L'effetto antietà del polipeptide Velvet Antler dipende dalla modulazione del microbiota intestinale e dalla regolazione del percorso PPAR/APOE4 PARTE 1

Abbiamo studiato gli effetti anti-invecchiamento del polipeptide di corna di velluto sui topi con invecchiamento indotto da D-galattosio (D-gal). I topi di invecchiamento indotti da D-gal sono stati stabiliti e divisi casualmente in cinque gruppi, il controllo, il modello, la vitamina E (VE), il polipeptide di corna di velluto a basso dosaggio e i gruppi ad alto dosaggio di polipeptide di corna di velluto. Il test del labirinto acquatico di Morris è stato utilizzato per valutare le capacità di apprendimento e memoria dei topi che invecchiano. I neuroni dell'ippocampo sono stati osservati tramite colorazione con ematossilina-eosina e microscopia elettronica a trasmissione. Sono stati utilizzati metodi biochimici per rilevare le attività della superossido dismutasi, della malonaldeide e di altri enzimi e per valutare l'influenza del polipeptide delle corna di velluto sulla capacità antiossidante dei topi che invecchiano. Utilizzando il sequenziamento del gene 16S rRNA e la tecnologia del meristema, abbiamo valutato l'effetto del polipeptide delle corna di velluto sulla flora intestinale dei topi invecchiati e sul metabolismo degli acidi grassi. I risultati sperimentali hanno mostrato che il polipeptide delle corna di velluto potrebbe migliorare significativamente l'apprendimento e le capacità cognitive dei topi anziani e aumentare le attività di superossido dismutasi, glutatione perossidasi e catalasi nel siero per diminuire il contenuto di malonaldeide. L'analisi microecologica intestinale ha mostrato che il polipeptide delle corna di velluto potrebbe aumentare significativamente l'abbondanza del genere batterico benefico lactobacillus. L'analisi Western blot ha inoltre dimostrato che il polipeptide delle corna di velluto potrebbe promuovere il metabolismo degli acidi grassi attivando il recettore attivato dal proliferatore del perossisoma (PPAR) e sovraregolando l'espressione degli enzimi a valle carnitina-palmitoil transferasi-1 A e acil-CoA ossidasi 1 durante la sottoregolazione quella dell'apolipoproteina E4 (APOE4), riducendo così l'accumulo di acidi grassi e aumentando la produzione di adenosina-trifosfato (ATP). Pertanto, il polipeptide delle corna di velluto migliora la microecologia intestinale e attiva la via PPAR/APOE4 per regolare il metabolismo degli acidi grassi.

Il glicoside di cistanche può anche aumentare l'attività della SOD nei tessuti del cuore e del fegato e ridurre significativamente il contenuto di lipofuscina e MDA in ciascun tessuto, eliminando efficacemente vari radicali reattivi dell'ossigeno (OH-, H₂O₂, ecc.) e proteggendo dai danni al DNA causati da radicali OH. I glicosidi feniletanoidi di Cistanche hanno una forte capacità di scavenging dei radicali liberi, una maggiore capacità di riduzione rispetto alla vitamina C, migliorano l'attività della SOD nella sospensione dello sperma, riducono il contenuto di MDA e hanno un certo effetto protettivo sulla funzione della membrana dello sperma. I polisaccaridi Cistanche possono migliorare l'attività di SOD e GSH-Px negli eritrociti e nei tessuti polmonari di topi sperimentalmente senescenti causati dal D-galattosio, nonché ridurre il contenuto di MDA e collagene nei polmoni e nel plasma e aumentare il contenuto di elastina, hanno un buon effetto scavenging su DPPH, prolunga il tempo di ipossia nei topi senescenti, migliora l'attività della SOD nel siero e ritarda la degenerazione fisiologica del polmone nei topi senescenti sperimentalmente Con la degenerazione morfologica cellulare, gli esperimenti hanno dimostrato che Cistanche ha la buona capacità antiossidante e ha il potenziale per essere un farmaco per prevenire e curare le malattie dell'invecchiamento cutaneo. Allo stesso tempo, l'echinacoside in Cistanche ha una significativa capacità di eliminare i radicali liberi DPPH e ha la capacità di eliminare le specie reattive dell'ossigeno e prevenire la degradazione del collagene indotta dai radicali liberi, e ha anche un buon effetto di riparazione sul danno dell'anione dei radicali liberi della timina.

