La proteina secretiva conservata ricca di cisteina MaCFEM85 interagisce con MsWAK16 per attivare le difese delle piante

Astratto: Metarhizium anisopliaeè un fungo entomopatogeno che può aumentare la crescita e la resistenza delle piante quando agisce come endofita nelle piante ospiti. Tuttavia, si sa poco sulle interazioni proteiche o sui loro meccanismi di attivazione. Le proteine ​​comuni nella membrana extracellulare dei funghi (CFEM) sono state identificate come regolatori immunitari delle piante che sopprimono o attivano le risposte di resistenza delle piante. Qui, abbiamo identificato una proteina contenente un dominio CFEM, MaCFEM85, localizzata principalmente nella membrana plasmatica. I test di pull-down del lievito due-ibrido (Y2H), di glutatione-S-transferasi (GST) e di complementazione di fluorescenza bimolecolare hanno dimostrato che MaCFEM85 interagisce con il dominio extracellulare di unMedicago sativa(erba medica) proteina di membrana, MsWAK16. Le analisi dell'espressione genica hanno mostrato che MaCFEM85 e MsWAK16 erano significativamente sovraregolatiM. anisopliaeEM. sativa, rispettivamente, da 12 a 60 ore dopo il coinoculo. Ulteriori test sui due ibridi di lievito e la mutazione sito-specifica dell'amminoacido hanno indicato che il dominio CFEM e la 52a cisteina erano specificamente necessari per l'interazione di MaCFEM85 con MsWAK16. I test sulla funzione di difesa hanno mostrato che JA era sovraregolato, ma le dimensioni della lesione di Botrytis cinerea e la riproduzione di Myzus persicae erano soppresse dall'espressione transitoria di MaCFEM85 e MsWAK16 nella pianta ospite modello Nicotiana benthamiana. Nel complesso, questi risultati forniscono nuove informazioni sui meccanismi molecolari alla base delle interazioni di M. anisopliae con le piante ospiti.

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Parole chiave: chinasi associata alla parete; CFEM; Metahizium anisopliae; immunità alle piante; Medicago sativa

1. Introduzione

Le interazioni tra piante e microbi sono diffuse e sono il risultato della coevoluzione passata e attuale. Queste interazioni possono avere esiti benefici, neutri o avversi per ciascun partecipante [1–3]. Il microbiota rizosferico benefico può migliorare la crescita delle piante e migliorare la salute generale proteggendo dalle malattie trasmesse dal suolo o migliorando l’assorbimento dei nutrienti [4,5]. Un’ampia gamma di microbi benefici può migliorare le capacità delle piante come l’assorbimento dei nutrienti, la crescita e le difese contro agenti patogeni e insetti [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın è un importante genere di funghi entomopatogeni con la capacità di colonizzare le piante [8], ma esistono anche prove che suggeriscono che i membri del genere possono aumentare la resistenza ai patogeni delle piante. Ad esempio, uno studio di laboratorio ha rilevato un'inibizione del 60% di Fusarium solani (Mart.) Sacc. in presenza di Metarhizium robertsii (precedentemente noto come M. anisopliae) rispetto ai controlli senza M. robertsii [9]. Alcuni ceppi di Metarhizium hanno il potenziale di migliorare la resistenza delle piante agli insetti nocivi e alle malattie alterando l'espressione dei geni di difesa delle piante. La colonizzazione endofitica con M. Roberts attiva l'espressione delle vie di difesa dell'acido jasmonico (JA) e dell'acido salicilico (SA) nelle foglie di mais; inoltre, tale colonizzazione è associata alla promozione della crescita delle piante e alla soppressione dello sviluppo larvale di Agrotis epsilon (Hufnagel) [10]. Metarhizium guizhouense ha attivato la -1,3-glucanasi e la chitinasi nella buccia del frutto di Lansium parasiticum, determinando l'inibizione della crescita di Botrytis sp. e Fusarium sp. sul frutto di Aglaia dookkoo Griff [11]. Inoltre, quando M. anisopliae è stato applicato alle piantine di arachidi, sono stati attivati ​​una varietà di fattori di trascrizione tra cui WRKY, MYC, TGA e fattori di trascrizione sensibili all'etilene, mentre sono stati espressi in modo differenziale anche i trasportatori di nitrati e gli elementi sensibili alla disidratazione che legano le proteine ​​[12] . Ciò suggerisce che M. anisopliae regola i geni di difesa della pianta mentre colonizza la pianta. Tuttavia, si sa relativamente poco sui meccanismi alla base delle risposte di difesa delle piante in seguito all'infezione da Metarhizium. Gli effettori sono un mezzo comune attraverso il quale i microrganismi regolano la resistenza delle piante [13]. L’attivazione della resistenza delle piante è solitamente caratterizzata da un’esplosione ossidativa e dall’induzione di ormoni, metaboliti e altri segnali [13]. Gli ormoni vegetali SA e JA svolgono un ruolo importante nell'indurre la resistenza delle piante, mediando due percorsi separati di segnalazione della difesa [14]. La via di segnalazione SA funziona principalmente nella risposta allergica delle piante e nella resistenza sistemica acquisita ai patogeni, ma può anche essere coinvolta nelle risposte indirette di difesa delle piante indotte dall'alimentazione di insetti pungenti [15]. L’accumulo di SA è associato ad una maggiore espressione di geni che codificano per le proteine ​​di trasferimento lipidico (LTP) e la fenilalanina ammoniaca-liasi (PAL) [16], che mediano la sintesi e l’accumulo di metaboliti specializzati a valle come flavonoidi e lignina [17]. La via di segnalazione JA funziona nelle risposte dirette e indirette a danni meccanici, agenti patogeni fungini e insetti nocivi. Gli studi hanno dimostrato che la segnalazione di JA ha un effetto regolatore sulla sintesi di metaboliti specializzati come terpenoidi, fenilpropanoidi e alcaloidi, che hanno una vasta gamma di funzioni biologiche [18]. È stato dimostrato che alcuni metaboliti specializzati si accumulano nelle cellule vegetali in seguito al trattamento con metilJA (MeJA), tra cui il paclitaxel nelle specie Taxus [19,20], i terpenoidi nella Centella Asiatica (L.) Urban [21] e le saponine nel ginseng [22] . L'applicazione di SA e chitosano (CHT) come elicitori ha indotto l'accumulo di lignina e reazioni enzimatiche di difesa nei pomodori, che hanno ridotto l'incidenza dell'infezione da Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi [23]. Inoltre, i livelli di JA e SA nel grano sono stati accumulati in modo significativo mediante l’applicazione dell’elicitore PeaT, migliorando la risposta di difesa contro l’afide dell’avena Sitobion avenae (Fabricius) [24]. Ciò indica che l’immunità delle piante potrebbe essere regolata da questi effettori attraverso ormoni vegetali e metaboliti.

