Soppressione del danno renale associato all'infiammazione post-trapianto utilizzando il nuovo spazzino di radicali liberi PrC-210 nei ratti
Mar 18, 2022
Torsten R. Goesch 1, Nancy A. Wilson2, Weifeng Zeng2, Bret M. Verhoven2, Weixiong Zhong2, Maya M. Coumbe Gitter3e William E. Fahl1,3,*
Astratto:
Allotrapiantorenetrapianto, che innesca il rigetto mediato dalle cellule e dagli anticorpi dell'ospiterene, è uno dei principali responsabili del danno renale durante il trapianto. Qui, abbiamo chiesto se la PRC-210 avrebbe soppresso il danno osservato nei trapianti di rene allotrapianto. I reni di ratto Brown Norway (BN) sono stati perfusi in situ (soluzione UW) con o senza aggiunta di 30 mM PrC-210 e quindi immediatamente trapiantati in ratti Lewis (LEW). 20 ore dopo, sono stati analizzati i reni BN trapiantati e il plasma LEWrat.Renel'istologia e i livelli sierici/renali di diverse citochine associate all'infiammazione sono stati misurati per valutare la patologia renale correlata al disadattamento e l'efficacia protettiva della PrC-210. Venti ore dopo i trapianti di allotrapianto: (i) sono stati osservati un danno istologico significativo del tubulo renale e un'infiltrazione di cellule infiammatorie mononucleate nei reni di allotrapianto; (ii)renele metriche funzionali (creatinina e BUN) erano significativamente elevate; (iii) sono stati osservati cambiamenti significativi nelle citochine chiave, cioè TIMP-1, TNF-alfa e MIP-3A/CCL20, e livelli di caspasi attivate dai reni. In reni e ratti riceventi trattati con PRC-210-, (i) il danno istologico renale (punteggi Banff) e l'infiltrazione mononucleare sono stati ridotti a livelli di fondo non trattati; (ii) creatinina e BUN erano significativamente ridotti; e (iii) le alterazioni della caspasi e delle citochine attivate sono state significativamente ridotte, alcune in secondo piano. In conclusione, i risultati suggeriscono che PrC-210 potrebbe fornire una protezione d'organo ampiamente applicabile per molte condizioni di trapianto allotrapianto; potrebbe proteggere i reni trapiantati durante e dopo tutte le fasi del processo di trapianto - dalla donazione di organi, attraverso il trasporto, il reimpianto e l'infiammazione postoperatoria - per ridurre al minimo il rigetto acuto e cronico.
Kehiwords: reneallotrapianto; rigetto renale; ischemia
Contatto:joanna.jia@wecistanche.com
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1. Introduzione
L'insufficienza renale allo stadio terminale provoca più di 1,2 milioni di decessi all'anno in tutto il mondo [1].Reneil trapianto è il trattamento preferito per i pazienti con malattia renale allo stadio terminale. Ogni anno in tutto il mondo vengono eseguiti oltre 90,{2}} trapianti di rene.
Il processo di trapianto, di per sé, induce significative lesioni cellulari e d'organo alrene, che riduce la sopravvivenza a lungo termine dell'organo. I tre insulti primari a un rene durante un trapianto di allotrapianto sono (i) il danno indotto da specie reattive dell'ossigeno e dell'azoto (ROS e RNS) durante l'ischemia fredda ("conservazione a freddo) [2], (ii) il danno indotto da ROS all'impianto ("danno da riperfusione") [3] e (iii) infiammazione post-allotrapianto-trapianto, che innesca la risposta immunitaria innata e il rigetto mediato da anticorpi (ABMR) [4].
Neutrofili e macrofagi migrano nel trapianto danneggiato entro 6 ore dalla riperfusione e stimolano la sintesi di chemochine nelle cellule dendritiche residenti che quindi attivano i linfociti T e reclutano cellule immunitarie adattative. Una volta che queste cellule immunitarie si infiltrano nelle cellule epiteliali del tubulo prossimale, producono mieloperossidasi nei neutrofili e nicotinamide adenin dinucleotide fosfato (NADPH) ossidasi nei macrofagi, che contribuiscono entrambi alla produzione locale di radicali liberi. Questi processi infiammatori portano all'attivazione della via del complemento e all'ulteriore rimodellamento e lisi cellulare nelreneallotrapianto [5]. L'ABMR può verificarsi come risultato di uno o entrambi gli alloanticorpi preformati contro l'innesto o attraverso lo sviluppo de novo di anticorpi donatori specifici (dnDSA) [5-7]. La risposta infiammatoria acuta (min/giorni), che passa a cronica (giorni/settimane), all'interno del rene allotrapianto, con produzione continua di ROS e citochine infiammatorie, può stabilire una risposta grave che si autoalimentareneinsufficienza d'organo.