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Parole chiave

Polipeptide di corna di velluto; D-galattosio; Invecchiamento; Microecologia intestinale; Apprendimento; Decadimento cognitivo; percorso PPAR/APOE4; Microbiota

1. Introduzione

Il polipeptide di corna di velluto (VAP) rappresenta il 50-60 percento del peso umido delle corna di velluto ed è uno dei suoi principali ingredienti attivi [1]. Il VAP è ricco di proteine, aminoacidi, fosfolipidi, colesterolo e ioni di calcio ed esercita vari effetti di promozione della salute, con effetti antiossidanti [2], resistenza all'osteoporosi [3] e regolazione immunitaria [4]. Per comprendere meglio il ruolo della VAP nella prevenzione e nel trattamento delle malattie neurodegenerative, precedenti ricerche del nostro gruppo di ricerca hanno anche confermato che la VAP potrebbe ridurre i livelli del recettore dei glucocorticoidi, del recettore dei mineralcorticoidi e dell'ormone di rilascio della corticotropina. Sono stati osservati anche gli effetti della VAP sull'asse talamo-ipofisi-surrene e la sua capacità di inibire l'apoptosi neuronale [5].

L'invecchiamento cerebrale è un processo fisiologico naturale caratterizzato da stress ossidativo (OS), accumulo di molecole di danno ossidativo e cambiamenti nella struttura e nella funzione dei neuroni, che alla fine portano al declino cognitivo e alla perdita di memoria [6]. Tra questi fattori, l'OS è considerata la causa primaria delle malattie neurodegenerative associate all'invecchiamento [7]. Quando il corpo è sottoposto a stimoli dannosi, c'è uno squilibrio tra la generazione e la rimozione dei radicali liberi, con conseguente aumento dei radicali liberi a un livello che supera la capacità antiossidante del corpo. In particolare, i radicali liberi eccessivi sono citotossici, causando danni diretti al sistema nervoso centrale [8, 9]. Il cervello umano rappresenta solo il 2-3% del peso corporeo umano. Tuttavia, il sistema nervoso centrale (SNC) rappresenta il 20 percento dell'apporto totale di ossigeno del corpo umano. Pertanto, il contenuto di radicali liberi neuronali nel SNC è considerevole, presentando un alto rischio di OS [10].

Il microbiota intestinale umano, che comprende più di 100 specie, comprende circa 10-volte più batteri rispetto alle cellule umane [11]. I firmicutes sono le specie più abbondanti all'interno del microbiota intestinale umano, rappresentando il 60% dei batteri totali, seguiti da Bacteroidetes (15%) e altri componenti che rappresentano una piccola percentuale. Il microbiota intestinale è in uno stato di equilibrio dinamico con il corpo umano e i microbi intestinali hanno un ruolo importante nel metabolismo umano, nella funzione endocrina e nella regolazione immunitaria. Pertanto, quando la struttura del microbiota intestinale è disturbata, possono verificarsi malattie neurodegenerative, malattie cardiovascolari e obesità [12]. I cambiamenti nella quantità e nella diversità dei microrganismi intestinali possono anche influenzare il sistema nervoso centrale e enterico. Queste interazioni sono note come asse microbiota-intestino-cervello, che è importante per la funzione corporea [13, 14]. Sebbene i cambiamenti nei profili del microbiota intestinale non influiscano necessariamente sulla salute, la perdita di diversità nel microbiota centrale è associata a una diminuzione della funzione cognitiva e della memoria [15]. Infatti, con l'aumentare dell'età, i cambiamenti nella flora batterica sono principalmente caratterizzati da una diminuzione della diversità, dei probiotici, degli anaerobi facoltativi e degli acidi grassi totali a catena corta [16].