Cistanche tubulosa: migliora il sistema immunitario

Le proteine ​​comuni nella membrana extracellulare dei funghi (CFEM) sono presenti in un'ampia gamma di funghi. Codificano domini che solitamente sono lunghi 60 aminoacidi (aa) e contengono otto cisteine ​​distanziate in modo caratteristico [25]. I domini CFEM sono simili ai domini simili al fattore di crescita epidermico (EGF), che funzionano come recettori extracellulari, trasduttori di segnale o molecole di adesione nelle interazioni ospite-patogeno [26]. Le proteine ​​contenenti domini CFEM possono manipolare la risposta di resistenza delle piante agendo come effettori. Nel fungo della ruggine delle foglie di grano Puccinia triticina Erikas, il candidato effettore CFEM PTTG_08198 ha accelerato il progresso della morte cellulare e ha promosso l'accumulo di specie reattive dell'ossigeno (ROS) [27]. Il fungo antracnosi Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils contiene cinque effettori (CgCFEM6, 7, 8, 9 e 15) che hanno dimostrato di sopprimere la morte cellulare programmata indotta da BAX nella Nicotiana benthamiana Domin [28]. È stato segnalato che il fungo micorrizico fitosimbiotico Laccaria bicolor (Maire) PDOrton secerne diverse proteine ​​CFEM, come Lac310796, Lac296573 e Lac296572, nei tessuti simbiotici [29]. Sebbene le complesse funzioni di queste proteine ​​non siano state studiate ulteriormente nella simbiosi micorrizica, i risultati precedenti suggeriscono che le proteine ​​CFEM possono funzionare nella segnalazione tra funghi e piante. M. anisopliae può funzionare come fungo entomopatogeno o endofitico in una pianta ospite [30]. Tuttavia, il ruolo delle proteine ​​CFEM non è stato ancora riportato. Abbiamo precedentemente identificato una proteina contenente un dominio CFEM in M. anisopliae, MaCFEM85 (ID GenBank: MZ682609) [31]. Qui, riportiamo la relazione tra MaCFEM85 e la chinasi MsWAK16 associata alla parete di Medicago sativa. Abbiamo analizzato la sequenza MaCFEM85 e condotto esperimenti per determinare quali residui sono critici per l'interazione con MsWAK16. Infine, utilizzando N. benthamiana come pianta modello, abbiamo valutato le risposte di difesa delle piante alla Botrytis cinerea e all'afide Myzus persicae con e senza espressione transitoria di MaCFEM85 e MsWAK16.

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2. Risultati

2.1. MaCFEM85 era strettamente correlato ai CFEM fungini non patogeni ed era localizzato nella membrana plasmatica

È stato costruito un albero filogenetico per analizzare le relazioni tra MaCFEM85 e altre proteine ​​CFEM da funghi modello patogeni e non patogeni. Questi includevano Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl)., Neurospora crassa Shear & BODodge e Beauveria bassiana (Bals.) (vedere Sezione 4). MaCFEM85 era strettamente correlato alle proteine ​​CFEM in B. bassiana e quindi evolutivamente più vicino ai funghi non patogeni che a quelli patogeni (Figura 1a).

Figura 1a

2.2. MaCFEM85 è stato sovraregolato durante le interazioni con M. sativa

Le chinasi simili a recettori associati alla parete (WAK) rappresentano un sottogruppo all'interno della superfamiglia delle proteine ​​chinasi simili a recettori (RLK) e includono un dominio extracellulare, un'elica transmembrana e un dominio chinasico intracellulare. Svolgono un ruolo importante nella regolazione della crescita delle piante, dello sviluppo, della risposta allo stress e delle vie di segnalazione della resistenza ai patogeni [32]. L'RNA è stato estratto dalle ife di M. anisopliae e dalle radici di M. sativa dopo la co-incubazione per studiare i modelli di espressione di MaCFEM85 e MsWAK16. Sia MaCFEM85 che MsWAK16 sono stati espressi a livelli significativamente più alti durante la co-incubazione da 12 a 60 h (Figura 1c,d). Da 0 a 36 ore, l'espressione di MaCFEM85 aumenta gradualmente, raggiungendo il picco a 36 ore. Era 593 volte più espresso nella combinazione di M. anisopliae e M. sativa rispetto a M. anisopliae coltivato da solo. Sebbene l'espressione di MaCFEM85 fosse leggermente diminuita nel periodo di 48-60 ore, era comunque espressa a livelli significativamente più alti rispetto a M. anisopliae coltivato da solo. Anche MsWAK16 era significativamente sovraregolato, con un picco di espressione a 36 ore. In M. sativa infettata da M. anisopliae, MsWAK16 era 89,06 volte più espresso rispetto a M. sativa senza M. anisopliae. Dalle 36 alle 60 ore, i livelli di MsWAK16 diminuivano leggermente, ma la sua espressione era ancora significativamente più alta rispetto alle piante non inoculate.