Per comprendere meglio le vie cellulari e molecolari coinvolte nella patogenesi direneinfiammazione e rigetto dell'allotrapianto, abbiamo sviluppato e caratterizzato un modello di ratto che replica la maggior parte dei criteri clinici della risposta immunitaria innata, ABMR e perdita di organi renali [8]. Questo modello è stato utilizzato per valutare una serie di nuove strategie di trapianto post-allotrapianto.
I due approcci attualmente riconosciuti per ridurre la risposta immunitaria acuta ea lungo termine contro ilreneallotrapianto sono: (i) aumentare le possibilità di trovare un donatore incrociato e (ii) rimuovere gli anticorpi preesistenti contro ilreneallotrapianto utilizzando protocolli di desensibilizzazione [9,10].
Nel lavoro descritto in questo manoscritto, ci siamo chiesti se un terzo approccio per sopprimere la gravità dell'infiammazione acuta ea lungo termine sarebbe stato utile. Abbiamo somministrato lo scavenger di radicali liberi ad azione immediata, PRC-210, sia all'allotrapianto impiantatorenee al ratto ricevente, per determinare se il danno ROS associato all'infiammazione possa essere soppresso. Sebbene il concetto di soppressione della ROSin associata all'infiammazionereneil trapianto non è nuovo, l'uso qui del nuovo PRC-210 ROSscavenger ad azione immediata lo è. Scavenging immediato e cronico e inattivazione dell'infiammazione che genera e genera radicali liberi all'interno dell'allotrapianto appena trapiantatorenewould significantly enhance the existing strategies to suppress allograft rejection and would provide another pathway to reduce post-transplant kidney cell damage, and with it, suppress Delayed Graft Function to improve survival of the kidney allograft.PRC-210 is a new small-molecule, aminothiol, free radical scavenger [11]; it has no measurable nausea/emesis nor hypotension side effects [12]. Unlike traditional antioxidants that act indirectly over hours to days via NrF-2 to activate the expression of protective genes [13], PRC-210 directly scavenges ROS to confer 100% protection in seconds [11]. PRC- 210 was the most potent of the 13 commonly studied "antioxidants" screened in an assay that scored the ability of molecules to prevent x-ray-induced damage to naked DNA; the majority of the tested "antioxidants" showed no protection [14,15]. In a related essay, the addition of PrC-210 30 s before a 60 s pulse of •OH to naked DNA provided complete protection against the •OH insult that induced >95% di danno al DNA nei controlli non protetti [16]. In due precedenti studi sul trapianto renale di roditori [16,17], è stato dimostrato che la PRC-210 sopprime il danno renale indotto da ROS indotto durante (i) 30 ore di conservazione a freddo [17] e (ii) danno da riperfusione all'impianto [16 ] ai livelli di fondo, eliminando così due sostanziali fonti di danno ai reni trapiantati. È stato anche dimostrato che la molecola PRC-210 sopprime il danno indotto dai radicali liberi in molti altri organi [15,18]. Pertanto, abbiamo ipotizzato che PrC-210 dovrebbe anche essere in grado di proteggere un allotrapianto dallo stress ossidativo generato da ENTRAMBI (i) processi di rigetto mediati da cellule (i) e (ii) da anticorpi che producono radicali liberi come sottoprodotto.
Per esplorare questa ipotesi, abbiamo sviluppato un nuovo modello di ratto che evitava l'induzione di eventi ischemici e di riperfusione maggiori e somministrava PrC{0}} sia prima che dopo l'impianto. I reni di ratto marrone sono stati lavati con una soluzione UW contenente PrC-210 e immediatamente trapiantati in riceventi di ratto Lewis singenici. Il tempo ischemico freddo è stato praticamente eliminato. Immediatamente l'impianto successivo e per le 8 h successivereneimpianto, i ratti riceventi hanno ricevuto iniezioni sistemiche di PrC-210 a dosi che consentirebbero lo scavenging continuo dei radicali liberi all'interno del trapiantorene. I reni e il plasma sanguigno trapiantati sono stati quindi raccolti 20 ore dopo il trapianto per consentire la misurazione sia della PrC-210- conferita (i) alla soppressione dei sottoprodotti infiammatori e (ii)reneprotezione.