Sebbene numerosi studi abbiano confermato che gli effetti antiossidanti e antietà associati alla VAP attenuano l'invecchiamento, l'esatto meccanismo alla base di questa attività è rimasto poco chiaro. Pertanto, nel presente lavoro, l'effetto antietà del VAP è stato valutato in vivo nei topi tramite il test Morris Water Maze (MWM), l'analisi biochimica, la colorazione con ematossilina-eosina (H&E) e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Inoltre, abbiamo valutato i cambiamenti nella microecologia intestinale nei modelli di topi invecchiati trattati con VAP utilizzando la tecnologia di sequenziamento genico dell'RNA ribosomiale 16S (rRNA). Il nostro obiettivo era chiarire il meccanismo dell'attività VAP nel contesto dell'invecchiamento e fornire una base teorica per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici anti-invecchiamento.

2. Materiali e metodi

2.1 Materiali sperimentali

VAP was provided by the Molecular Pharmacology Laboratory, Changchun University of Chinese Medicine. Dgalactose (D-gal) and VE (purity >90 per cento) sono stati acquistati da Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Cina). I kit commerciali di superossido dismutasi (SOD), malonaldeide (MDA), catalasi (CAT) e glutatione perossidasi (GSH-Px) sono stati acquistati da Nanjing Jiancheng Technology Co., Ltd. (Nanjing, Cina). Tutti i prodotti chimici e i reagenti erano di grado analitico.

Il sistema di monitoraggio e analisi video Morris Water Maze (MWM) è stato acquistato da Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd. (Chengdu, Cina). Un microscopio elettronico a trasmissione è stato acquistato da Tecnai Corporation (Hillsboro, OR, USA). La piattaforma di sequenziamento ad alto rendimento (MiSeq PE300) è stata fornita da Illumina (San Diego, CA, USA).

2.2 Esperimenti sugli animali

Sessanta topi ICR sani (grado SPF, metà maschi e metà femmine, del peso di 22-26 g) sono stati acquistati da Changchun Yisi Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (certificato n. SCXK(Ji) -2018-0007). I topi sono stati allevati in gabbie separate con cicli luce/buio di 12 ore e una temperatura standard (22 ± 2 ◦C), con cibo e acqua forniti ad libitum. Tutti i topi sono stati adattati a queste condizioni per almeno una settimana prima dell'inizio degli esperimenti. Tutti i topi sono stati divisi in cinque gruppi, controllo, modello, vitamina E (VE), VAP a basso dosaggio (VAP1) e VAP ad alto dosaggio (VAP2). Ai gruppi VE, VAP1 e VAP2 è stato somministrato VE (100 mg/kg), VAP (200 mg/kg) e VAP (400 mg/kg), rispettivamente, per 10 giorni, mentre i gruppi di controllo e modello hanno ricevuto acqua distillata (lo stesso volume e per la stessa via intragastrica). A partire dall'11° giorno, al gruppo di controllo è stata iniettata per via sottocutanea soluzione salina normale. D-gal (1000 mg/kg) è stato iniettato per via sottocutanea nella parte posteriore del collo dei topi negli altri gruppi e la somministrazione del modello è stata continuata per 60 giorni.

2.3 Labirinto d'acqua Morris

Il test MWM è stato eseguito 1 ora dopo la somministrazione di D-gal il giorno 57. In breve, una piattaforma è stata posta al centro del labirinto d'acqua. L'acqua è stata aggiunta alla piattaforma fino a superare 1 cm ed è stata mantenuta a circa 25°C. I topi sono stati addestrati continuamente per 1 settimana e il test MWM è stato formalmente eseguito secondo la procedura operativa standard del labirinto d'acqua. Prima dell'inizio ufficiale dell'esperimento, all'acqua è stato aggiunto biossido di titanio in modo che i topi non potessero percepire la posizione specifica della piattaforma. Le teste dei topi sono state tinte di giallo per tracciare e raccogliere dati. Il software di analisi di tracciamento video del labirinto acquatico Morris ha registrato il percorso di nuoto dei topi, la percentuale del tempo di permanenza nell'anello centrale e la percentuale della distanza di movimento dell'anello centrale.

