Gli effetti antietà di Ludwigia Octovalvis sui topi Drosophila Melanogaster e SAMP8 Parte 2

Composizione chimica del LOE

Per identificare i meccanismi mediante i quali la LOE induce l'estensione della durata della vita nelle mosche, la composizione chimica della LOE è stata analizzata mediante GC-MS. Diciassette picchi principali sono stati osservati nel cromatogramma ionico totale (Fig. 4) e sono stati identificati come composti noti elencati nella Tabella 2.

Il glicoside di cistanche può anche aumentare l'attività della SOD nei tessuti del cuore e del fegato e ridurre significativamente il contenuto di lipofuscina e MDA in ciascun tessuto, eliminando efficacemente vari radicali reattivi dell'ossigeno (OH-, H₂O₂, ecc.) e proteggendo dai danni al DNA causati da radicali OH. I glicosidi feniletanoidi di Cistanche hanno una forte capacità di scavenging dei radicali liberi, una maggiore capacità di riduzione rispetto alla vitamina C, migliorano l'attività della SOD nella sospensione dello sperma, riducono il contenuto di MDA e hanno un certo effetto protettivo sulla funzione della membrana dello sperma. I polisaccaridi Cistanche possono migliorare l'attività di SOD e GSH-Px negli eritrociti e nei tessuti polmonari di topi sperimentalmente senescenti causati dal D-galattosio, nonché ridurre il contenuto di MDA e collagene nei polmoni e nel plasma e aumentare il contenuto di elastina, hanno un buon effetto scavenging su DPPH, prolunga il tempo di ipossia nei topi senescenti, migliora l'attività della SOD nel siero e ritarda la degenerazione fisiologica del polmone nei topi senescenti sperimentalmente Con la degenerazione morfologica cellulare, gli esperimenti hanno dimostrato che Cistanche ha la buona capacità antiossidante e ha il potenziale per essere un farmaco per prevenire e curare le malattie dell'invecchiamento della pelle. Allo stesso tempo, l'echinacoside in Cistanche ha una significativa capacità di eliminare i radicali liberi DPPH e può eliminare le specie reattive dell'ossigeno, prevenire la degradazione del collagene indotta dai radicali liberi e ha anche un buon effetto riparatore sul danno dell'anione dei radicali liberi della timina.

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LOE attenua il danno ossidativo acuto

Poiché lo stress ossidativo è la teoria più popolare per spiegare come si verifica l'invecchiamento a livello molecolare, abbiamo deciso di esaminare l'attività di scavenging dei radicali DPPH di LOE come indicatore critico della sua capacità antiossidante. Nei nostri saggi, LOE aveva una forte attività di scavenging dei radicali DPPH (IC50 3.15 ug/ml), tra l'attività dell'acido ascorbico (IC50 1.31 ug/ml) e quella del resveratrolo ( IC50 7.86 ug/ml), che sono stati usati come controlli (Fig. 5a). Tuttavia, le attività di scavenging dei radicali DPPH dei due composti più abbondanti identificati in LOE, - sitosterolo e squalene sono state rilevate solo a livelli minimi (Fig. 5a). La capacità antiossidante di LOE potrebbe essere attribuita alla sua composizione ricca di antiossidanti, poiché nella nostra preparazione di LOE era presente un alto livello di polifenoli (146,3±3,1 mg di acido gallico equivalente per g di peso secco; Tabella 3) e i flavonoidi erano un componente maggiore tra i polifenoli (90,2±2,6 mg di rutina equivalente per g di peso secco).

Abbiamo quindi testato ulteriormente le proprietà antiossidanti del LOE esponendo 10-mosche femminili trattate con LOE di un giorno al paraquat (metilviologeno, una sostanza chimica nota per generare specie reattive dell'ossigeno). Abbiamo scoperto che le mosche che hanno ricevuto l'integrazione di LOE nel loro cibo per 10 giorni hanno mostrato una maggiore resistenza alla letalità indotta dal paraquat (Fig. 5b). Questo risultato è stato ulteriormente confermato analizzando i livelli di danno ossidativo nelle mosche trattate con paraquat per 12 ore. Abbiamo utilizzato l'4-idrossinonenale (HNE), un addotto proteico generato dai prodotti dell'ossidazione lipidica, come indicatore del danno ossidativo. Sebbene l'integrazione di LOE non abbia mostrato alcun effetto sul livello basale di HNE in 10- mosche di un giorno, ha ridotto significativamente l'accumulo di HNE nelle mosche trattate con paraquat 20 mM (Fig. 5c).

