Lo stato attuale della neuroprotezione nelle cardiopatie congenite Parte 1

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La presenza di DNA ectopico nel citoplasma induce infiammazione e morte cellulare. È stato ampiamente riportato che la perdita di DNA nucleare nel citoplasma può essere rilevata principalmente dalla GMP-AMP sintasi ciclica (cGAS).

Il DNA è la molecola che specifica l'informazione genetica di ogni persona e si trova in ognuna delle nostre cellule. Ricerche recenti mostrano che il DNA può penetrare nel citoplasma attraverso determinati percorsi e influenzare la nostra memoria.

Questo fenomeno è comune negli anziani e nelle persone con deterioramento cognitivo. Quando il DNA penetra nel citoplasma, interferisce con le normali funzioni all’interno della cellula e aumenta il rischio di perdita di memoria e deterioramento cognitivo.

Tuttavia, non dobbiamo sentirci depressi e senza speranza per questo. Esistono molti modi per migliorare la memoria e le capacità cognitive per aiutarci a mantenere un cervello sano.

Innanzitutto è necessario mantenere uno stile di vita sano. Ciò include seguire una dieta equilibrata, dormire a sufficienza, fare esercizio fisico moderato e ridurre lo stress. Queste pratiche promuovono la salute del cervello, evitando così la perdita di DNA e migliorando la memoria.

In secondo luogo, è necessaria una formazione cognitiva. Ciò può includere giocare a giochi di matematica, leggere, apprendere nuove abilità, ecc. Queste attività possono aiutare a stimolare il cervello e promuovere la neurogenesi per evitare la perdita di DNA.

Infine, mantieni un atteggiamento positivo. L’instabilità emotiva e lo stress eccessivo possono causare cambiamenti nella chimica del cervello che promuovono la perdita di DNA. Pertanto, dobbiamo imparare ad affrontare positivamente le sfide della vita e mantenere un atteggiamento ottimista.

In sintesi, sebbene la perdita di DNA nel citoplasma possa influenzare la memoria, possiamo migliorare la salute del cervello, evitare la perdita di DNA e, in definitiva, migliorare la nostra memoria adottando il giusto stile di vita, impegnandoci in un allenamento cognitivo e mantenendo una mentalità positiva. Memoria e capacità cognitive. Si può vedere che abbiamo bisogno di migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria perché la Cistanche deserticola è un materiale medicinale tradizionale cinese che ha molti effetti unici, uno dei quali è quello di migliorare la memoria. L'efficacia di Cistanche deserticola deriva dai molteplici principi attivi che contiene, tra cui acido tannico, polisaccaridi, glicosidi flavonoidi, ecc. Questi ingredienti possono promuovere la salute del cervello attraverso una varietà di percorsi.

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Recentemente abbiamo segnalato che il DNA citoplasmatico a doppia elica (dsDNA) derivato dai mitocondri che è sfuggito alla degradazione lisosomiale induce una significativa citotossicità nelle cellule in cultura e in vivo. Si presume che il DNA mitocondriale citoplasmatico sia coinvolto in varie malattie e disturbi, e sono stati pubblicati sempre più articoli che lo confermano. D'altra parte, l'attuale metodo per valutare il DNA mitocondriale nel citoplasma potrebbe non essere quantitativo.

Qui, presentiamo in dettaglio un metodo per valutare le cellule di DNA mitocondriale ectopico. Questo metodo è utile nella ricerca di base e nello studio dell'invecchiamento, del morbo di Parkinson, del morbo di Alzheimer, dell'insufficienza cardiaca, delle malattie autoimmuni, del cancro e di altre condizioni.

Parole chiave: DNA ectopico; DNA mitocondriale; fattore di trascrizione mitocondriale A (TFAM); malattia di Parkinson.

1. Introduzione

Il DNA contiene informazioni importanti per la sopravvivenza e l'ereditarietà e deve essere protetto da vari fattori di stress, inclusi ossidanti e mutageni. Le cellule eucariotiche contengono mitocondri, che producono energia, insieme a molte specie attive di ossigeno, attraverso la respirazione aerobica.

Pertanto, nella cellula eucariotica, il DNA è presente nel nucleo o nei mitocondri, racchiuso rispettivamente all'interno della membrana nucleare o della membrana mitocondriale. Tuttavia, il DNA può essere presente nel citoplasma in determinate condizioni, come durante infezioni virali o non virali. 4].