2.4 colorazione H&E

L'intero cervello dei topi è stato fissato in una soluzione di paraformaldeide al 4% e incorporato in paraffina. Dopo 24 ore, i tessuti cerebrali sono stati sezionati, deparaffinati, reidratati e colorati con H&E. Le sezioni sono state quindi osservate al microscopio ottico per registrare i cambiamenti patologici.

2.5 ARTICOLO

Dopo la perfusione, i tessuti dell'ippocampo sono stati recisi, fissati con una soluzione tampone di paraformaldeide al 2% e glutaraldeide al 2,5%, disidratati utilizzando un gradiente alcolico, puliti con etossi propano, incorporati, tagliati e colorati con acetato di uranile e citrato di piombo. L'ultrastruttura dei neuroni dell'ippocampo è stata osservata al microscopio elettronico a trasmissione.

2.6 Analisi biochimiche

I campioni di sangue di topo sono stati raccolti e centrifugati a 3000 rpm per 15 minuti a 4 °C, dopodiché è stato raccolto il surnatante. Il contenuto sierico di MDA e la determinazione dell'attività di SOD, GSH-Px e CAT sono stati tutti eseguiti secondo le istruzioni del kit.

2.7 Microbiota profiling di campioni fecali

Il DNA totale è stato estratto da campioni fecali e utilizzato come modello per la PCR per amplificare la regione V3-V4 del gene batterico 16S rRNA. Il set di dati non elaborati è depositato in NCBI BioProject PRJNA731623 con i numeri di accesso a BioSample da SAMN19291644 a SAMN19291668. I prodotti PCR sono stati analizzati quantitativamente e il sequenziamento del gene rRNA 16S è stato eseguito utilizzando una piattaforma Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, USA). I dati grezzi si basano sulla lunghezza minima di sovrapposizione di 10 bp, con un rapporto di mancata corrispondenza massimo consentito nell'area di sovrapposizione di 0,2 (impostazione predefinita). Le letture di ciascun campione sono state unite e i tag con lunghezze inferiori al 75% della lunghezza del tag dopo il controllo di qualità sono stati filtrati. Le chimere (ovvero, se i due genitori hanno una sequenza che è più dell'80% simile alla sequenza della query, allora la query viene giudicata una chimera) sono state rimosse per ottenere sequenze di tag di alta qualità. Il software di ricerca (Sonoma, USA) [17] è stato utilizzato per raggruppare i tag a un livello di somiglianza del 97%, classificare le unità tassonomiche operative (OTU), ottenere la classificazione delle specie in base alla composizione della sequenza OTU e tracciare la diluizione del campione [18] e le curve dell'indice di Shannon . PICRUSt (Halifax, CAN) [19] è stato utilizzato per determinare la composizione genica funzionale di ciascun campione mediante il confronto delle informazioni sulla composizione delle specie in base ai risultati del sequenziamento del gene 16S rRNA. In questo modo è stato possibile determinare differenze funzionali tra diversi campioni o gruppi. Le abbondanze, i percorsi, le informazioni EC e le abbondanze OTU nel contesto di ciascuna categoria funzionale sono state ottenute utilizzando il database Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes [20].