-Il sitosterolo è un componente importante nella LOE che contribuisce all'estensione della durata della vita

Abbiamo esaminato ulteriormente gli effetti di -sitosterolo e squalene sulla durata della vita delle mosche. Curiosamente, il sitosterolo ha indotto l'estensione della durata della vita nelle femmine di mosche CS (Fig. 6a) in modo dose-dipendente. Questo effetto pro-longevità, tuttavia, non è stato osservato nelle mosche CS femminili che ricevevano le stesse dosi di squalene (Fig. 6b).

È stato dimostrato che il percorso AMPK media l'estensione della durata della vita da parte della DR sia in C. elegans (Apfeld et al. 2004; Greer et al. 2007) che nelle mosche (Stenesen et al. 2013). Pertanto, abbiamo esaminato se LOE e -sitosterol potessero regolare la durata della vita modulando il percorso AMPK. Usando le cellule di Drosophila S2, abbiamo scoperto che LOE e -sitosterol potrebbero migliorare significativamente la fosforilazione di AMPK (Fig. 6c). Osservazioni simili sono state fatte quando le cellule sono state mantenute in condizioni DR (0, 5 × medio) (Fig. 6c). Se l'AMPK avesse un ruolo importante nell'estensione della durata della vita indotta da -sitosterolo nelle mosche, la perdita di AMPK dovrebbe attenuare l'effetto di longevità del -sitosterolo. Abbiamo testato questa ipotesi abbattendo l'espressione di AMPK, in particolare nei corpi grassi delle mosche adulte (Fig. S1). Il corpo grasso della Drosophila è l'equivalente volante del fegato dei mammiferi e del tessuto adiposo ed è responsabile del metabolismo. La sovraespressione o il knockdown di AMPK nelle cellule adipose è stata associata rispettivamente a un aumento o a una diminuzione della durata della vita delle mosche (Stenesen et al. 2013). Abbiamo combinato un allele UAS-AMPK.RNAi con un GeneSwitch GAL4 inducibile da RU486- per il corpo grasso (S106-GAL4). Mosche adulte portatrici di elementi genetici appropriati sono state randomizzate a cibi contenenti RU486 (l'agente attivante per i driver GeneSwitch-Gal4) e/o - sitosterolo. Abbiamo scoperto che l'estensione della durata della vita indotta da -sitosterolo non è stata osservata quando l'espressione di AMPK è stata abbattuta specificamente nel corpo grasso delle mosche adulte (Fig. 6d). Insieme, questi dati implicano che il sitosterolo derivato dal LOE può modulare la durata della vita, almeno in parte, attivando l'AMPK nel corpo grasso delle mosche adulte.

Discussione

I moscerini della frutta hanno una vita relativamente breve, che va da poche settimane a diversi mesi, a seconda delle condizioni nutrizionali e ambientali. Ad esempio, l'apporto calorico alterato, le condizioni di accoppiamento e la temperatura ambiente possono modificare in modo significativo la durata della vita della mosca (Bauer et al. 2004). In condizioni ben definite, siamo stati in grado di dimostrare che l'integrazione alimentare con LOE potrebbe prolungare la durata della vita delle mosche senza alcun evidente compromesso negativo.