2.3. MaCFEM85 interagisce con MsWAK16 in vitro e in vivo

Per studiare il potenziale meccanismo funzionale di MaCFEM85 in risposta al trattamento con M. anisopliae, è stato eseguito uno screening di due ibridi di lievito (Y2H) per identificare preliminarmente le proteine ​​ospiti che interagiscono con MaCFEM85. L'interazione tra il dominio extracellulare di MsWAK16 (MsWAK16-ED) e MaCFEM85 è stata esaminata con un test a due ibridi di lievito uno a uno utilizzando MaCFEM85 in pGBKT7 come vettore BD e MsWAK16 in pGADT7 come vettore AD. Tutto il lievito trasformato è cresciuto bene su terreno carente di SD-T/L, mentre il gruppo di controllo positivo e il gruppo sperimentale sono cresciuti con successo su terreno carente di SD-T/L/H/A + X- -gal. Ciò indicava che MaCFEM85 poteva interagire con MsWAK16-ED (Figura 2a).

Figura 2. Convalida dell'interazione tra MaCFEM85 e MsWAK16.

Per la validazione in vitro, MsWAK16-ED (che codifica per un prodotto di 60 kDa) marcato con glutatione-S-transferasi (GST) è stato inserito in pGEX6-P2 e MaCFEM85 marcato con poliistidina (His) ( che codifica un prodotto di 17 kDa) è stato inserito in pET-21b. L'immunoblotting con anticorpi His e GST ha mostrato che la proteina ricombinante MaCFEM85-His ha interagito con la preda GST-MsWAK16-ED ma non con GST da sola e che GST-MsWAK16- ED ha interagito con His -MaCFEM85 (Figura 2b). Per confermare ulteriormente l'interazione tra MaCFEM85 e MsWAK16, abbiamo eseguito un test di complementazione a fluorescenza bimolecolare (BiFC) con i costrutti MaCFEM85-YFPN e MsWAK16-YFPC. La co-espressione di MaCFEM85-YFPN e MsWAK16-YFPC nelle foglie di tabacco ha generato un segnale di fluorescenza giallo, indicando che MaCFEM85 ha interagito con MsWAK16 (Figura 2c).

2.4. Siti chiave per le interazioni MaCFEM85 e MsWAK16

Per definire la regione di MaCFEM85 necessaria per l'interazione con MsWAK16-ED, i domini proteici sono stati previsti con il software online SMART (Figura 3a). MaCFEM85 conteneva un dominio CFEM nella regione 19-86 aa. È stata prevista anche la struttura terziaria (Figura 3b). Le otto cisteine ​​in questo dominio hanno prodotto quattro legami disolfuro (CYS26 e CYS69, CYS30 e CYS64, CYS43 e CYS50 e CYS52 e CYS85), mantenendo la stabilità della proteina (Figura 3b). Per convalidare i presunti siti di interazione in MaCFEM85, sette versioni mutate della proteina sono state generate e inserite in pGBKT7 come proteine ​​esca. Ciascun vettore ricombinante è stato co-trasfettato con AD-MsWAK16-ED nel ceppo Y2H Gold. Il ceppo con CYS52 mutato non è cresciuto su terreni selettivi (Figura 3c, delineati in rosso), indicando che CYS52 è richiesto per l'interazione di MaCFEM85 con MsWAK16-ED.

2.5. L'interazione di MaCFEM85 con MsWAK16 attiva la risposta immunitaria delle piante

2.5.1. Valutazione del ruolo di MaCFEM85 e MsWAK16 nella resistenza alle malattie contro B. cinerea

Per esplorare il possibile coinvolgimento di MaCFEM85 e MsWAK16 nelle risposte di difesa dei patogeni, abbiamo esaminato se la sovraespressione di MaCFEM85, MsWAK16 o MaCFEM85 e MsWAK16 potesse conferire una maggiore resistenza a B. cinerea. Abbiamo espresso transitoriamente questi vettori nelle foglie di N. benthamiana. Un test Western blot ha mostrato che MaCFEM85 e MsWAK16 erano espressi a livelli comparabili quando erano espressi da soli o insieme, il che dimostra che MaCFEM85 e MsWAK16 erano espressi con successo nel tabacco (Figura 4a). Sono stati eseguiti anche test della malattia utilizzando N. benthamiana infiltrata con MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 o il controllo GFP. Le lesioni erano significativamente più piccole (di circa il 30% a 2 giorni dopo l'inoculazione) sulle foglie infiltrate con MaCFEM85, MsWAK16 o MaCFEM85+MsWAK16 rispetto alle piante di controllo (Figura 4b). Questi dati dimostrano che l'espressione transitoria di MaCFEM85 in N. benthamiana ha conferito una maggiore resistenza a B. cinerea e che MaCFEM85 e MsWAK16 regolano positivamente la risposta di difesa contro B. cinerea.

Figura 3. Identificazione del sito di interazione tra MaCFEM5 e MsWAK16.

Figura 4. Induzione della resistenza delle piante mediante espressione transitoria di MaCFEM85 e MsWAK16.

2.5.2. Valutazione del ruolo di MaCFEM85 e MsWAK16 nella difesa degli afidi in N. benthamiana

Per studiare ulteriormente il ruolo di MaCFEM85 e MsWAK16, le piante di N. benthamiana che esprimevano transitoriamente MaCFEM85 e MsWAK16 sono state infestate da M. persicae e le popolazioni sono state valutate. Per questo esperimento, un'ampia area di ciascuna foglia di N. benthamiana è stata agroinfiltrata con il vettore binario ricombinante pYBA1132 contenente MaCFEM85 e MsWAK16. GFP è stato utilizzato come controllo. A 12 ore dall'infiltrazione, 20 adulti di M. persicae sono stati ingabbiati su ciascuna foglia, esponendo l'area infiltrata agli afidi. Nei tre giorni successivi è stata registrata la mortalità degli afidi adulti ed il numero delle neanidi; le ninfe furono poi rimosse. Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nel rischio di mortalità tra le popolazioni di M. persicae che si nutrivano di piante che esprimevano MaCFEM85, MsWAK16 o MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, p < 0,30081 ) (Figura 4c). Tuttavia, a 24, 48 e 72 ore, il numero medio di progenie prodotta da ciascun afide adulto era significativamente più alto su N. benthamiana che esprimeva il controllo GFP rispetto a quelli che esprimevano MaCFEM85, MsWAK16 o MaCFEM85+MsWAK16 (Figura 4d).

