Effetto sinergico di pigmentazione anti-pelle dei glicosidi feniletanoidi cistanche e glabridina

Astratto per indagare sul sinergicoEffetto di cistancheSide di etanolo fenil (PHGS) e glabridina (GLA) contro la pigmentazione della pelle, il rapporto di massa di PHGS e GLA è stato proiettato dall'esperimento di inibizione della tirosinasi in vitro, 1, 1- difenil -2- Trinitrophenilidrazina (dpph) ed) 2, 2- diazo-bis (3- etil-benzotiazolo -6- acido solfonico Diammonio cationico (ABTS+) Free Radical Scavenging Experiments. indici.

ILinfiammatorioÈ stato stabilito il modello di cellule HACAT indotte dal lipopolisaccaride (LPS) e l'effetto antinfiammatorio del farmaco è stato valutato inibendo il rilascio di interleuchina -6 (il -6) e il fattore di necrosi tumorale (TNF-). Il modello di stress ossidativo delle cellule HACAT indotte dall'azodiisobuamidina cloridrato (AAPh) è stato ulteriormente stabilito e l'attività migliorata della superossido dismutasi (SOD) e della catalasi (CAT) è stata utilizzata come indici per valutare l'effetto antiossidante del farmaco. Il rapporto di massa ottimale di PHG e GLA è stato determinato dai tre modelli di cellule sopra. I risultati hanno mostrato che le soluzioni acquose di PHGS/GLA (1∶1), PHGS/GLA (5∶1) e PHGS/GLA (10∶1) sono state preparate con M (PHGS) ∶M (GLA) =1 ∶1, 5∶1, 10∶1 hanno mostrato un buon inibitorio ed effetti sinergici sull'attività della tirosinasi e I tassi di inibizione di PHGS/GLA (1∶1),
PHGS/GLA (5∶1) e PHGS/GLA (1 0 ∶1) soluzioni acquose con una concentrazione di massa di 0,4 g/L erano rispettivamente 94,37%, 92,93%e 88,06%. I tassi di evacuazione dei radicali liberi DPPH erano rispettivamente dell'89,44%, 88,72,%e 88,10%.
I tassi di scavenging dei radicali liberi ABTS+ erano 1 0 0,13%, 100,0,1%e 99,87%, rispettivamente. Quando la concentrazione di massa di PHGS/GLA era 25 UG/mL, PHGS/GLA (1∶1), PHGS/GLA (5∶1) e PHGS/GLA (10∶1) soluzioni acquose non hanno mostrato citotossicità alle cellule B16F10 e HACAT. L'inibizione dell'attività della tirosinasi nella soluzione acquosa PHGS/GLA (1 ∶1) era più forte (attività tirosinasi 23,80%) e il contenuto di melanina (30,90%) era significativamente ridotto. La soluzione acquosa PHGS/GLA (1∶1) ha mostrato il miglior effetto di inibizione sul rilascio di IL -6} e TNF e la capacità di migliorare l'attività di SOD e CAT. La combinazione di PHG e GLA ha mostrato buone prestazioni sinergiche, superiori a un farmaco singolo e superiore a PHGS/ GLA (5∶1) e PHGS/ GLA (10∶1) soluzione acquosa. La combinazione di PHG e GLA ha svolto un ruolo sinergico nel migliorare la pigmentazione cutanea inibendo la produzione di melanina ed effetti antinfiammatori e antiossidanti.