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2. Materiali e metodi
2.1. Animali
Ratti Lewis e BN maschi adulti (200–250 g) sono stati acquistati da Envigo (Indian-napolis, IN, USA) e ospitati nella struttura per la cura degli animali dell'Università del Wisconsin a Madison, WI, USA. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la Animal Care and Use Policies presso l'Università del Wisconsin. La manutenzione della salute degli animali, comprese le morti degli animali, la temperatura ambiente, i cicli di luce/buio di 12 ore e la pulizia della gabbia, tra le altre attività igienico-sanitarie, sono state eseguite quotidianamente dal personale addetto alla cura degli animali. Erano disponibili cibo e acqua a volontà. Questa ricerca è stata approvata in modo prospettico dalla School of Medicine and Public Health Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Wisconsin (Animal Protocol # M005204). Tutti i gruppi contenevano 4-6 animali.
2.2. Materiali
La sintesi dell'amminotiolo PrC-210 HCl, una molecola preclinica, è stata descritta separatamente [19,20]. I cristalli di PrC-210 HCl (3-(metilammino){5}}(metil monometil)propano-1- tiolo) sono conservati in atmosfera di azoto a -20 ◦C e anche con routine scongelamento, utilizzo e ri-conservazione, il PrC cristallino-210 è completamente stabile per più di 4 anni mediante analisi di spettrometria di massa. Altri reagenti chimici sono stati ottenuti da Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). UW Organ Preservation Solution è stata acquistata da Bridge to Life, Columbia, SC, USA.
2.3. Procedura chirurgica e sperimentale
La procedura di trapianto utilizzata in questi esperimenti è mostrata nella Figura 1. Nel ratto donatore BN, dopo la doppia legatura dell'aorta, la legatura dell'arteria e della vena renale destra e la sezione chirurgica della vena renale sinistra, il ratto sinistroreneè stato perfuso in situ utilizzando 5 ml di soluzione UW a temperatura ambiente (in un periodo di 15 s). Il perfusato era o la sola soluzione UW (per i gruppi "0 h" e "20 h Nessun trattamento"), o la soluzione UW a cui PrC cristallino-210, per ottenere 30 mM [17], era stato aggiunto, sciolto immediatamente e quindi aggiustato il pH al pH della soluzione UW iniziale di 7,4 aggiungendo 0,0619 µL di NaOH 5N per µmol di sale PrC-210 HCL (FW: 220). L'emivita di PrC-210 tiolo (forma attiva) è di circa 3,5 ore in soluzioni a pH fisiologico come la soluzione UW e sangue umano [14]. Dopo la perfusione in situ, il BN sinistroreneè stato rimosso chirurgicamente e quindi suturato mediante anastomosi smussata dei vasi e dell'uretere nel sito del rene sinistro lasciato libero del ratto ricevente LEW. Il giusto LEWreneè stato legato e rimosso immediatamente prima. Cinque minuti dopo la chiusura chirurgica del ratto LEW, il ratto ha ricevuto una dose sistemica di PrC{{0}} (121 ug PrC-210 HCl per gm di peso corporeo, che equivale a 0.24 X Dose massima tollerata) mediante iniezione intraperitoneale. Come mostrato nello schema della Figura 1, il ratto ha ricevuto anche dosi di iniezione intraperitoneale di PrC-210 (0,24 MTD) a più 4 ore e più 8 ore dopo il trapianto. I ratti sono stati sottoposti a eutanasia a più 20 ore dopo il trapianto erenie campioni di plasma sono stati raccolti per l'analisi. C'erano un minimo di cinque ratti in ciascun gruppo di trattamento.
2.4. Siero BUN e misurazioni della creatinina
BUN e creatinina sono stati misurati in campioni di siero utilizzando Catalyst One AnalyzerTechnology (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA).
