Lo stato attuale della neuroprotezione nelle cardiopatie congenite Parte 2

Le immagini microscopiche sono state quindi sottoposte al calcolo delle immagini utilizzando il software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). Il segnale di Hsp60 è stato moltiplicato per "x".

Hsp60 è un'importante molecola proteica che svolge un importante ruolo biologico nel corpo umano. La ricerca degli ultimi anni ha dimostrato che la presenza di Hsp60 è strettamente correlata alla memoria umana.

Hsp60 è una proteina chaperone molecolare coinvolta principalmente nel ripiegamento, nello spiegamento, nella stabilizzazione e nella degradazione delle proteine. Questi processi sono molto importanti per il normale metabolismo e la funzione cellulare del corpo umano. Allo stesso tempo, Hsp60 ha anche effetti antiossidanti, antinfiammatori e immunomodulatori e svolge un ruolo importante nel mantenimento della salute umana e dell’equilibrio del sistema immunitario.

La ricerca ha scoperto che Hsp60 svolge un ruolo cruciale nella formazione e nel mantenimento della memoria. Durante il processo di apprendimento e memoria, le cellule cerebrali producono un gran numero di molecole Hsp60. Queste molecole possono proteggere le cellule dalle interferenze e dai danni dell'ambiente esterno per garantire il regolare progresso dell'apprendimento e della memoria. Inoltre, Hsp60 può anche influenzare il pensiero e il comportamento umano modificando la trasduzione del segnale delle cellule cerebrali e lo sviluppo dei neuroni e ha un impatto positivo sulla cognizione e sulla resistenza allo stress.

Sebbene il ruolo di Hsp60 abbia mostrato effetti positivi sul corpo umano, le persone devono anche rendersi conto che sia l’eccesso che la carenza di Hsp60 possono avere effetti negativi sulla salute umana. Pertanto, dovremmo esplorare e studiare attivamente il meccanismo dell’Hsp60 in varie condizioni fisiologiche e patologiche del corpo umano per comprendere meglio la posizione e il ruolo dell’Hsp60 nella salute umana. Si può vedere che dobbiamo migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola ha effetti antiossidanti, antinfiammatori e antinvecchiamento, che possono aiutare a ridurre l’ossidazione e le reazioni infiammatorie nel cervello, proteggendo così il cervello. salute del sistema nervoso. Inoltre, Cistanche deserticola può anche promuovere la crescita e la riparazione delle cellule nervose, migliorando così la connettività e la funzione delle reti neurali. Questi effetti possono aiutare a migliorare la memoria, la capacità di apprendimento e la velocità di pensiero e possono anche prevenire lo sviluppo di disfunzioni cognitive e malattie neurodegenerative.

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Il valore "x" è stato determinato come segue: sottraendo il segnale Hsp60 ripiegato "x" dal segnale del DNA mitocondriale nel gruppo di controllo ha reso il valore del DNA mitocondriale inferiore o uguale a zero. Il segnale dell'istone H2B è stato moltiplicato per "y".

Il valore "y" è stato determinato come segue: sottraendo il segnale H2B dell'istone ripiegato "y" dal segnale del DNA nucleare nel gruppo di controllo, il valore del DNA nucleare è stato inferiore o uguale a zero. Se il segnale di fondo diventa alto a causa della moltiplicazione, il contrasto dell'immagine moltiplicata può essere regolato per le stesse condizioni in tutti i campioni.

L'immagine della colorazione dsDNA, meno l'immagine corretta di Hsp60 moltiplicato e dell'istone H2B, è stata utilizzata per l'analisi successiva. Utilizzando la funzione "Regola soglia", queste immagini sono state binarizzate. Abbiamo selezionato puncta dsDNA di dimensioni comprese tra 2 e 20 µm2 (circolarità 0,1–1,0) e sono stati contati utilizzando la funzione "Analizza-Analizza particelle".

2.3. Microscopio elettronico

Un giorno prima della trasfezione, le cellule HeLa sono state piastrate a una densità di 600 cellule/μL. L'espressione dei geni di interesse è stata silenziata nelle cellule HeLa utilizzando Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) nel reagente di trasfezione Lipofectamina RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) secondo il metodo istruzioni del produttore (con una concentrazione finale di RNA di 10 nM).

Quattro giorni dopo l'eliminazione del siRNA, le cellule sono state sottoposte a fissazione. I campioni di colture cellulari sono stati fissati con PFA al 2% e glutaraldeide al 2% in tampone fosfato 0.1 M, pH 7,4, a 37 ◦C, quindi posti in un contenitore da 4 ◦Frigorifero C per 30 min. I campioni sono stati fissati in glutaraldeide al 2% in tampone fosfato 0.1 M per una notte a 4 ◦C. I campioni sono stati lavati tre volte con 0 tampone fosfato 1 M per 30 minuti e post-fissati con tetrossido di osmio al 2% in tampone fosfato 0,1 M a 4 ◦C per 1 ora.

I campioni erano soluzioni di etanolo degradato disidratato, trasferite su resina (Quetol-812, Nisshin EM Co., Tokyo, Giappone) e polimerizzate a 60 ◦C per 48 ore. Le resine polimerizzate sono state tagliate in sezioni ultrasottili 70-nm con un coltello diamantato utilizzando un ultramicrotomo (Ultracut UCT, Leica Microsystems, Wetzlar, Germania) e sono state quindi montate su griglie di rame.