 

Parole chiave cistanche glicosidi feniletanoide; glabridina; effetti sinergici; pigmentazione anti-pelle; antiossidazione; antinfiammatorio; Materiali farmacologici

 

 

 

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La pigmentazione della pelle è una malattia della pelle causata da fattori come lesioni, infiammazione della pelle e radiazione ultravioletta [1-2]. Questi fattori possono portare a un aumento anormale della melanina, che a sua volta provoca problemi come cloasma, lentiggini e iperpigmentazione post-infiammatoria (PIH) [3-4], che colpiscono lo stato mentale delle persone e la qualità della vita. Al momento, il trattamento della pigmentazione cutanea si concentra principalmente sull'inibizione della tirosinasi, un enzima chiave nella formazione di melanina [5-6].
L'ultima ricerca [7-8] mostra che la pigmentazione della pelle dipende dalla stretta connessione tra cheratinociti e melanociti nell'epidermide. Una volta che i radicali liberi e i fattori infiammatori rilasciati dai cheratinociti entrano in contatto con i melanociti, induceranno un aumento dell'attività della tirosinasi, portando ad un aumento del contenuto di melanina. Accelereranno anche il trasporto di melanina e farà depositare la melanina sulla superficie della pelle. Pertanto, il trattamento della pigmentazione della pelle richiede una varietà di misure come l'inibizione della produzione di melanina, antinfiammatoria e anossidazione.

Al momento, sebbene i preparativi tradizionali sui farmaci, come l'idrochinone e l'idrochinone, abbiano alcuni effetti nel trattamento della pigmentazione della pelle, le loro modalità di azione sono relativamente singole e possano produrre reazioni avverse [9-10]. In confronto, le medicine naturali sono naturali e lievi in ​​vigore e sono sempre più riconosciute e elogiate dai consumatori [11-12]. In particolare, la combinazione di più estratti vegetali [13-14] non può solo inibire la produzione di melanina, ma ha anche più effetti come effetti antinfiammatori e antiossidanti, fornendo nuove idee e metodi per il trattamento della pigmentazione della pelle.
Cistanche Deserticola MA ha un valore medicinale unico ed è noto come "Desert Ginseng". Studi hanno scoperto che il caratteristico glicoside feniletanoide contenuto in cistanche ha una buona attività antiossidante [15] ed effetti antinfiammatori [16] e ha anche un certo effetto inibitorio della tirosinasi [17]. La glicerrizina è una componente flavonoide in Glycyrrhiza glabra L., che ha un potente effetto sbiancante ed è noto come "oro sbiancante" [18]. Il trattamento tradizionale in medicina cinese della pigmentazione cutanea di solito inizia la stretta per la milza e i reni, eliminando il calore e disintossicante e reintegendo Qi e sangue [19].
I glicosidi feniletanolica della cistanche deserticola possono reintegrare lo yang renale e beneficiare essenza e sangue, mentre Glycirrhiza glabra può reintegrare la milza e il Qi, cancellare il calore e disintossicare. I due possono lavorare insieme per resistere alla pigmentazione. La combinazione di glicosidi di fenilenoidec di cistanche deserticola e glabridina può resistere alla pigmentazione della pelle da più dimensioni e bersagli, proteggere dai raggi ultravioletti nell'intera banda, inibire lo stress della titosinesi e ridurre la produzione di melamanasi e ridurre la produzione di melanasi e la produzione di melanesi e regolare la produzione di melamani e ridurre la produzione di melanasi e la produzione di melanesi e regolare la produzione di melanesi e la produzione di melamani. Tuttavia, ci sono pochi rapporti in letteratura sull'inibizione sinergica della pigmentazione della pelle da parte di glicosidi feniletanoidi di cistanche deserticola e glabridina.
Questo documento intende esplorare se esiste un effetto sinergico tra ppfeniletanoidglicosidi di cistanche deserticola (PHG) e glabridina (GLA) attraverso esperimenti biochimici in vitro e la creazione di 3 modelli cellulari, ND ottengono il rapporto di massa composti ottimale per un effetto sinergico. Si prevede che fornisca supporto teorico e guida pratica per lo sviluppo di prodotti naturali per la cura della pelle delle piante e per aiutare a promuovere l'industria della cura della pelle a svilupparsi in una direzione più naturale, sana ed efficiente.

 

 

Dove: una reazione è l'assorbanza della soluzione campione, della soluzione di L-tirosina, della soluzione di PBS e della tirosinasi; Un controllo di reazione è l'assorbanza della soluzione del campione, della soluzione L-tirosina, della soluzione N e PBS; Un vuoto è l'assorbanza della soluzione L-tirosina, della soluzione PBS e della soluzione di tirosinasi; Un controllo in bianco è l'assorbanza delle soluzioni L-tirosina e PBS.