2.8 Western blotting

Le proteine ​​totali sono state estratte dal tessuto cerebrale e per valutare la concentrazione proteica è stato utilizzato il metodo blu brillante di Coomassie. Quindi, dopo l'elettroforesi SDS-PAGE, le proteine ​​si sono trasferite sulla membrana, che è stata poi incubata con anticorpi primari contro le proteine ​​bersaglio apolipoproteina E (APOE4), acil-CoA ossidasi 1 (ACOX1), recettore attivato dal proliferatore del perossisoma (PPAR), carnitina-palmitoil transferasi-1 A (CPT1A) e gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) durante la notte a 4 ◦C. Successivamente, la membrana è stata lavata e quindi incubata con un anticorpo secondario a temperatura ambiente per 1 ora. Dopo aver lavato la membrana con soluzione salina tamponata con Tris e Tween 20 (TBST), è stata aggiunta una soluzione chemiluminescente potenziata (ECL). Per la scansione della fotografia viene utilizzato un sistema di imaging su gel completamente automatico (Aplegen, Pleasanton, USA).

2.9 Rilevamento dei livelli di acidi grassi liberi (FFA) nel tessuto cerebrale

Sono stati raccolti tessuti cerebrali di topo ed è stata aggiunta una quantità appropriata di soluzione salina normale. Quindi, i campioni sono stati centrifugati a 4°C a 3000 rpm per 10 minuti e sono stati raccolti i surnatanti. I livelli di FFA nei tessuti cerebrali sono stati determinati dalle istruzioni del kit.

2.10 Rilevazione del contenuto di ATP nel tessuto cerebrale

I tessuti cerebrali del topo sono stati raccolti e lisati in un rapporto tessuto cerebrale:tampone di lisi di 1:5. Quindi, i campioni sono stati centrifugati a 12, 000 × g a 4 ◦ C per 5 minuti e sono stati raccolti i surnatanti. Il contenuto di ATP nei tessuti cerebrali è stato determinato dalle istruzioni del kit.

2.11 Analisi statistica

SPSS 19.0 (Chicago, IL, USA) è stato utilizzato per l'analisi dei dati. I risultati sono espressi come media ± deviazione standard (x ± s). Il test t di Student è stato utilizzato per confrontare i gruppi e le differenze sono state considerate significative a P < 0.05 o P < 0,01.

3. Risultati

3.1 Miglioramento della cognizione, dell'apprendimento e della memoria nei topi anziani trattati con VAP

Il test MWM si basa sull'istinto di sopravvivenza degli animali per trovare la piattaforma di fuga e prevede la ricerca di una posizione spaziale correlata alla memoria. La Fig. 1 mostra tracce rappresentative di topi ai quali è stato somministrato il test MWM l'ultimo giorno. Il diagramma della traiettoria del comportamento del mouse del gruppo modello era più complicato e irregolare e i topi non hanno trovato la piattaforma. Da notare che il diagramma della traiettoria del comportamento dei topi nei gruppi VAP1 e VAP2 era semplice ed è stata trovata una piattaforma. Rispetto al gruppo di controllo, la percentuale del tempo di ritenzione nell'anello centrale e la percentuale della distanza percorsa dall'anello centrale nel gruppo modello sono state significativamente ridotte (P <0.01). Rispetto al gruppo Modello, la percentuale del tempo di ritenzione nell'anello centrale e la percentuale della distanza percorsa dall'anello centrale erano significativamente aumentate nei gruppi VE, VAP1 e VAP2 (P < 0.05, P < 0,01). Questi risultati indicano che la somministrazione di VAP ha migliorato la capacità cognitiva dei topi anziani indotti da D-gal.

3.2 Effetto protettivo della VAP sui neuroni ippocampali nei topi anziani

La colorazione H&E è stata utilizzata per osservare la morfologia patologica dei tessuti cerebrali nei topi anziani per esplorare se il VAP potesse migliorare il danno patologico neuronale indotto da D-gal (Fig. 2A). Le cellule CA1 nell'ippocampo del gruppo di controllo erano abbondanti, con struttura cellulare normale, morfologia completa e nuclei evidenti. Al contrario, il numero di cellule CA1 nell'ippocampo del gruppo modello è diminuito e ha mostrato una morfologia irregolare, senza nucleoli evidenti osservati al microscopio. I neuroni nell'area CA1 dell'ippocampo erano relativamente normali e il restringimento nucleare era ridotto nel gruppo VE rispetto al gruppo modello. Sorprendentemente, l'area CA1 nell'ippocampo dei gruppi VAP1 e VAP2 era significativamente diversa da quella osservata nel gruppo modello e simile a quella del gruppo di controllo. La struttura era relativamente normale, le cellule erano strettamente disposte e regolari e la morfologia era completa.