2.5.3. Valutazione del ruolo di MaCFEM85 e MsWAK16 nell'accumulo di ormoni e nell'espressione genica correlata agli ormoni

Per analizzare le differenze tra le risposte di difesa delle piante di N. benthamiana che esprimono eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 e MaCFEM85+MsWAK16, abbiamo misurato i livelli di JA, SA e di flavonoidi totali, nonché l'espressione di geni correlati. I risultati hanno mostrato che i livelli di JA e SA differivano tra le piante che esprimevano eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 e MaCFEM85+MsWAK16 (Figura 5a). Rispetto a quelli che esprimevano eGFP, i livelli di JA erano significativamente più bassi nelle piante che esprimevano MaCFEM85; I livelli di SA erano leggermente aumentati, ma le differenze non erano significative. Al contrario, le piante che esprimono MsWAK16 non hanno mostrato differenze significative nei livelli di JA rispetto al controllo eGFP, mentre i livelli di SA erano significativamente inferiori rispetto al controllo (Figura 5a). I livelli di JA e SA erano significativamente aumentati e diminuiti, rispettivamente, nelle piante che esprimevano MaCFEM85+MsWAK16 rispetto a eGFP.

Figura 5. Livelli ormonali ed espressione genica della risposta ormonale

Il contenuto totale di flavonoidi era significativamente più alto nelle piante che esprimevano MaCFEM85+MsWAK16 rispetto a tutti gli altri gruppi di trattamento (Figura 5a). I livelli di espressione genica biosintetica erano simili nelle piante che esprimevano MsWAK16 e MaCFEM85+MsWAK16. Ad esempio, i geni correlati alla risposta JA, vale a dire COI1, MYC2 e PDF1.2, erano significativamente sovraregolati rispetto alle piante che esprimevano GFP (Figura 5b). Allo stesso modo, i geni correlati a SA NPR1, WRKY70 e PR1 erano espressi in modo significativo in modo differenziale nelle piante che esprimevano MsWAK16 e MaCFEM85+MsWAK16; NPR1 era sovraregolato, mentre WRKY70 e PR1 erano sottoregolati rispetto al controllo (Figura 5b). Abbiamo anche esaminato l'espressione di geni chiave nelle vie di sintesi dell'acido Shikimico e dei fenilpropanoidi, entrambe correlate alla sintesi dei flavonoidi. In generale, l’espressione di MaCFEM85 da sola non ha indotto un’espressione significativamente più elevata di questi geni nel tabacco. Tuttavia, questi geni erano sovraregolati nel tabacco che esprimeva MsWAK16 o MsWAK16+MaCFEM85 rispetto al controllo GFP (Figura 5c).

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3. Discussione

3.1. Il motivo proteico CFEM conservato svolge molteplici funzioni nelle specie fungine

Il dominio CFEM è esclusivo dei funghi e si trova comunemente nelle proteine ​​della membrana extracellulare dei funghi. Il dominio ha avuto origine nel più recente antenato comune di Ascomycota e Basidiomycota [33]. Ricerche recenti hanno dimostrato che le proteine ​​CFEM nei patogeni fungini possono agire come regolatori immunitari delle piante, causando la soppressione o l'attivazione immunitaria della pianta ospite a seconda del tipo di infezione [28,34,35]. Ci sono state poche segnalazioni di proteine ​​contenenti domini CFEM in M. anisopliae, solo nel contesto di un confronto evolutivo con altri funghi [36]. In questo studio, abbiamo confrontato le proteine ​​CFEM di M. anisopliae con altre proteine ​​CFEM note sia in funghi patogeni che non patogeni. Abbiamo confermato che l'omologo più vicino di MaCFEM85 è Cfem5 trovato in Beauveria bassiana, una delle 12 proteine ​​CFEM in quella specie (Figura supplementare S1). BbCfem5 è essenziale per l'acquisizione del ferro [37]. Inoltre, in base alla struttura terziaria prevista, il dominio CFEM in MaCFEM85 è molto simile alla proteina antigene di superficie 2 (CSA2) trovata in Candida albicans (CPRobin) Berkhout, in cui 65 residui (96% della sequenza) sono stati modellati con 99,8 % di confidenza [31]. La Candida albicans è un patogeno animale; CSA2 svolge un ruolo importante nella crescita e nella patogenicità estraendo l'eme dall'emoglobina e trasportando l'eme dalla parete cellulare al plasma [38–40]. Ipotizziamo che MaCFEM85 possa essere coinvolto nella virulenza di M. anisopliae degli insetti ospiti. Queste funzioni combinate di MaCFEM85 nell’infezione patogena degli animali e nell’attivazione dell’immunità delle piante rendono la proteina un entusiasmante obiettivo di ricerca futura.

