maiale
These sex and breed differences can be explained by the differences in the concentration of serum testosterone in male pigs. Male 5-month-old Meishan, LM, and ML pigs had high concentrations of serum testosterone (>ca. 40 ng/mL) mentre quelli dei suini Landrace avevano basse concentrazioni (<23 ng l). ="" because ="" the ="" amount ="" of ="" cyp2a19="" and="" cyp3a29 ="" mrnas ="" considerably ="" decreased ="" in ="" pigs ="" with ="">ca. 20 ng/mL di testosterone sierico, differenze di sesso (maschio< female) in ="" their ="" amounts ="" were ="" observed ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig. ="" likewise, ="" since ="" the ="" amount ="" of ="" cyp4a24/25="" mrna="" increased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent manner up to 80 ng/ml, a sex difference (male =""> female) was observed in all the breeds of pig. However, because clear changes in the amount of CYP2B22, CYP2C33, and CYP2C49 mRNAs occurred at >30 ng/mL di testosterone sierico, differenze di sesso nelle loro quantità sono state osservate nei suini Meishan, LM e ML ma non nei suini Landrace. Di conseguenza, si ritiene che tali differenze di sesso e razza dipendano da quelle della concentrazione sierica di testosterone. Questa ipotesi è ulteriormente supportata dagli esperimenti con suini castrati e/o trattati con TP. Vale a dire, le quantità di quegli mRNA nei maschi castrati (<12 ng testosterone/ml ="" in ="" serum) ="" were ="" almost ="" the="" same="" as="" the="" corresponding="" females.="" serum="" concentrations="" of="" testosterone="" in="" 5-month-old="" castrated="" males="" and="" intact="" females="" rose="" to="">100 ng/mL sul trattamento TP. Di conseguenza, nei suini trattati con TP, le quantità di mRNA di CYP2C33 e CYP4A24/25, di mRNA di CYP2C33 e CYP4A24/25 sono aumentate in misura pari o superiore a quelle dei suini maschi Meishan di 5-mesi di età e le quantità di Gli mRNA di CYP2B22, CYP3A29 e CYP3A46 sono diminuiti tanto quanto quelli nei corrispondenti suini maschi.
Si ritiene che una differenza nel profilo di secrezione dell'ormone della crescita (GH) tra maschi e femmine in molti animali, specialmente nei roditori, determini differenze di sesso nelle quantità di diversi enzimi che metabolizzano i farmaci, inclusi i CYP, nel fegato.26) Ad esempio, le differenze di sesso nelle quantità di mRNA delle isoforme Ugh, Sult e Cyp4a nel fegato di topo sono influenzate dalla secrezione di GH di tipo maschile e/o dagli androgeni, mentre quelle differenze di sesso sono regolate principalmente dagli androgeni nel rene.21,27 ,28) Inoltre, un locus transacting, chiamato repressione GH-dipendente (GDR), è proposto per regolare il gene per lo steroide specifico femminile 15 -idrossilasi (Cyp2a4) nel fegato del topo,29) ma questo gene è riportato essere regolati reciprocamente dagli androgeni nel fegato e nel rene dei topi maschi.30) Al contrario, abbiamo precedentemente riscontrato che nei maiali Landrace con una differenza di sesso nel profilo di secrezione di GH,31) non c'erano differenze di sesso nelle quantità di mRNA epatico di diverse isoforme di CYP, SULT e UGT che mostrano differenze di sesso nei maiali Meishan.22–25,32) Pertanto, si ritiene che tali differenze di sesso nei suini dipendano principalmente dalle differenze nella concentrazione sierica di testosterone. Tuttavia, poiché il profilo di secrezione del GH è modificato dagli androgeni,33-35) è possibile che i cambiamenti nelle quantità di mRNA osservati durante la castrazione e/o la somministrazione di TP avvengano, almeno in parte, attraverso un cambiamento del GH mediato dagli androgeni non si può escludere un pattern di secrezione.
Breed differences in amounts of the mRNAs of CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, and CYP4B1 between sex-matched Landrace and Meishan pigs were also observed in the kidney (Table 1), while no such clear breed differences were observed in the liver.22,25) Additionally, as for CYP2C49 mRNA, individual differences in each breed of pig were observed regardless of serum testosterone concentration, suggesting that these varieties have genetic diversity. Incidentally, pig breeds are not genetically homogeneous. Interestingly, CYP3A46 mRNA was clearly detected in both the kidney and the liver of Landrace pigs but was below the detection limit in both organs of Meishan pigs.22) Furthermore, CYP3A46 mRNA was clearly detected in both the kidney and the liver of LM and ML pigs, indicating that expression of CYP3A46 mRNA, as well as serum testosterone,25) is determined by autosomal dominant inheritance. Because 5-month-old male LM and ML pigs, but not Landrace pigs, had high concentrations of serum testosterone (>40 ng/mL), è stata osservata una differenza di sesso nella quantità di mRNA del CYP3A46 nei suini LM e ML ma non nei suini Landrace. Questi risultati suggeriscono fortemente che fattori genetici (razza) e selettivi dei tessuti, insieme al testosterone sierico, sono coinvolti nei livelli di espressione legati al sesso e alla razza di diversi geni CYP. Sfortunatamente, questi fattori rimangono poco chiari.
In conclusione, dimostriamo qui che ci sono differenze di sesso e razza nelle quantità di mRNA delle isoforme della famiglia CYP2, CYP3 e CYP4 nel rene di maiale e suggeriamo fortemente che tali differenze dipendono da fattori genetici dell'ospite, inclusa la concentrazione di androgeni sierici . Inoltre, mostriamo differenze tissutali tra il rene e il fegato nell'espressione correlata al sesso/androgeno dei geni CYP e suggeriamo fortemente che esiste un fattore selettivo del tessuto responsabile dell'espressione correlata agli androgeni dei geni CYP. In futuro è necessaria la ricerca per identificare il fattore ospite genetico correlato al sesso e il fattore selettivo del tessuto responsabile della regolazione dei geni CYP. In ogni caso, poiché gli androgeni sono uno dei fattori ospiti che determinano i livelli di espressione di diversi CYP responsabili del metabolismo dei farmaci, si ritiene che la misurazione della concentrazione sierica di testosterone contribuisca allo sviluppo di un appropriato trattamento farmacologico individuale.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione per la ricerca scientifica della Società giapponese per la promozione della scienza (n. 19K06463, MK). Gli autori ringraziano la Tsukuba Operation Unit 7, Technical Support Center of Central Region, NARO, Tsukuba, Giappone per la cura degli animali e per la raccolta dei tessuti.
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