2.5. Saggi di immunoassorbimento enzimatico
I test sono stati eseguiti come descritto nei protocolli del kit ELISA (Rat TIMP-1, Cat# RTM- 100; Rat MIP3-A, Cat# DY540; Rat TNF-alpha, Cat# RTA{ {5}}; Sistemi di ricerca e sviluppo, Minneapolis, MN, USA). Brevemente, diluizioni di plasma di ratto sono state aggiunte a piastre prerivestite, incubate per 2 ore a 37 О C. l'anticorpo coniugato con biotina specifico per la proteina saggiata è stato quindi aggiunto e incubato per 1 ora a 37 О C, lavato, coniugato con avidina è stata aggiunta perossidasi di rafano, seguita da lavaggio e aggiunta di substrato TMB. La reazione è stata incubata per 10-30 minuti, fermata con acido solforico e letta a 450 nm.
2.6. Proteome Profiler Rat Cytokine Array
I test sono stati eseguiti essenzialmente come descritto nel protocollo del prodotto. Brevemente, il plasma è stato incubato con membrane di nitrocellulosa macchiate con anticorpi di cattura e controllo. Dopo l'incubazione, le membrane sono state lavate e incubate con streptavidina HRP. In una deviazione dal protocollo, abbiamo utilizzato SuperSignal West Femto (ThermoFisher, Madison, WI, USA; Cat# 34094) per il rilevamento della chemiluminescenza, poiché forniva un segnale più forte. Le macchie sono state visualizzate su un sistema di gel doc FotoDyne.
2.7. Istologia
Fissato in formalina (10 percento di formalina), incluso in paraffina,renisono stati tagliati in sezioni da 5 um. I vetrini sono stati deparaffinati, reidratati da xilene attraverso una serie di etanolo graduato ad acqua e successivamente trattati come descritto di seguito. I vetrini sono stati scansionati utilizzando un obiettivo 20- in uno scanner per vetrini di patologia digitale Aperio. Tutti i vetrini H&E sono stati esaminati dal Dr. Weixiong Zhong, MD, PhD, patologo dei trapianti e valutati per PTC, glomerulite (g), vasculite (v)/arterite intima, infiammazione interstiziale (I) e colorazione C4d, secondo Banff 2009 [21].
Separatamente, ai vetrini è stato assegnato un numero in cieco e sono state acquisite immagini digitali non sovrapposte dei tubuli renali all'interfaccia tra il midollo e la corteccia da ciascun vetrino H/E. È stata prestata attenzione a non includere lumi e glomeruli dei vasi di grandi dimensioni. Quantificazione automatizzata dei pixel rossi e blu in ogni 10-renel'immagine è stata eseguita utilizzando una macro personalizzata scritta nel software ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html
accesso il 13 aprile 2021). I pixel rossi riflettevano lo spessore del tubolare prossimale, compreso il bordo del pennello. I nuclei sono stati quantificati nel canale blu. Il rapporto tra pixel nucleari blu e tubuli rossi ha fornito un punteggio di infiltrazione infiammatoria per l'infiltrazione di globuli bianchi nel post-trapiantoreni. I punteggi sono stati mediati e tracciati utilizzando Graphpad Prism.
2.8. Attivazione dell'attività enzimatica della caspasi
Attivata l'attività delle caspasi 3 e 7 inrenei supernati omogenati sono stati determinati utilizzando il substrato fluorescente Apo-ONE (Promega, Madison, WI, USA) [16]. Brevemente, scongelatorenisono stati miscelati con 8- tampone di lisi in eccesso contenente 50 mM Na HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 10 percento di glicerolo e omogeneizzati a 4 О C per 30 s con un omogeneizzatore di tessuti Omni . L'omogeneizzato renale è stato centrifugato a 4ОC (16,{12}} g) in una microcentrifuga Eppendorf per 20 min. I supernati sono stati immediatamente analizzati per l'attività della caspasi e il contenuto proteico con il metodo Bradford utilizzando l'albumina sierica bovina come standard. Il test della caspasi attivata è stato eseguito come segue: 5 ul di surnatante (~ 40 ug di proteina surnata) sono stati diluiti a un volume totale di 50 ul con il tampone di lisi sopra, sono stati mescolati con 50 ul di substrato Apo-ONE non diluito nel pozzetto di una piastra nera, opaca, a 96 pozzetti per avviare la reazione di 60 min. Le piastre sono state agitate a 200 RPM a 37 О C per 60 min. La scissione del peptide del substrato della caspasi DEVD è stata misurata utilizzando un lettore di piastre fluorescenti BMG Clariostar a una lunghezza d'onda di eccitazione di 499 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 521 nm. Uno standard di caspasi è stato incluso in ogni esperimento.