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1.3.2 Determinazione della capacità di scavenging dei radicali liberi DPPH

Innanzitutto, valutare accuratamente {{0}}. 0 197 G (0. 0 5 mmol) di dpph e dissolverlo in 25 0 ml di etanolo anidro per preparare una soluzione funzionante con una concentrazione di {} {13}. mmol/l. Quindi, PHGS e GLA sono stati preparati nella soluzione di etanolo PHGS e nella soluzione di etanolo GLA con concentrazioni di massa di 0. 0 01, 0,01, 0,1, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0 mg/ml utilizzando il 50% di etanolo per volume e la soluzione di Ethanol è stata preparata in modo stesso. Quindi, la soluzione di etanolo PHGS e la soluzione di etanolo GLA sono stati miscelati uniformemente con M (soluzione PHGS) ∶ M (soluzione GLA)=40 ∶1, 20∶1, 10∶1, 5∶1, 1∶1, 1∶5, 1∶10, 1∶20, 1∶40 per ottenere 9 tipi di PHGS/GLA ETHANOL SOLUZIONI con diversi rapporti di massa, che sono stati registrati in PHMS/PHO (40∶1) ~ PHGS/GLA (1∶40) Soluzioni di etanolo. Infine, aggiungi 100 μL di diverse soluzioni campione e 100 μL di soluzione di lavoro DPPH alla piastra di pozzo 96-, mescola bene e tieni lontano dalla luce a temperatura ambiente per 30 minuti. Misurare l'assorbanza a 517 nm con un marcatore enzimatico. Il VC è stato usato come controllo positivo e ogni esperimento è stato ripetuto 3 volte. Calcola il tasso di scavenging dei radicali liberi DPPH (%) secondo la formula (2).
Tasso di eliminazione dei radicali liberi DPPH/%=(1 −𝐴1 - 𝐴3𝐴2) × 100 (2) dove: A1 è l'assorbanza della soluzione campione + soluzione di lavoro DPPH; A2 è l'assorbanza del 50% di etanolo per volume + soluzione di lavoro DPPH; A3 è l'assorbanza della soluzione di esempio + 50% etanolo per volume.

1.3.3 Determinazione di ABTS+ Capacità di eliminazione dei radicali liberi

Innanzitutto, pesare 1 g (1,82 mmol) di ABTS e dissolverlo in acqua deionizzata per preparare una soluzione di lavoro ABTS con una concentrazione finale di 7,4 mmol/L; Pesare 0. 5 g di persolfato di potassio e dissolverlo in acqua deionizzata per preparare una soluzione di lavoro del persolfato di potassio con una concentrazione finale di 2,6 mmol/L; Mescola la soluzione di lavoro ABTS e la soluzione di lavoro del persolfato di potassio in volumi uguali e reagisci per 12 ore al buio per preparare la soluzione di lavoro ABTS+. Quindi, secondo il metodo nella Sezione 1.3.2, preparare la soluzione di etanolo PHGS, soluzione di etanolo GLA, soluzione di etanolo N e VC, nonché PHGS/GLA (40∶1) ~ PHGS/GLA (1∶40) Soluzione di etanolo.
Infine, aggiungi 40 μl di diverse soluzioni campione e 160 μl di soluzione di lavoro ABTS+ alla piastra di pozzo 96-, mescola bene, reagisci a temperatura ambiente al buio per 6 minuti e misura l'assorbanza della soluzione a 734 nm usando un lettore ELISA. Calcola il tasso di evacuazione dei radicali liberi ABTS+ (%) secondo la formula (3).

 

Dove: A1 è l'assorbanza della soluzione campione + ABTS + soluzione di lavoro; A2 è l'assorbanza dell'acqua deionizzata + ABTS + soluzione di lavoro; A3 è l'assorbanza della soluzione campione + acqua deionizzata.