3.2. I legami disolfuro sono strutture importanti per la funzione delle proteine

L'integrità conformazionale di una struttura proteica è direttamente correlata alla sua capacità di funzionare. I legami disolfuro formati dalle coppie di cisteina promuovono il ripiegamento delle proteine ​​e la stabilità conformazionale e sono considerati siti chiave per il riconoscimento e il legame di specifici recettori o ligandi [41]. Ad esempio, l’interruzione di uno qualsiasi dei tre legami disolfuro conservati nella proteina effettrice AVR4 del patogeno vegetale Cladosporium fulvum determina una sensibilità alla proteasi e una ridotta capacità di legare la chitina [42]. In altre tre proteine ​​di C. fulvum (ECP1, ECP2 ed ECP5), singole sostituzioni di alanine con cisteine ​​smorzano la risposta ipersensibile del pomodoro, indicando che le cisteine ​​sono fondamentali per mantenere la stabilità e l'attività di induzione della risposta ipersensibile [43]. Inoltre, nella proteina matura MC69 di Magnaporthe oryzae, la mutagenesi di due residui conservati di cisteina (Cys36 e Cys46) può compromettere la funzione di MC69 senza influenzare la secrezione, suggerendo l'importanza del legame disolfuro specificamente nella patogenicità di MC69 [44]. Il dominio CFEM sembra essere simile per dimensioni e modello dei residui di cisteina ai domini simili a EGF, che contengono tre o quattro paia di legami disolfuro. Le proteine ​​EGF possono funzionare come recettori sulla superficie cellulare, trasduttori di segnale o molecole di adesione nelle interazioni ospite-patogeno [45]. In questo studio, non solo abbiamo scoperto che il dominio CFEM di MaCFEM85 conteneva otto cisteine ​​conservate che formavano quattro coppie di legami disolfuro (Figura 3b), ma abbiamo anche convalidato che CFEM era il dominio critico per l'interazione tra MaCFEM85 e MsWAK16. Inoltre, attraverso la mutazione sito-diretta dei residui di cisteina in alanina, abbiamo scoperto che il residuo di cisteina in posizione 52 era il sito centrale richiesto per l'interazione (Figura 3c). Questi risultati forniscono una base per ulteriori studi sulle funzioni fisiologiche dell'interazione CFEM85-WAK16.

3.3. L'interazione di MaCFEM85 con le difese vegetali attivate da MsWAK16

Nelle interazioni microbio-pianta, le risposte di difesa delle piante sono generalmente attivate da proteine ​​effettrici microbiche. La difesa indotta sta diventando uno strumento importante nel controllo biologico dei parassiti per promuovere la resistenza. Le proteine ​​CFEM sono state identificate come effettori coinvolti nella regolazione dell'attivazione o dell'inibizione immunitaria delle piante [28,46]. Tuttavia, vi è una scarsità di ricerche pubblicate che collegano la regolazione di questi fattori immunitari ai loro ruoli specifici nelle malattie delle piante e nella resistenza agli insetti. In questo studio, abbiamo utilizzato un fungo entomopatogeno ed endofitico, M. anisopliae, per identificare un'interazione tra MaCFEM85 e una chinasi associata alla parete cellulare, MsWAK16, in M. sativa. I risultati hanno mostrato che questa interazione ha ridotto il rapporto delle lesioni dopo l'inoculazione con B. cinerea (Figura 4b) e ha diminuito il tasso di crescita della popolazione di M. persicae (Figura 4d), indicando che l'interazione tra MaCFEM85 e MsWAK16 ha aumentato la resistenza di M. sativa agli afidi. I cambiamenti nei livelli di JA, SA ed etilene (ET) possono essere utilizzati come marcatori per valutare l'induzione della resistenza delle piante [47,48]. Qui, abbiamo dimostrato che MaCFEM85 ha interagito con MsWAK16 per influenzare la resistenza delle piante attraverso la regolazione ormonale e per inibire il tasso riproduttivo di M. persicae (Figura 4d). Studi simili sono stati riportati in precedenza. Ad esempio, è stato dimostrato che la proteina effettrice del Brevibacillus laterosporus PeBL1 induce l’accumulo di JA e SA nei pomodori e diminuisce il tasso di crescita delle popolazioni di seconda e terza generazione di M. persicae che si nutrivano di quelle piante. Inoltre, le piante di pomodoro irrorate con effettori hanno un effetto repellente su M. persicae [49]. L'applicazione della proteina elicitrice PeBC1 al fagiolo comune (Phaseolus vulgaris L.) porta a effetti subletali pronunciati e significativi sugli afidi del pesco verde. Le piante trattate con PeBC1 mostrano una significativa sovraregolazione dei geni correlati a JA e SA [50]. L’elicitore PeBb1 della Beauveria bassiana riduce la fecondità di M. persicae sul tabacco e induce l’espressione di geni correlati a JA ed ET [51]. Nel presente studio, l'espressione transitoria di MaCFEM85 e MsWAK16 nel tabacco ha sovraregolato significativamente i geni COI1, MYC2 e PDF1.2 correlati alla risposta JA (Figura 5b) e ha aumentato il contenuto di JA e di flavonoidi totali (Figura 5a), che era paragonabile ai risultati in letteratura come sopra descritto. Tuttavia, non abbiamo rilevato livelli elevati di SA nel tabacco 12 ore dopo l'infiltrazione e le piante che esprimevano transitoriamente MsWAK16 o MaCFEM85+MsWAK16 hanno mostrato livelli di SA significativamente ridotti e una sottoregolazione dei geni coinvolti nella risposta SA (Figura 5a,b) . Ciò ha dimostrato che la stimolazione di diversi ormoni vegetali può portare non solo ad attività sinergiche ma anche a diafonia e feedback, consentendo alle piante di rispondere adeguatamente a stimoli diversi. Nelle piante sono stati precedentemente segnalati livelli aumentati di JA ma bassi livelli di SA. Ad esempio, in A. thaliana difettosa per l'accumulo di SA, i livelli di JA erano 25-volte più alti rispetto a quelli di A. thaliana di tipo selvatico e i geni responsivi a JA erano attivati ​​[52]. È stato anche riportato che alcuni batteri possono aumentare i livelli di JA nelle piante per inibire l’accumulo di SA, evitando i danni causati da SA. Ad esempio, Pseudomonas syringae prende di mira il recettore COI1 attraverso una tossina, la coronatina, che regola negativamente la via JA [53]. Ciò promuove la sovraregolazione indotta da MYC2-dei fattori di trascrizione ANAC019, ANAC055 e ANAC072 [54], inibendo la trascrizione di ICS1 (un gene chiave per la sintesi di SA) e quindi sottoregolando la produzione di SA e la trasduzione del segnale. Nel presente studio, l'interazione tra MaCFEM85 e MsWAK16 ha portato ad un aumento dell'accumulo di JA e alla sovraregolazione dei geni che rispondono a JA ma all'inibizione dell'accumulo di SA e della trascrizione dei geni correlati a SA. Ciò ha indicato che l’interazione tra MaCFEM85 e MsWAK16 ha indotto JA, migliorando così la resistenza delle piante agli afidi.