2.9. Mitocondri del rene di ratto
La frazione mitocondriale purificata è stata preparata da ratto omogeneizzatorenimediante una tecnica di centrifugazione standard [22]. I mitocondri purificati sono stati sospesi in tampone 0.15 M Tris HCl, pH 7,4.
Per determinare se l'aggiunta di PrC esogena{{0}} sopprime la frammentazione indotta da ROS del DNA mitocondriale [22], in un volume di reazione di 25 ul (in una provetta per PCR), abbiamo aggiunto: 1{{29} } Mitocondri purificati ul, diluizione 5 ul PrC-210 o acqua (PrC-210 è stato aggiunto 10 minuti prima del generatore Fe plus plus plus ADP plus H2O2 ●OH) e 10 μl contenenti FeCl2 (2,5 mM; FW:127), adenosina 5'-difosfato sale sodico (10 mM; FW: 427) e H2O2 (0,003 percento di concentrazione finale). Dopo 20 minuti a 37 ОC, 10 ul della reazione sono stati miscelati con 5 ul di 6- colorante di caricamento del gel contenente lo 0,3% di SDS; le provette sono state lasciate in acqua a 60 ОC per 1 minuto, 10 ul sono stati quindi caricati in un pozzetto di un gel TAE di agarosio all'1% e dopo 60 minuti a 60 volt, i gel sono stati colorati e fotografati. Sono stati eseguiti almeno tre replicati per ciascun punto di analisi per consentire il confronto statistico.
2.10. Analisi statistica
I dati sono espressi come mezzo più /一 STD. I test t di Student sono stati utilizzati per determinare la differenza statistica e i valori p utilizzando il software GraphPad Prism 7.03. valori p inferiori a 0,05 sono stati considerati significativi.
3. Risultati
3.1. PrC-210 Soppressione della patologia dell'allotrapianto renale
A 20 h dopo il trapianto, l'istologia del BN trapiantatoreni(Figura 2A-D) trattata con la sola soluzione UW ha mostrato chiaramente un aumento dei punteggi Banff per la tubulite e la capillare peritubulare (frecce rosse e gialle); i punteggi di patologia sommati sono riportati nel pannello E. BNreniperfuso con PrC{{0}}contenente UW Solution e ricevendo dosi sistemiche intraperitoneali post-impianto di PrC-210 (Figura 2D) ha mostrato una patologia infiammatoria chiaramente soppressa al rene e punteggi Banff soppressi per tubulite e peritubulare capillarite uguale ai punteggi Banff del gruppo BN di controllo "0 h" (Figura 2E). La somministrazione di PrC-210 ha conferito riduzioni significative sia dei marker di danno renale della creatina (p=0.032) che del BUN (p=0.046).
3.2. Livelli di caspasi attivati nei reni post-trapianto
Livelli di caspasi attivata in BNrenegli omogenati erano significativamente ridotti nell'allotrapianto BNreniche non sono stati esposti al trattamento con PrC{{0}} durante le 20 ore successive al trapianto (Figura 5). La perfusione di reni BN con PrC-210-contenente UW Solution e il trapianto in ratti Lewis che hanno ricevuto dosi sistemiche di PrC-210 hanno determinato la stessa attività della caspasi attivata di quella osservata nei reni di controllo "0 h".
3.3. Livelli di citochine infiammatorie dopo allotrapianto renale BN
Negli esperimenti di screening,reneomogeneizzato surnata da 0 h controlli e 20 h senza trattamentorenisono stati sottoposti a screening con l'array di citochine Proteome Profiler 29 per rilevare livelli di espressione di citochine e chemochine alterati, associati all'infiammazione 20 ore dopo il trapianto. Come mostrato nei due riquadri di microarray della Figura 6, sono state osservate modifiche in TIMP-1, TNF-alpha e MIP-3a/CCL20. Le singole piastre ELISA sono state quindi utilizzate per quantificare questi cambiamenti negli omogenati renali e nei sieri, inclusi ora anche i ratti trattati con PrC-210. Sia i livelli di TIMP-1 che di TNF-alfa sono aumentati 20 ore dopo il trapianto e, in entrambi i casi, i loro livelli sono diminuiti in presenza di PrC-210 (Figura 6A–C). I livelli di MIP-3a/CCL20 sono aumentati a 20 ore, ma sono aumentati notevolmente nei ratti trattati con PrC-210-(Figura 6D).