Le sezioni sono state colorate con acetato di uranile al 2% a TA per 15 minuti e lavate con acqua distillata, seguita da colorazione secondaria con una soluzione colorante al piombo (Sigma-Aldrich, Tokyo, Giappone) a TA per 3 minuti.

Le griglie sono state osservate al microscopio elettronico a trasmissione (JEM-1400Plus, JEOL Ltd., Tokyo, Giappone) a una tensione di accelerazione di 80 kV (cervello di pesce zebra) o 100 kV (cella) e le immagini sono state registrate utilizzando una fotocamera CCD (dispositivo ad accoppiamento di carica) (EM-14830RUBY2,JEOL Ltd.) .

2.4. Microscopia immunoelettronica

I campioni sui dischi d'oro sono stati congelati in propano liquido a -175 ◦C. Dopo che i campioni sono stati congelati, sono stati congelati con acido tannico all'1% in etanolo e acqua distillata al 2% a -80 ◦C per 24 ore.

I campioni sono stati quindi mantenuti a -20 ◦C per 4 ore, seguiti da incubazione a 4 ◦C per 1 ora. Successivamente, i campioni sono stati disidratati in etanolo anidro 3 volte per 30 minuti. ogni volta, seguita da infiltrazione con una miscela 50:50 di resina etanolica (LR bianco: London Resin Co. Ltd., Berkshire, UK) a 4 °C per 1 ora. I campioni sono stati trasferiti su resina fresca al 100% e incubati a 4 ◦C per 30 minuti e questo processo è stato ripetuto tre volte.

I campioni sono stati trasferiti su resina fresca al 100% e polimerizzati a 50 ◦CO/N. Le resine polimerizzate sono state sezionate ultrasottili a 90 nm con un coltello diamantato utilizzando un ultramicrotomo (Ultracut UCT; Leica) e le sezioni sono state posizionate su griglie di nichel. Le griglie sono state incubate con anticorpo anti-dsDNA (35I9 DNA)(1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID: AB_470907) in BSA/PBS all'1% a 4 ◦CO/N, seguiti da tre risciacqui con 1% BSA/PBS per 1 minuto ciascuno.

Sono stati successivamente incubati con l'anticorpo secondario coniugato a particelle d'oro da {{0}} nm (anticorpo policlonale IgG anti-topo di capra) per 2 ore a temperatura ambiente. Dopo il risciacquo con PBS, le griglie sono state collocate in tampone cacodilato 0,1 M di glutaraldeide al 2%.

Successivamente, le griglie sono state asciugate e quindi colorate con acetato di uranile al 2% per 15 minuti e con una soluzione colorante di piombo (Sigma-Aldrich) a temperatura ambiente per 3 minuti. Le griglie sono state osservate attraverso un microscopio elettronico a trasmissione (JEM-1400 plus; JEOLLtd.) con una tensione di accelerazione di 100 kV. Le immagini digitali sono state ottenute con una fotocamera CCD (EM-14830RUBY2, JEOL Ltd.).

3. Risultati

3.1. La diminuzione di TFAM o GBA induce un aumento del DNA mitocondriale ectopico

Innanzitutto, abbiamo mostrato un esempio del rilevamento del DNA citoplasmatico derivato dai mitocondri nelle cellule HeLa in cui la proteina TFAM è stata abbattuta dal siRNA (Figura 1A). TFAM è un fattore chiave di trascrizione mitocondriale e funziona anche nella replicazione e riparazione del DNA mitocondriale [20] .

Si ritiene che i polimorfismi di sequenza in questo gene siano associati alla malattia di Parkinson [21,22]. Dopo 3 giorni di knockdown della proteina TFAM, sono stati rilevati molti punti di DNA a doppio filamento nel citoplasma delle cellule HeLa.

Gli istoni sono marcatori positivi per il DNA di origine nucleare nel citoplasma e marcatori negativi per il DNA mitocondriale e il DNA di origine mitocondriale nel citoplasma [23]. Questi punti non si co-localizzavano con gli istoni, suggerendo che non erano DNA di derivazione nucleare. Inoltre, alcuni di questi punti di DNA citoplasmatico ed ectopico non erano co-localizzati con Hsp60, un marcatore per la matrice mitocondriale, indicando che risiedevano all'esterno dei mitocondri (Figura 1B, C).

La microscopia elettronica ha anche mostrato che il DNA ectopico fuoriusciva dai mitocondri (Figura 2A, B). In sintesi, l'aumento dei punti di DNA ectopico nel citoplasma mediante knockdown del TFAM era dovuto alla fuoriuscita di DNA mitocondriale dai mitocondri. In secondo luogo, abbiamo mostrato un altro esempio di rilevamento del DNA citoplasmatico derivato dai mitocondri nelle cellule HeLa in cui la proteina GBA è stata abbattuta dal siRNA (Figura 1A).

GBA è il gene causativo della malattia di Gaucher, ma una mutazione eterozigote di GBA è anche un fattore di rischio per la malattia di Parkinson [24]. Molti punti di DNA a doppio filamento sono stati rilevati nel citoplasma delle cellule HeLa dopo 3 giorni di knockdown della proteina GBA. Alcuni punti di DNA erano co-localizzati con gli istoni, suggerendo che fossero DNA di derivazione nucleare.

Altri punti di DNA non erano co-localizzati con gli istoni, suggerendo che non fossero DNA di derivazione nucleare ma DNA di derivazione mitocondriale (Figura 1D). In sintesi, l'aumento dei punti di DNA ectopico nel citoplasma dovuto all'abbattimento del GBA era almeno in parte dovuto alla fuoriuscita di DNA mitocondriale dai mitocondri.

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