In N. benthamiana che esprime transitoriamente MaCFEM85 e MsWAK16, i livelli di JA erano aumentati e le dimensioni delle lesioni di B. cinerea erano diminuite (Figura 4b), in linea con gli studi precedenti. JA è coinvolta nella resistenza delle piante agli insetti e ai patogeni necrotrofi [52,55]. Essendo un patogeno necrotrofico, B. cinerea è stato inibito dall'accumulo di JA ed ET [56]. Nel mutante ein2-1 con deficit di ET di A. thaliana e nel mutante coi1-1 con risposta JA, i livelli del gene di difesa a valle, PDF1.2, erano significativamente ridotti e la sensibilità a B. cinerea era aumentata [ 57]. Abbiamo trovato qui che l'accumulo di JA e la trascrizione dei geni correlati a JA erano significativamente aumentati in N. benthamiana che esprimeva transitoriamente MaCFEM85 e MsWAK16, mentre l'accumulo di SA e la trascrizione dei geni correlati a SA erano inibiti. Anche l'espressione di MaCFEM85 e MsWAK16 ha mostrato un effetto inibitorio su B. cinerea. Ciò ha indicato che JA è stato attivato da MaCFEM85 e MsWAK16 e ha svolto un ruolo di primo piano nella resistenza delle piante a B. cinerea.

4. Materiali e metodi

4.1. Ceppi fungini, materiali vegetali e metodi di coltura

I ceppi isolati di Metarhizium anisopliae Ma 9 sono stati coltivati ​​su terreno PSA (patata-zucchero) (200 g di estratto di patata sbucciata bollita in acqua, 20 g di saccarosio e 15 g di agar/L). La polvere fresca di sporangio è stata raccolta dopo 10 giorni. Le piante di Nicotiana benthamiana sono state coltivate in una camera climatica artificiale con un ciclo luce/buio di 14/10 ore (27/25 ◦C). Per l'espressione genica transitoria tramite trasformazione mediata da Agrobacterium, il ceppo GV3101 di Agrobacterium tumefaciens è stato coltivato in terreno Luria Broth (LB) (10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di NaCl/L). Il ceppo di lievito Gold (OE Biotech Co., Ltd., Shanghai, Cina) è stato coltivato su terreno estratto di lievito peptone destrosio (YPDA) (10 g di estratto di lievito, 20 g di peptone, 20 g di glucosio e 0,03 g di adenina emisolfato/L). Per ciascun vettore e ceppo sono stati utilizzati antibiotici appropriati, vale a dire rifampicina, kanamicina o ampicillina (rispettivamente 25, 50 o 50 µg/mL). I ceppi e i plasmidi utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella Supplementare S1. I semi di Medicago sativa sono stati sterilizzati in superficie con etanolo al 75% per 1 minuto, seguito da NaClO al 50% (5,5%) per 15 minuti. I semi sono stati accuratamente miscelati e poi lavati in acqua sterile tre volte per 5 minuti ciascuno. I semi sono stati incubati a 4 ◦C al buio per oltre 24 ore, quindi germinati su piastre di agar con acqua all'1% a temperatura ambiente durante la notte. Tre giorni dopo la germinazione, le piantine in via di sviluppo sono state trasferite su carta da filtro su piastre Petri sterili da 9- cm, con 20 piantine per piastra. I trattamenti e il controllo sono stati assegnati rispettivamente a 15 piatti ciascuno. Le piantine sono state quindi irrigate con 10 mL di sospensione di spore di M. anisopliae contenente 107/mL, e il controllo è stato irrigato con 10 mL di acqua sterile. A 0, 12, 24, 48 e 60 ore, una selezione casuale di piantine è stata prelevata da tre piastre Petri per ciascun intervallo di tempo. I campioni sono stati congelati in azoto liquido e conservati a -80 ◦C.

4.2. qRT-PCR e costruzione del plasmide

L'RNA totale è stato estratto da M. anisopliae (ife) e M. sativa (radici) con il reagente TRIzol (Invitrogen, CA, USA) seguendo le istruzioni del produttore. La qualità e l'abbondanza dell'RNA risultante sono state misurate con un NanoPhotometer® (Implen, Monaco, Germania). La sintesi del cDNA del primo filamento (fino a 2ug di RNA) è stata eseguita utilizzando 5 × All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Canada) seguendo le istruzioni del produttore. La qRT-PCR è stata eseguita utilizzando la master mix qPCR 2×SYBR Green della EVER BRIGHT ® INC. degli Stati Uniti e il sistema ABI QuantStudio 5 seguendo le istruzioni del produttore. I primer utilizzati per ciascun gene sono elencati nella Tabella Supplementare S2. Maury [58], Msactin [59] e Nbactin [60] sono stati utilizzati come geni di riferimento interno per la normalizzazione dei dati di espressione. La reazione è stata eseguita nelle seguenti condizioni: 5 minuti a 95 ◦C, seguiti da 40 cicli a 95 ◦C per 15 s e a 60 ◦C per 40 s. C'erano tre repliche tecniche per ciascun campione. L'espressione relativa è stata calcolata utilizzando il metodo 2−∆∆Ct [61]. La significatività statistica è stata determinata utilizzando un'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) e il test a range multiplo di Duncan in SPSS v20.0 (SPSS).