3.4. PrC-210 Protezione dei mitocondri del rene di ratto
Funzione mitocondriale sostenuta durante e doporeneil trapianto è necessario per la sopravvivenza dell'organo trapiantato. I ROS generati durante l'ischemia associata al trapianto, l'ischemia-riperfusione e l'infiammazione post-impianto possono influenzare le prestazioni e la sopravvivenza dei mitocondri renali. A causa dell'importante ruolo mitocondriale, abbiamo isolato i mitocondri dai reni di ratto e determinato se PrC-210 a concentrazioni farmacologiche ottenibili potrebbe proteggere questi organelli da un insulto ROS.
Nella Figura 7, ratto purificatorenei mitocondri sono stati incubati con un generatore di ●OH [23]. Dopo la breve reazione, abbiamo visto una significativa frammentazione dei ROS del DNA mitocondriale del rene di ratto. Dopo l'insulto ROS, un'aliquota dei mitocondri è stata solubilizzata in un tampone di caricamento del gel contenente SDS e il DNA mitocondriale è stato separato e "dimensionato" utilizzando la cromatografia su gel di agarosio (Figura 7). L'insulto ROS ha chiaramente ridotto la dimensione media del DNA mitocondriale del rene di ratto (corsia b) e l'aggiunta di PrC-210 ai mitocondri ha impedito la rottura del DNA (corsie c–g) in un PrC-210 modo dipendente dalla concentrazione.
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4. Discussione
Allotrapiantoreneil trapianto, che innesca il rigetto innato del rene da parte delle cellule e degli anticorpi dell'ospite, è un importante contributo al breve e lungo terminerenedanno durante il trapianto e la funzione ritardata dell'innesto associata è osservata fino al 50% dei reni trapiantati. Abbiamo intrapreso questo studio per determinare se PrC-210 sarebbe efficace nel sopprimere la gravità del danno indotto a seguito di un trapianto di rene allotrapianto in un modello di ratto che elimina in gran parte il tempo ischemico del trapianto e il suo stress ossidativo associato. La nostra ipotesi era che questo approccio dovrebbe permetterci di vedere l'impatto della PrC-210 sull'insulto infiammatorio post-trapianto con una minima interferenza dell'ischemia.
L'aumento del TNF-alfa e la sostanziale infiltrazione mononucleare dimostrano che il trapianto di rene allotrapianto induce un'infiammazione acuta pronunciata nelle 20 ore successive al trapianto, e questo è stato correlato al danno delle cellule tubulari renali osservato nelreneistologia (punteggi Banff). Il TNF-alfa è prodotto principalmente dai macrofagi attivati ed è una proteina di segnalazione cellulare coinvolta nell'infiammazione acuta. È strettamente associato alla patogenesi del rigetto acuto e cronico dell'allotrapianto [24].
In contrasto con i risultati di cui sopra nel BN non trattatoreni, PrC-210 somministrato come parte della soluzione UW e somministrato per via sistemica nei ratti post-trapianto ha ridotto sia il livello di TNF-alfa che l'infiltrazione renale da parte delle cellule mononucleate, che sono entrambi segni di ridotta infiammazione acuta. PrC-210 ha ridotto il danno renale come si vede nei punteggi istologici del danno renale (punteggi Banff) a livelli di fondo non trattati e ha abbassato i livelli di entrambi i punteggi funzionali della patologia renale, creatinina e BUN.
L'infiammazione nei reni BN non trattati è stata associata a un aumento sia di TIMP-1 che di MIP-3A/CCL20. In confronto, abbiamo visto che il trattamento con PrC-210 ha ridotto significativamente il livello di TIMP-1 e ha aumentato significativamente il livello di MIP-3A/CCL20.