TEM è stato ulteriormente utilizzato per osservare l'ultrastruttura dei neuroni dell'ippocampo nei topi anziani e per capire se l'effetto di inversione del VAP sul declino dell'apprendimento e della memoria fosse associato alla regolazione della microstruttura dei neuroni nel cervello (Fig. 2B). I neuroni dell'ippocampo hanno mostrato una morfologia intatta, una distribuzione uniforme della cromatina e abbondanti organelli nel citoplasma nel gruppo di controllo. Ad alto ingrandimento, i mitocondri erano ellittici, con una doppia membrana esterna chiara e creste intatte. Al contrario, i neuroni nella regione dell'ippocampo del gruppo modello erano anormali; sono stati osservati i primi cambiamenti apoptotici come la condensazione della cromatina; i corpuscoli di lipofuscina erano più frequenti; la struttura sinaptica non era chiara; goccioline lipidiche erano sparse e sono state rilevate un'espansione simile a una vescicola del complesso di Golgi e un ridotto reticolo endoplasmatico ruvido. Sorprendentemente, rispetto al gruppo modello, i gruppi VAP1 e VAP2 avevano neuroni ippocampali che tendevano ad essere normali nella struttura e nella morfologia, con membrane nucleari lisce, nucleoli normali e abbondanti organelli. In particolare, sono state osservate più sinapsi, le vescicole sinaptiche nella membrana anteriore non presentavano un'aggregazione anormale, la morfologia del corpo del Golgi intracitoplasmatico e dei mitocondri era normale e la lipofuscina era rara.

3.3 Effetti della VAP sugli enzimi correlati al danno ossidativo

Un effetto negativo dell'OS è la produzione di radicali liberi nel corpo, una delle principali cause di invecchiamento e malattia (Fig. 3). Rispetto al gruppo di controllo, le attività di SOD, CAT e GSH-Px nel siero di topi modello a cui è stato somministrato D-gal erano significativamente diminuite (P < 0.01, P < {{7 }}.{{10}}5) e il contenuto MDA è stato notevolmente aumentato (P < 0.05), indicando che la modellazione è riuscita. Rispetto al gruppo modello, le attività di SOD, CAT e GSH-Px nel gruppo VE erano significativamente aumentate (P < 0.01, P < 0.05) . Rispetto al gruppo modello, le attività di SOD e GSH-Px nel gruppo VAP1 erano significativamente aumentate (P <0,05, P <0,01). Al contrario, il CAT era leggermente aumentato ma non era significativamente diverso. Rispetto al gruppo modello, le attività di SOD, CAT e GSH-Px nel gruppo VAP2 erano significativamente aumentate (P <0,05, P <0,01). Rispetto al gruppo modello, il contenuto di MDA nel siero dei topi nei gruppi VAP1 e VAP2 era significativamente ridotto (P <0,05). I risultati di cui sopra indicano che l'effetto anti-invecchiamento della VAP è correlato al potenziamento dell'attività degli enzimi antiossidanti sierici nei topi anziani e alla riduzione della perossidazione lipidica.

3.4 Effetti della VAP sulla composizione e diversità del microbiota intestinale nei topi

I risultati del sequenziamento del gene 16S rRNA hanno prodotto 1.999,460 letture PE e, dopo aver filtrato e rimosso le chimere, sono stati ottenuti 1.776.708 tag efficaci. Le lunghezze medie delle sequenze dei campioni nei gruppi di controllo, modello, VE, VAP1 e VAP2 erano rispettivamente di 417,2, 416,2, 418,2, 421,0 e 420,4 bp. Il rapporto di letture con un punteggio di qualità Phred superiore a 30 (Q30) variava dal 94,15 al 95,71%.