Anche in alcune condizioni non infettive (ad esempio l’invecchiamento o vari disturbi legati all’età o il cancro), il DNA può fuoriuscire nel citoplasma dal nucleo o dai mitocondri [5–7].

Il DNA nel citoplasma può essere infiammatorio e tossico per le cellule. È stato ampiamente riportato che la perdita di DNA nucleare nel citoplasma induce infiammazione, citotossicità e fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP), principalmente attraverso lo stimolatore ciclico della GMP-AMP sintasi (cGAS) della via dei geni dell’interferone (STING). 5,6].

Recentemente abbiamo riportato che il DNA citosolico a doppio filamento (dsDNA) di origine mitocondriale che fugge dalla degradazione lisosomiale ha dimostrato di indurre citotossicità e neurodegenerazione in modelli cellulari della malattia di Parkinson [8]. La presenza o l'aumento di tale DNA ectopico veniva spesso indicata da immagini microscopiche rappresentative e prove circostanziali, non dall'aumento della perdita di DNA in sé.

Si prevede che la valutazione di questo DNA ectopico diventerà sempre più importante, non solo per la ricerca di base ma anche per la ricerca sull'invecchiamento e su altre malattie, come il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer, la sclerosi laterale amiotrofica, l'insufficienza cardiaca, le malattie autoimmuni, il diabete, steatoepatite non alcolica (NASH) e tumori. È stato segnalato che il percorso cGAS-STING è cruciale non solo nell'invecchiamento ma anche nella patogenesi di queste malattie [8–17].

Probabilmente a causa delle circostanze ossidative attorno ai mitocondri e della mancanza di un efficiente sistema di riparazione del DNA per il DNA mitocondriale, il DNA mitocondriale è molto più suscettibile a mutazioni o danni rispetto al DNA nucleare [18,19].

A differenza del DNA nucleare, il DNA mitocondriale esiste in copie multiple in una singola cellula e viene sintetizzato secondo necessità. Pertanto, il DNA mitocondriale potrebbe avere una probabilità molto maggiore di penetrare nel citoplasma durante l'invecchiamento o in condizioni maligne come disturbi legati all'età, disfunzione mitocondriale o tumori.

Il rilevamento e la misurazione di tale DNA citoplasmatico-mitocondriale potrebbero essere importanti per comprendere la patogenesi di varie malattie e dell'invecchiamento e potrebbero diventare un biomarcatore e un bersaglio terapeutico.

Abbiamo sviluppato un metodo semiquantitativo per valutare la fuoriuscita di DNA mitocondriale ectopico nel citoplasma e qui descriviamo il metodo in dettaglio. Questo documento consente una valutazione oggettiva della perdita di DNA mitocondriale ed è utile nello studio di varie patologie.

2. Materiali e metodi

2.1. Linee cellulari, trattamento con siRNA e analisi quantitativa PCR (qPCR).

Le cellule HeLa sono state derivate da cellule di cancro cervicale di una paziente (ATCC,CCL-2). Le cellule HeLa sono state coltivate a 37 ◦C sotto il 5% di CO2 nel Dulbecco's Modified EagleMedium (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Giappone) integrato con il 10% di siero bovinese fetale (FBS) (Biowest, Nuaillé, Francia) e una soluzione di penicillina-streptomicina ( 100 unità/mlpenicillina G e 100 µg/ml streptomicina solfato, Wako, Osaka, Giappone).

Un giorno prima della trasfezione, le cellule HeLa sono state piastrate ad una densità di 600 cellule/μL. L'espressione dei geni di interesse è stata silenziata nelle cellule HeLa utilizzando Stealth RNAi siRNA (fattore di trascrizione mitocondriale A, TFAM: HSS144251, glucocerebrosidasi, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) nel reagente di trasfezione Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) secondo le istruzioni del produttore (una concentrazione finale di RNA di 10 nM).