4.3. Espressione transitoria delle proteine ​​in N. benthamiana

La sequenza codificante MaCFEM85 (CDS) è stata amplificata con la DNA polimerasi ultra-fedeltà utilizzando il cDNA come modello. Per i test di localizzazione subcellulare, i prodotti PCR contenenti il ​​CDS per MaCFEM85 sono stati clonati rispettivamente in pYBA1132-eGFP (digerito con EcoRI e SalI) e pcambia1300-cherry (EcoRI e SacI). Tutti i costrutti sono stati validati con sequenziamento (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Pechino, Cina). I primer utilizzati in questo studio sono elencati nella Tabella Supplementare S2. Per l'espressione transitoria di MaCFEM85-eGFP e MaCFEM85-mCherry in N. benthamiana, il ceppo GV3101 di A. tumefaciens è stato trasformato con ciascun plasmide e verificato con PCR. L'Agrobacterium è stato coltivato durante la notte a 28 ◦C con agitazione. Le cellule sono state raccolte tramite centrifugazione di 5 minuti a 5000 giri al minuto a temperatura ambiente, lavate tre volte con acqua bidistillata sterile e risospese in tampone MgCl2 10 mM (contenente 10 mM MES e 10 mM acetosiringone, pH 5,7). La sospensione cellulare è stata regolata su un OD600 di 0,5, quindi infiltrata nella parte inferiore delle foglie di N. benthamiana da 4- a 5- settimane con una siringa da 1- ml. Ciascuna foglia è stata infiltrata con 50 µl di A. tumefaciens; Sono state trattate tre foglie per pianta e tre piante erano in ciascun gruppo di trattamento. Le foglie trattate sono state raccolte dopo 30 ore e visualizzate con un microscopio confocale Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Germania) per determinare la localizzazione subcellulare.

benefici della cistanche per il sistema immunitario degli uomini

4.4. Analisi filogenetica

Un albero filogenetico è stato costruito utilizzando il metodo di unione dei vicini in MEGA X. 1000 repliche bootstrap utilizzavano il modello P-distanza. Le sequenze di aminoacidi utilizzate per generare l'albero sono state ottenute con ricerche BLASTP nel database NCBI di funghi correlati (ad esempio, Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus, Lasiodiplodia theobromae, Gliocladium roseum , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana e Paecilomyces lilacinus) utilizzando MaCFEM85 come query.

4.5. Saggi di due ibridi di lievito

Il Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Clontech Laboratories, Inc.; ora Takara Bio USA, Inc.) è stato utilizzato per verificare l'interazione tra MaCFEM85 e MsWAK16. MaCFEM85 senza il peptide segnale è stato introdotto in pGBKT7 come esca e il dominio extracellulare di MsWAK16 (MsWAK16-ED) è stato inserito in pGADT7 come preda. La preparazione e le trasformazioni delle cellule competenti per il lievito sono state eseguite utilizzando un Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, USA) seguendo le istruzioni del produttore. I plasmidi dell'esca e della preda sono stati co-trasformati nel ceppo di lievito Gold. Le interazioni proteina-proteina sono state analizzate in base alla crescita su piastre SD double dropout medium (DDO, SD/-Trp-Leu) e SD quadruple dropout medium (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade).

4.6. Saggio BiFC

Per generare i costrutti BiFC, i vettori pUC-SPYNE e pUC-SPYCE sono stati linearizzati mediante digestione con BamHI. I CDS a lunghezza intera di MaCFEM85 e MsWAK16 sono stati ciascuno clonati e inseriti nei plasmidi linearizzati utilizzando un enzima ricombinante per ottenere i costrutti MaCFEM85-YFPN e MsWAK16-YFPC. I plasmidi contenenti MaCFEM85 e MsWAK16 sono stati co-trasformati con vettori vuoti come controlli negativi (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE e pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Tutti i vettori sono stati introdotti in N. benthamiana tramite trasformazione mediata da Agrobacterium come descritto sopra. I segnali di fluorescenza sono stati osservati nelle cellule epidermiche fogliari utilizzando un microscopio confocale Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Germania). I primer utilizzati per la costruzione del vettore sono elencati nella Tabella Supplementare S2.

4.7. Saggio di pull-down GST

Per i test pull-down GST, MsWAK16-ED è stato inserito nel vettore pGEX-6P-2 e MaCFEM85 è stato inserito in pET-21b. Le proteine ​​di fusione purificate (GST- MsWAK16- ED) e la proteina a vuoto pGEX-6P-2 (GST) sono state utilizzate come proteina esca e pET-21 purificata La proteina di fusione b-MaCFEM85 (His-MaCFEM85) è stata utilizzata come preda. I test di pulldown GST sono stati eseguiti con il sistema di purificazione delle proteine ​​Mag-Beads GST Fusion (Sangon Biotech, Shanghai, Cina) seguendo le istruzioni del produttore. In breve, le Mag-Beads sono state lavate cinque volte con soluzione salina tamponata con fosfato 1× (PBS, pH 7,4) per rilasciare il protettore alcolico e sono stati quindi aggiunti 10 mL di GST o GST-MsWAK16-ED. Le sfere sono state miscelate per inversione a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, le Mag-Beads sono state lavate cinque volte con 1× PBS. His-MaCFEM85 è stato aggiunto a Mag-Beads già legati con GST e la miscela è stata incubata durante la notte a 4 ◦C con rotazione. Le sfere sono state quindi lavate cinque volte con 1× PBS per rimuovere le proteine ​​non legate. Successivamente, le proteine ​​immobilizzate sulle sfere sono state separate mediante SDS-PAGE, trasferite su una membrana di nitrocellulosa (100 V, 1 h) e analizzate tramite Western blot. Le membrane sono state lavate tre volte per 10 minuti ciascuna con PBS + Tween (PBST). Le membrane sono state bloccate per 2 ore a temperatura ambiente con latte scremato al 5%, quindi incubate con l'anticorpo monoclonale murino ProteinFind anti-His (TransGen Biotech, Pechino, Cina) (diluito 1:3000) o l'anticorpo monoclonale murino ProteinFind anti-GST per 2 ore. h a 4 ◦C. Le membrane sono state quindi immerse nell'anticorpo IgG(H+L) (HRP) anti-coniglio di capra ProteinFind (TransGen Biotech, Pechino, Cina) (diluito 1:5000) per 1 ora a temperatura ambiente. Le membrane sono state visualizzate con il kit EasySee® Western Blot (TransGen Biotech, Pechino, Cina) seguendo le istruzioni del produttore.