 

1.4 Esperimento cellulare

1.4.1 Coltura cellulare

Dopo che le cellule B16F10 e HACAT vengono rianimate, vengono inoculate in mezzo ad alto glucosio DMEM (contenente una miscela di siero bovino fetale al 10% e 1% di penicillina-streptomicina da una frazione di massa) e coltivata in un incubatore a 37 gradi, frazione di volume della Co2 del 5% e 70% di umidità per 24 h. Lo stato di crescita cellulare è osservato al microscopio e il mezzo viene sostituito o sottoculturato in base allo stato di crescita cellulare.

 

1.4.2 Raggruppamento sperimentale

Le cellule B16F10 e HACAT nella fase di crescita logaritmica sono inoculate in piastre di pozzo 96- con numero di celle appropriate e coltivate per 24 ore per consentire alle cellule di aderire al muro. Soluzioni campione di diverse concentrazioni di massa vengono preparate utilizzando un terreno di coltura DMEM. Il gruppo normale, gruppo modello, gruppo PHGS a basso dosaggio (125 ug/ml), gruppo PHG a media dosi (250 ug/ml), gruppo PHG ad alte dosi (500 ug/ml), gruppo a basso dosaggio (gruppo UG/ml) a basso dosaggio (25 ug/ml) (1∶1) Gruppo, Gruppo PHGS/GLA (5∶1) e GRUPPO PHGS/GLA (10∶1) Gruppo di coltura.

Nel modello di pigmentazione B16F10 indotto da UVB, le cellule del gruppo modello sono state aggiunte con 30 μl di PBS (pH =7. 4) e posizionate 3 cm direttamente sotto l'irradiatore UVB per 110 s; Il gruppo sperimentale è stato pretrattato con 100 μL di soluzioni campione di diverse concentrazioni di massa per 1 ora, quindi aggiunto con 30 μL di PBS e collocato 3 cm direttamente sotto l'irradiatore UVB per 110 s; Il gruppo normale ha sempre usato il terreno di coltura DMEM ad alto glucosio; Il gruppo vuoto non era inoculato con le cellule, ma con una quantità uguale di terreno di coltura.

Nel modello di infiammazione delle cellule HACAT indotta da LPS, il gruppo modello è stato coltivato con soluzione PBS di LPS ad una concentrazione di 20 ug/mL per 24 ore; Il gruppo sperimentale è stato pretrattato con 100 μL di soluzioni campione di diverse concentrazioni di massa per 24 ore e quindi aggiunto con 20 soluzione LPS UG/mL per 24 ore; Il gruppo normale ha sempre usato il mezzo DMEM ad alto glucosio; Il gruppo vuoto non era inoculato con le cellule, ma con una quantità uguale di terreno di coltura.

Nel modello di sollecitazione ossidativa delle cellule HAAPH indotta da AAPH, il gruppo modello è stato coltivato con una soluzione AAPH (2,5 mmol) da 100 mL a una concentrazione di 25 mmol/L per 24 ore; Il gruppo sperimentale è stato pretrattato con soluzioni campione da 100 μl di diverse concentrazioni di massa per 24 ore e quindi aggiunto con soluzione AAPh ad una concentrazione di 25 mmol/L per 24 ore; Il gruppo normale ha sempre usato il mezzo DMEM ad alto glucosio; Il gruppo vuoto non era inoculato con le cellule, ma con una quantità uguale di terreno di coltura.

Ogni gruppo è stato impostato con 3 pozzi replicati e coltivato in un incubatore a 37 gradi, 5% di frazione di volume di CO2 e umidità del 70%.