L'inibitore tissutale della metalloproteinasi-1 (TIMP-1) è un importante regolatore della sintesi e della degradazione della matrice extracellulare (ECM). L'eccesso di accumulo di ECM è il principale meccanismo patologico dello sviluppo della fibrosi durante e dopo un danno renale acuto. Non esiste essenzialmente alcuna espressione di TIMP-1 nella normarenetessuto [25], un'osservazione che è corroborata nella nostra Figura 6A, B, ma è noto che TIMP-1 è espresso nei reni feriti, principalmente nelle cellule epiteliali tubulari renali, nella membrana basale tubulare renale e nel citoplasma dell'interstiziale cellule. L'aumento dell'espressione di TIMP-1 era positivamente correlato al deterioramento simultaneo della funzione renale [26]. I ratti trattati con PrC-210 hanno mostrato una profonda riduzione dei livelli di TIMP-1 (p=0.001), sia nell'omogenato renale che nel plasma; ciò implica che PrC-210 esercita un forte effetto protettivo contro la riorganizzazione indotta dal trapianto della matrice extracellulare del rene.
La chemochina MIP-3a/CCL20 attiva il recettore CCR6, espresso soprattutto sui linfociti T regolatori (Treg). CCL20 è espresso dalle cellule endoteliali e interstiziali tubulari ed è anche sovraregolato nei reni con danno renale acuto. Il percorso CCL20-CCR6 svolge un ruolo vitale nel reclutamento delle cellule T mediato da Treg nel rene e le Treg sono state descritte per avere un ruolo positivo nelreneriparazione, tolleranza al trapianto e sopravvivenza renale. Sia il blocco anticorpale della via CCL20-CCR6, sia l'uso di topi con deficit di CCR6- in pazienti acutireneesperimenti di lesioni, hanno dimostrato di aumentare la gravità dell'insufficienza renale e la mortalità [27]. Ciò suggerisce che clinicamente, il miglioramento del percorso CCL20-CCR6 e l'attivazione di Treg possono essere una possibile via terapeutica per limitare l'acuto e il cronicorenelesione [28]. Nel nostro studio (Figura 6D), il livello di MIP-3a/CCL20 era significativamente più alto nei ratti trattati con PrC-210- rispetto ai ratti non trattati. Ipotizziamo che questo sia uno dei motivi sia del (i) reclutamento significativamente più basso di cellule mononucleate nei reni (Figura 3C) sia (ii) del danno renale significativamente ridotto (Figura 2) nei ratti trattati con PrC-210- .
La normale funzione mitocondriale renale e, soprattutto, insulti ad esso durante le fasi di conservazione, impianto e infiammazione post-impianto del rene sono determinanti significativi del danno ROS e dell'insufficienza renale durante il trapianto. È stato quindi significativo che PrC-210 abbia dimostrato di conferire la completa soppressione della frammentazione del DNA mitocondriale (Figura 7) a concentrazioni (2–4 mM) che sono state raggiunte nel plasma di topi e ratti a cui è stato somministrato per via intraperitoneale o per via sistemica orale 0.5 dosi MTD di PrC-210 che sono state tollerate senza tossicità rilevabili [29].
Nei nostri precedenti studi relativi al trapianto di rene [16,17], abbiamo visto aumenti sostanziali della caspasi attivata nei reni esposti a lesioni da "ischemia fredda" e "ischemia-riperfusione". Questi insulti ai reni indotti dall'ischemia sono stati ridotti in secondo piano dal trattamento con PrC-210 (Figura 8). Negli studi di questo manoscritto (Figura 5), in cui l'ischemia fredda e l'ischemia-riperfusione sono state essenzialmente eliminate mediante trapianto immediato, non vi è stato alcun aumento della caspasi attivata nei reni trapiantati. Piuttosto, la caspasi attivata è stata significativamente ridotta a più 20 ore nei controlli "Nessun trattamento farmacologico" e il trattamento con PrC-210 ha eliminato completamente questa riduzione della caspasi nei ratti a più 20 ore e ha mantenuto stabile il livello di caspasi. La nostra interpretazione di questi interessanti risultati è che in assenza di un significativo insulto di radicali liberi indotto dall'ischemia attraverso ROS e RNS al post-trapiantoreni, non vi sono marcatori di morte cellulare e apoptosi associati come le caspasi attivate. Piuttosto, in questi trapianti di rene allotrapianto, i segnali infiammatori provenienti da cito- e chemochine appena espresse regolano ora il metabolismo cellulare, che include l'influenza sulla via dell'apoptosi. La letteratura descrive che la sovraespressione di TIMP-1 porta alla soppressione dell'apoptosi [26]. I nostri risultati sulla caspasi (Figura 5) supportano questo effetto TIMP-1 descritto e implicano che TIMP-1 è importante nella regolazione della fisiopatologia del danno cellulare dopo il trapianto di rene allotrapianto. A conferma della precedente soppressione di PrC-210 dell'espressione TIMP-1 (Figura 6A, B), il trattamento con PrC-210 ha completamente ablato il cambiamento della caspasi, mantenendo i livelli di caspasi allo stesso livello visto in i reni di controllo "{10}} h". Poiché i ridotti livelli sierici di PrC-210 TIMP-1 a più 20 h (Figura 6B) riflettono accuratamente la significativa soppressione dell'allotrapianto: (i) apoptosi (Figura 5), (ii) patologia istologica (Figure 2 e 3) e (iii) infiltrazione di cellule infiammatorie (Figura 3), prevediamo che il monitoraggio dei livelli sierici di TIMP-1 nei riceventi di allotrapianto di rene umano sarà un modo logico per monitorare l'efficacia clinica della PrC-210 nei futuri studi clinici .