4.8. Identificazione del Sito Chiave nel MaCFEM85

Per determinare la dimensione richiesta per l'interazione di MaCFEM85 con MsWAK16, è stata eseguita l'amplificazione PCR per generare più forme troncate di MaCFEM85. Il dominio CFEM (MaCFEM85-CFEM; residui aa 19–86) e il terminale C senza il dominio CFEM (MaCFEM85-C, residui aa 87–170) sono stati inseriti nel vettore pGBKT7 come proteina esca (Tabella Supplementare S1). Altre cinque varianti sono state costruite utilizzando la sintesi polipeptidica per mutare la cisteina in alanina nelle posizioni 26, 30, 43, 52 e 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM8543, ∆ CFEM8552 e ∆CFEM858 tutti rispettivamente). Queste varianti sono state utilizzate per eseguire esperimenti Y2H con MsWAK16-ED. Le cellule di lievito trasformate sono state analizzate per la crescita su piastre sintetiche dropout SD/-Trp-Leu e piastre SD/-Trp-Leu-His-Ade contenenti X- -Galactosidasi (X- -Gal).

4.9. Saggi di resistenza delle piante

Myzus persicae sono stati ottenuti da Henan Quanying Biological Co., Ltd. Una settimana prima dell'inizio dei test biologici, 150 afidi adulti sono stati posti su tre piante di N. benthamiana (50 afidi per pianta). Dopo 72 ore, tutti gli adulti sono stati rimossi con un pennello morbido da artista e alle ninfe è stato permesso di nutrirsi per altri quattro giorni prima di essere trasferite a N. benthamiana per i test sulle prestazioni degli afidi.

4.10. Saggi sulle prestazioni degli afidi

Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) è stato utilizzato per valutare le prestazioni di M. persicae, la resistenza alle malattie delle piante contro B. cinerea e l'espressione di geni correlati agli ormoni. Gli agrobatteri contenenti pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 o pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 sono stati coltivati ​​in LB integrato con antibiotici appropriati per 36 ore a 28 ◦C. Le cellule sono state lavate tre volte, quindi risospese in tampone di infiltrazione (10 mM MgCl2, 10 mM MES e 100 µM acetosiringone, pH 5,6) ad una OD600 di 0,6. Per la coinfezione, i batteri portatori di MaCFEM85 e MsWAK16 sono stati regolati su un OD600 di 1,2 e quindi miscelati in volumi uguali. Le foglie completamente espanse sono state infiltrate con batteri utilizzando siringhe senza ago da 1-ml. Tre foglie sono state infiltrate su ciascuna pianta e ciascun trattamento è stato applicato a tre piante per un totale di 12 piante per esperimento.

Per i test sulle prestazioni degli afidi, 20 afidi adulti sono stati applicati all'area infiltrata di ciascuna foglia 12 ore dopo l'applicazione dell'Agrobacterium. Gli afidi sono stati confinati utilizzando gabbie a clip del diametro di 5 mm. Ciascun trattamento è stato ripetuto cinque volte. La mortalità degli afidi adulti e il numero di ninfe appena deposte sono stati registrati quotidianamente per tre giorni. B. cinerea è stata coltivata per cinque giorni il PDAY. A 12 ore dall'infiltrazione dell'Agrobacterium, il B. cinerea appena coltivato è stato perforato in una torta di funghi di 5- mm e la superficie di crescita del micelio è stata attaccata all'area di infiltrazione sulla superficie fogliare. Per facilitare lo sviluppo della malattia, le piante sono state mantenute umide coprendole con pellicola di plastica in vassoi a 22 ◦C per facilitare la progressione della malattia. Dopo 48 ore, il progresso della malattia è stato stimato nelle foglie inoculate misurando le dimensioni delle lesioni. Per quantificare l'espressione relativa dei geni rilevanti, le tre foglie infiltrate sono state raccolte da ciascuna pianta 12 ore dopo l'infiltrazione, quindi congelate in azoto liquido e conservate a -80 gradi. L'estrazione dell'RNA totale, la sintesi del cDNA e la qRT-PCR sono state condotte come descritto nella Sezione 3.2. I livelli di acido salicilico (SA), acido jasmonico (JA) e flavonoidi sono stati misurati in 15 foglie di N. benthamiana filtrate per trattamento. Le foglie sono state raccolte, congelate in azoto liquido, quindi conservate a -80 gradi. Gli ormoni vegetali sono stati quantificati utilizzando i kit ELISA per l'acido saliciclico vegetale e l'acido jasmonico vegetale (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.) e i flavonoidi sono stati quantificati utilizzando il kit Micro Plant Flavonoids Assay Kit (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.) seguendo le istruzioni del produttore.

4.11. Analisi statistica

I dati sono stati analizzati in SPSS v20.0. Differenze significative nei livelli di espressione di MaCFEM85 e MsWAK16 sono state determinate utilizzando il test t di Student. Differenze significative nei livelli di SA, JA e flavonoidi sono state determinate utilizzando l'ANOVA unidirezionale e il test a range multiplo di Duncan con una soglia di p <0,05.

5. Conclusioni

In questo studio, abbiamo identificato e caratterizzato una nuova proteina secreta, MaCFEM85, in M. anisopliae. Si è scoperto che è un effettore conservato che può interagire con MsWAK16 e attivare la risposta di difesa di N. benthamiana. Abbiamo dimostrato che il dominio CFEM e il residuo di cisteina nella posizione 52 in MaCFEM85 erano fondamentali per l'interazione. Questa interazione può attivare risposte immunitarie correlate a JA e meccanismi resistenti alle malattie e agli insetti nella pianta.

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