Lo sviluppo dei mimetici DR è diventato un campo emergente per la ricerca anti-invecchiamento. 2-Il desossiglucosio, un inibitore della glicolisi (Lane et al. 1998), e la metformina, che stimola l'AMPK (Anisimov et al. 2003), sono due molecole attualmente esplorate come mimetici della DR. Tuttavia, la somministrazione a lungo termine di 2- deossiglucosio o metformina può produrre effetti collaterali indesiderati, tra cui insufficienza cardiaca e acidosi lattica, rendendoli candidati improbabili per l'uso come mimetici della DR (Ingram et al. 2004; Sinclair 2005). Anche le mosche che hanno ricevuto metformina non hanno mostrato alcun effetto benefico sull'estensione della durata della vita (Slack et al. 2012). Pertanto, i polifenoli di origine vegetale come il resveratrolo possono fornire un'opzione alternativa. È stato dimostrato che il resveratrolo prolunga la durata della vita di lieviti, vermi e mosche imitando la DR attraverso un percorso Sir2-dipendente (Wood et al. 2004). Sebbene il resveratrolo non abbia prolungato la durata della vita dei topi alimentati ad libitum, ha migliorato la salute e la sopravvivenza dei topi obesi alimentati con una dieta ipercalorica (Baur et al. 2006; Pearson et al. 2008). Questi risultati suggeriscono che il resveratrolo può aumentare la resistenza allo stress indotto da un alto contenuto calorico, il che è coerente con i risultati osservati negli studi che dimostrano che il resveratrolo conferisce protezione cellulare dagli stress, incluso il danno ossidativo (Araki et al. 2004) e le radiazioni gamma (Howitz et al. 2003).

I nostri dati suggeriscono che LOE può agire in parte come un mimetico DR. Abbiamo scoperto che il LOE ha esteso significativamente la durata della vita delle mosche alimentate con una dieta ipercalorica, ma non ha mostrato alcun effetto additivo in condizioni DR (Fig. 1). Il LOE ha anche attenuato il declino cognitivo legato all'età, mantenendolo a un livello simile a quello osservato nelle mosche in condizioni di DR. Abbiamo dimostrato che questi effetti DR-like di LOE non erano dovuti al minor consumo di cibo indotto da LOE (Figg. 2 e 3). Né sono stati osservati altri tipici cambiamenti fisiologici accoppiati con DR, come la ridotta fecondità femminile o una maggiore attività motoria, osservati nelle mosche trattate con LOE (Fig. 2). È stato dimostrato che la DR aumenta l'attività mitocondriale (Nisoli et al. 2005; Lopez-Lluch et al. 2006), ma ritarda o riduce lo stress ossidativo e il danno nelle mosche (Zheng et al. 2005), nei topi (Qiu et al. 2010 ), scimmie (Zainal et al. 2000) e donne (Buchowski et al. 2012). È stato suggerito che questo effetto osservato sia un effetto di "mitoormesi", un'ipotesi secondo cui l'aumento dell'attività mitocondriale e la produzione di ROS possono innescare un programma di difesa intrinseco, che si traduce in una migliore resistenza allo stress e possibilmente in un'estensione della durata della vita (Schulz et al. 2007). Abbiamo scoperto che il LOE aveva una forte attività di scavenging dei radicali DPPH e che riduceva il danno ossidativo e la letalità indotti dal paraquat nelle mosche (Fig. 5), supportando ulteriormente la nostra ipotesi che il LOE potesse agire, almeno in parte, come mimetico del DR.

Le nostre analisi chimiche hanno confermato che il LOE era una ricca fonte di antiossidanti, inclusi composti polifenolici, fitosteroli e squalene (Fig. 4 e Tabella 2). È stato riportato che il -sitosterolo può aumentare l'espressione proteica e l'attività antiossidante della manganese superossido dismutasi attraverso la via estrogeno/fosfatidilinositolo 3-chinasi nei macrofagi (Vivancos e Moreno 2005). È stato anche dimostrato che l'integrazione alimentare di squalene attenua il danno ossidativo correlato all'età e mantiene lo stato energetico dei mitocondri epatici nei ratti anziani (Buddhan et al. 2007). Sebbene -sitosterolo e squalene fossero i due composti più abbondanti identificati in LOE mediante analisi GC-MS, nessuno dei due ha mostrato un'evidente attività di scavenging dei radicali DPPH nel nostro sistema di analisi (Fig. 5). È possibile che le attività antiossidanti del LOE possano includere scavenger di radicali liberi come i composti polifenolici, mentre il -sitosterolo e lo squalene potrebbero agire attraverso altri percorsi, come discusso sopra. È stato dimostrato che altre pratiche mediche tradizionali e integrative come R. rosea e C. longa prolungano la durata della vita delle mosche attraverso percorsi associati all'antiossidazione e alla regolazione di noti geni correlati all'invecchiamento (Lee et al. 2010; Schriner et al. 2013, 2009). Tuttavia, gli estratti di erbe di solito contengono molti composti che richiedono analisi biochimiche sistematiche per l'identificazione. Un'interpretazione meccanicistica è quindi difficile senza l'identificazione di un composto puro. Nel presente studio, abbiamo identificato il -sitosterolo come componente principale che ha contribuito all'attività di estensione della durata della vita della LOE. I nostri dati suggeriscono che l'estensione della durata della vita indotta da -sitosterolo richiede l'attivazione di AMPK nel corpo grasso delle mosche adulte. Ciò è ampiamente in accordo con precedenti rapporti che dimostrano che l'AMPK è il principale sensore di nutrienti e media l'estensione della durata della vita da parte della DR in C. elegans (Apfeld et al. 2004; Greer et al. 2007) e mosche (Stenesen et al. 2013).