Tre giorni dopo l'abbattimento del siRNA, l'RNA cellulare totale è stato isolato utilizzando il TRIzolreagent secondo le istruzioni del produttore (Thermo Fisher Scientific). I modelli di cDNA sono stati sintetizzati dall'RNA purificato utilizzando il kit di sintesi ProtoScript II First StrandcDNA (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) con primer oligo (dT)20. La qPCR è stata eseguita utilizzando TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu , Giappone) e analizzati in un Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio). I primer PCR utilizzati nel presente studio erano GBA forward (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC), GBA reverse (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM forward (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM reverse (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA), gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) forward (CAGCCTCAAGATCATCAGCA) e GAPDH retromarcia (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software GraphPad Prism versione 9.3.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). I test t di Student a due code sono stati utilizzati per confrontare le medie aritmetiche tra due gruppi. I dati sono presentati come medie e ± errori standard delle medie.

2.2. Rilevazione con immunofluorescenza del DNA mitocondriale ectopico e analisi delle immagini

Un giorno prima della trasfezione, le cellule HeLa sono state piastrate a una densità di 600 cellule/μL. L'espressione dei geni di interesse è stata silenziata nelle cellule HeLa utilizzando Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) nel reagente di trasfezione Lipofectamina RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) secondo il metodo istruzioni del produttore (una concentrazione finale di RNA di 10 nM).

Tre giorni dopo l'abbattimento del siRNA, le cellule sono state sottoposte a colorazione con immunofluorescenza. Per il rilevamento del DNA mitocondriale, anticorpo anti-dsDNA (Abcam,Cambridge, UK, clone 35I9, Cat# ab27156, RRID: AB_470907 o EMD Millipore, Billerica,MA, USA, clone AC-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) ha mostrato un rapporto segnale-rumore migliore rispetto a Hoechst 33258, DAPI o Picogreen. Qui abbiamo combinato tre anticorpi primari: anticorpo anti-dsDNA (35I9 DNA) (Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907), anticorpo anti-istone-H2B (Abcam, Cat# ab134211) e anti-calore- anticorpo anti-proteina shock-60 (Hsp60) (Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444).

È possibile scegliere altri anticorpi o marcarli in modo fluorescente con l'istone, oppure in alternativa è possibile utilizzare Hsp60, ma è necessario ottimizzare le condizioni della tripla colorazione per ciascuna combinazione.

Le cellule sono state lavate due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e fissate con metanolo ghiacciato per 10 minuto a 4 ◦C. In alternativa, per la fissazione è possibile utilizzare paraformaldeide al 4% (PFA), ma i segnali di fondo sembrano molto maggiore nei campioni fissati con PFA. Dopo la fissazione, le cellule sono state lavate tre volte con soluzione salina tamponata con fosfato con Tween 20 (PBST) per 5 minuti ciascuna. Le cellule sono state permeabilizzate con PBS contenente Triton X-100 allo 0,2% (p/v) per 10 minuti.

Dopo essere state lavate tre volte con PBST per 5 minuti ogni volta, le cellule sono state incubate con albumina di siero bovino (BSA) al 2% (p/v) in PBST per 30 minuti. Le cellule sono state incubate con un singolo anticorpo primario, anticorpo anti-istone-H2B (1/400, Abcam, Cat# ab134211) diluito in BSA al 2% (p/v) in PBST O/N a 4 ◦C. Dopo essere state lavate tre volte con PBST per 5 minuti ogni volta, le cellule sono state incubate con Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17 }}) diluito in 2% (p/v) BSA in PBST per 1 ora a temperatura ambiente (TA).

Dopo essere state lavate tre volte per 5 minuti ciascuna con PBST, le cellule sono state incubate con anticorpi primari e anticorpi anti-dsDNA (35I9 DNA) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) e anti -L'anticorpo Hsp60 (1/400, Abcam, Cat# ab46798,RRID: AB_881444) diluito in BSA al 2% (p/v) in PBST è stato applicato per 1 ora a temperatura ambiente o durante la notte (O/N) a 4◦C.

Dopo essere state lavate tre volte con PBST per 5 minuti ogni volta, le cellule sono state incubate con Alexa Fluor 680-coniugato Donkey anti-Rabbit IgG(H+L) ad alto assorbimento incrociato (1/200, Thermo Fisher Scientific, Cat# A10043 , RRID: AB_2534018) ​​e Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB_2732073) diluiti al 2% (p/v) BSA in PBST per 1 ora a temperatura ambiente.

Le cellule sono state lavate tre volte con PBST per 5 minuti ogni volta e il campione è stato analizzato utilizzando un microscopio confocale A1R+ (Nikon, Tokyo, Giappone).

For more information:1950477648nn@gmail.com