Successivamente, abbiamo determinato la composizione del microbiota intestinale utilizzando le letture del gene 16S rRNA. I tag ottenuti dal sequenziamento ad alto rendimento sono stati raggruppati a un livello di somiglianza del 97% ed è stato generato un diagramma di Venn (Fig. 4A). Ogni gruppo aveva 490 OTU e sostanzialmente non c'erano OTU specifiche per gruppo. Per verificare se la profondità di sequenziamento soddisfacesse i requisiti di identificazione delle specie, abbiamo tracciato le curve di Shannon e di rarefazione per tutti i campioni (Fig. 4B, C). Entrambe le curve in tutti i campioni erano vicine al plateau di saturazione, rivelando un'elevata copertura (99 percento). Questi dati suggeriscono che la stragrande maggioranza delle informazioni sulla diversità microbica nei campioni è stata estratta e che la struttura e la diversità della comunità batterica potrebbero essere determinate con precisione.

La diversità alfa riflette l'abbondanza (ricchezza) e la diversità delle specie. Gli indici Shannon e Simpson sono utilizzati per misurare la diversità delle specie e sono influenzati dall'abbondanza di specie nella comunità campione e dall'uniformità delle specie (uniformità della comunità). Maggiore è il valore dell'indice Shannon, minore è il valore dell'indice Simpson, indicando che la diversità delle specie del campione è maggiore [21]. I risultati presentati in Fig. 4D non mostrano differenze significative nei valori dell'indice di Shannon della flora del topo tra i gruppi.

Rispetto al gruppo di controllo, il valore dell'indice Simpson del gruppo modello non presenta differenze significative. Nessuna differenza significativa è stata osservata tra il gruppo modello e ciascun gruppo di trattamento. Questi risultati non mostrano alcuna differenza significativa nella diversità della flora intestinale dei topi tra i gruppi.

La PCA è stata eseguita sulla flora intestinale del topo (Fig. 4E), dove PC1 e PC2 sono i due valori caratteristici che causano la maggiore differenza tra i campioni. I risultati hanno mostrato che il 32,94 e il 19,74 percento del grado di influenza era rappresentato rispettivamente da PC1 e PC2. Più lontani sono i punti, maggiore è la differenza. I cinque gruppi di campioni sono raggruppati in tre categorie, con i campioni del gruppo modello distribuiti nell'angolo in alto a sinistra della figura, lontano dagli altri gruppi. I gruppi di controllo, VE e VAP2 hanno mostrato più sovrapposizioni e i tre gruppi di campioni erano vicini. La parte centrale superiore della Fig. 4E mostra che dopo l'intervento VAP, la somiglianza della flora intestinale del gruppo di topi VAP2 con quella dei topi di controllo è stata migliorata.

Le differenze nelle abbondanze di batteri nel modello di controllo, nei gruppi VE, VAP1 e VAP2 sono state valutate per i primi 20 generi (Fig. 4F). Le abbondanze del gruppo Lachnospiraceae_NK4A136_ e Lactobacillus erano diverse tra gli animali di controllo e modello, dove l'abbondanza di Lactobacillus nel gruppo modello era significativamente ridotta. Al contrario, le abbondanze dei restanti generi sono state notevolmente aumentate. In particolare, i membri del Lactobacillus sono probiotici con effetti antietà e antinfiammatori [22, 23]. Pertanto, questi risultati non sono stati sorprendenti. Sorprendentemente, l'abbondanza di Lactobacillus è aumentata significativamente nei gruppi VAP1 e VAP2 rispetto al gruppo modello, suggerendo che VAP può aumentare il contenuto di batteri benefici nell'intestino, prevenendo l'invecchiamento.

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