Nel nostro lavoro fino ad oggi [16,17], abbiamo dimostrato che PrC-210 è in grado di proteggere i reni trapiantati sia dagli insulti da ischemia fredda che da ischemia-riperfusione. In questo studio, ora vediamo che PrC-210 protegge anche i reni allotrapianti dagli insulti infiammatori non ischemici che si verificano dopo l'impianto renale. PrC-210 riduce significativamente i livelli di citochine infiammatorie acute, come il TNF-alfa, e sopprime l'espressione della chemochina TIMP-1. Entrambi questi eventi, e potenzialmente ulteriormente supportati da un'ulteriore espressione di CCL20, dovrebbero: (i) ridurre il danno renale da allotrapianto, (ii) sopprimere il reclutamento di cellule T nel rene e (iii) sopprimere l'attivazione dell'innato e sistema immunitario adattativo. Nella Figura 8, riassumiamo questi risultati per supportare il ruolo che riteniamo possa svolgere PrC- 210 nel trapianto di rene umano; sopprime: (i) il danno allo sfondo delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) e delle specie reattive dell'azoto (RNS) per l'ischemia fredda [17],
(ii) danno da ischemia-riperfusione ROS allo sfondo [16], e (iii) danno infiammatorio da allotrapianto sostanzialmente, in alcuni casi, allo sfondo. Poiché il meccanismo d'azione principale della PrC-210 per la PrC-210 è lo scavenging dell'ossigeno e dei radicali liberi dell'azoto, ciò implica che questi radicali liberi contribuiscono in modo importante al danno renale osservato in condizioni non ischemiche, ad es. l'infiammazione associata all'allotrapianto studiata in questo manoscritto.
In sintesi, ciò suggerisce che PrC-210 potrebbe fornire una protezione d'organo ampiamente applicabile per molte condizioni di trapianto di allotrapianto; potrebbe proteggere i reni trapiantati durante e dopo tutte le fasi del processo di trapianto, dalla donazione di organi, al trasporto, al reimpianto e all'infiammazione postoperatoria, per ridurre al minimo il rigetto acuto e cronico.
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Contributi dell'autore:NAW, WZ (Weifeng Zeng), WZ (Weixiong Zhong), BMV e MMCG hanno partecipato allo svolgimento della ricerca e dell'analisi dei dati; TRG e NAW hanno partecipato alla progettazione della ricerca e all'analisi dei dati; WEF e TRG hanno partecipato alla progettazione della ricerca, all'esecuzione della ricerca, all'analisi dei dati e alla stesura del documento. Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.
Finanziamento:Questa ricerca è stata finanziata dall'UW Institute for Clinical and Translational Research e ha concesso UL1TR002373 all'UW ICTR da NIH/NCATS, American Society of Transplant Surgeons (133 AAA1552), American College of Surgeons (133 AAB2176) e concede supporto al WEF (# R03CA176799).
Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale: questa ricerca è stata approvata in modo prospettico dalla School of Medicine and Public Health Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università del Wisconsin (Animal Protocol # M005204).
Dichiarazione sulla disponibilità dei dati:I dati dello studio sono completamente disponibili all'interno di questo manoscritto. Conflitti di interesse: Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
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