1.4.3 Tosaggio di citotossicità

Il metodo CCK8 è stato utilizzato per determinare la citotossicità. B16f1 0 e le cellule HACAT nella fase di crescita logaritmica sono state digerite con tripsina allo 0,25% per 3 minuti. Dopo che la digestione è stata terminata, il terreno di coltura è stato ripetutamente soffiato per fare una sospensione cellulare con una densità di 1 × 104 cellule/mL. Le celle sono state uniformemente inoculate in una piastra di pozzi 96-, 100 μl per pozzetto e PBS è stato aggiunto ai pozzi intorno alle celle. Dopo che le cellule hanno aderito alla parete, sono state aggiunte diverse concentrazioni di massa di soluzione campione, 3 pozzi replicati per gruppo e coltivate in un incubatore a 37 gradi, 5% di frazione di volume di CO2 e umidità del 70% per 24, 48 e 72 ore, quindi la soluzione è stata scartata. Tutti i gruppi sono stati aggiunti con 100 μL di terreno di coltura completo contenente il 10% di frazione di volume CC8 e incubati per 60 minuti. L'assorbanza della soluzione a 450 nm è stata misurata usando un lettore ELISA. La vitalità cellulare (%) è stata calcolata secondo la formula (4).

 

 

Dove: un gruppo sperimentale è l'assorbanza dei pozzi contenenti cellule e soluzione di campionamento sotto irradiazione UVB; Un gruppo normale è l'assorbanza dei pozzi contenenti cellule e una soluzione campione senza irradiazione UVB; Un gruppo vuoto è l'assorbanza dei pozzi contenenti terreno di coltura ma senza cellule.

 

1.4.5 Determinazione del contenuto di melanina

Il contenuto di melanina è stato determinato dal metodo di lisi NaOH. Dopo aver trattato le cellule per 72 ore secondo il metodo nella Sezione 1.4.2, il surnatante è stato scartato e lavato due volte con PBS e sono stati aggiunti 100 μL di soluzione acquosa NaOH contenente DMSO al 10% in volume (concentrazione di 1 mol/L). Dopo essere stato collocato in un forno di 90 gradi per 1 ora, l'assorbanza della soluzione a 490 nm è stata determinata da un marcatore enzimatico. L'esperimento è stato ripetuto 3 volte. Il contenuto di melanina (%) è stato calcolato secondo la formula (5).

 

1.5 Determinazione del contenuto del fattore infiammatorio e dell'indice di stress ossidativo

Dopo aver trattato le cellule per 48 ore secondo il metodo nella Sezione 1.4.2, le cellule HACAT in ciascun gruppo sono state raccolte con un raschietto cellulare, centrifugato e il surnatante è stato raccolto. Il contenuto di IL -6 e TNF- è stato determinato in base alle istruzioni del kit ELISA.
Dopo aver trattato le cellule per 48 ore secondo il metodo nella Sezione 1.4.2, le cellule HACAT in ciascun gruppo sono state raccolte con un raschietto cellulare e le cellule sono state spezzate mediante congelamento e scongelamento ripetuti. Le cellule sono state centrifugate a 12000 r/min a 4 gradi per 10 minuti e il surnatante è stato raccolto. L'attività SOD e il contenuto di CAT sono stati determinati secondo le istruzioni del kit ELISA.

1.6 Determinazione dell'indice combinato
Il metodo dell'indice combinato (CI) [20] è stato utilizzato per determinare se PHGS e GLA in diversi rapporti di massa avevano un effetto sinergico nell'inibizione dell'attività della tirosinasi e dell'antiossidazione. L'indice di combinazione è stato calcolato secondo la formula (6):

Wherein: D1 and D2 are the mass concentrations (mg/mL) of the two drugs when the activity reaches x% in the combined treatment; DX is the mass concentration (mg/mL) required for the activity to reach x% when the two substances are used alone. Compusyn software was used for calculation. CI>1 indica un effetto antagonista, ci =1 indica un effetto additivo e CI<1 indicates a synergistic effect.

 

1.7 Analisi dei dati

Tutti i dati sono espressi come "media aritmetica ± deviazione standard (𝑥̅ ± 𝑠)". Grafico prisma 9.5. 0 Il software è stato utilizzato per l'analisi statistica. L'analisi a senso unico della varianza è stata utilizzata per il confronto tra più gruppi. P<0.05 was considered statistically significant.