È auspicabile che gli interventi sulla longevità non solo allunghino la durata della vita, ma ritardino anche l'insorgenza e la morbilità delle malattie legate all'età, cioè aumentino sia la durata della vita che la durata della salute. Gli effetti precognitivi di LOE che descriviamo sia nei moscerini che nei topi SAMP8 possono anche essere di grande interesse nel campo dell'invecchiamento. È stato dimostrato che i topi SAMP8 mostrano deficit legati all'età nella ritenzione della memoria a partire dai 2 mesi di età, quando testati su compiti di evitamento passivo (Miyamoto et al. 1986). In un test di evitamento del footshock, i topi SAMP8 mostrano anche una significativa compromissione dell'acquisizione e della conservazione della memoria dai 6 ai 9 mesi di età, rispetto ai giovani topi SAMP8 (Flood e Morley 1993). Utilizzando il riconoscimento di nuovi oggetti e le attività del labirinto a T elevata, abbiamo potuto osservare chiari deficit legati all'età nella ritenzione della memoria tra 3- e 8- topi SAMP8 di un mese, sebbene non vi fossero differenze durante il periodo di acquisizione di il compito del labirinto a T elevata (Fig. 3). Queste osservazioni sono un'ulteriore prova che i topi SAMP8 mostrano un esordio precoce di deficit cognitivi legati all'età e che il deterioramento peggiora con l'età. Tuttavia, il trattamento LOE a lungo termine (più di 5 mesi) nei topi SAMP8 ha attenuato il declino correlato all'età nella conservazione della memoria senza influire sull'attività fisica, sull'assunzione di cibo, sul consumo di acqua o sul peso corporeo (Fig. 3). Non abbiamo osservato alcun effetto collaterale nei topi che hanno ricevuto 5 mesi di trattamento con LOE (osservazioni non pubblicate). Questi risultati sono in gran parte in accordo con un recente rapporto che dimostra che la somministrazione ripetuta di L. octovalvis per 28 giorni nei topi (800 mg/kg≈2.400 ug/die vs. 400 ug/die utilizzati nel nostro studio) non ha causato letalità o effetti tossicologici effetti (Kadum Yakob et al. 2012).

In sintesi, abbiamo identificato il LOE come un nuovo intervento antietà, in grado di prolungare la durata della vita delle mosche e attenuare il declino cognitivo correlato all'età sia nelle mosche che nei topi SAMP8. GC-MS e altre analisi biochimiche suggeriscono che la LOE può esercitare i suoi effetti antietà attenuando il danno ossidativo e attivando le vie correlate all'AMPK.

Ringraziamenti Vorremmo ringraziare Chuan-Hao Lai e Hao-Wei Wang (Hsiehyu Biotech Company Ltd.) e Shang-Tse Lee (National Taiwan University) per la loro assistenza tecnica. Vorremmo ringraziare Fly Core a Taiwan per le scorte di mosche e i reagenti. Pei-Yu Wang è parzialmente supportato dal National Science Council (NSC 98-2320-B-004-003-MY2 e NSC 100- 2311-B-002-017-MY3), Taiwan.

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