Il meccanismo della Cistanche Deserticola che favorisce la funzione intestinale

Yuan Gao, Chuanjie Zong, Fen Liu, Lei Fang, Runlan Cai, Yue Shi, Xi Chen, Yun Qi

Astratto

Feniletanoideglicosidi(PhGs), una classe di composti polifenolici, sono considerati uno dei principali costituenti bioattivi diCistanchedeserticolaY.C. Ma (CD), il cui estratto è usato per via orale nella medicina tradizionale cinese. Sebbene precedenti studi farmacologici abbiano riportato che i PhG esercitano molte attività, i loro profili di trasporto intestinale non sono stati chiariti. In questo studio, abbiamo studiato la permeabilità intestinale di un estratto ricco di PhG (PRE) daCistancheDeserticolacome sistema integrato nel modello monostrato cellulare Caco-2 utilizzando un sistema di biodosaggio. I risultati hanno mostrato che la PRE viene trasportata principalmente attraverso una diffusione passiva scarsamente assorbita lungo un gradiente di concentrazione senza efflusso, che fornisce la base farmacocinetica per l'applicazione clinica dei PhG inCistanche Deserticola. Abbiamo anche determinato la permeabilità intestinale di tre principaliPhG[acteoside (AC), isoacteoside (IS) ed echinacoside (CE)]di HLPC. Inoltre, abbiamo sviluppato un nuovo metodo di rilevamento della fluorescenza HPLC per determinare con precisione la quantità di flusso di AC e IS. Come previsto, le caratteristiche di trasporto dei trePhGsono coerenti con quelli di PRE, indicando che l'attuale sistema di biodosaggio è appropriato e affidabile per la valutazione delle caratteristiche di trasporto dei gruppi di principi attivi (AIG) in PRE. Inoltre, questo sistema può essere adatto anche per altri estratti vegetali con un'adeguata bioattività.

Contatto:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cistanche deserticola ha molti effetti, clicca qui per saperne di più

Introduzione

La linea cellulare Caco-2, che è stata derivata da adenocarcinomi del colon umano, presenta caratteristiche enterocitarie. In condizioni normali, le cellule Caco-2 si differenziano spontaneamente dalle cellule mature e formano monostrati intatti [1]. Le cellule adiacenti aderiscono attraverso giunzioni strette formate sul lato apicale del monostrato, che possono discriminare i farmaci trasportati passivamente e attivamente attraverso lo strato epiteliale [2]. A causa della somiglianza morfologica e biochimica con gli enterociti normali, i monostrati cellulari Caco-2 fungono da modello in vitro ben accettato per lo studio del potenziale di assorbimento intestinale e delle caratteristiche di trasporto dei farmaci [3, 4].

A differenza delle sostanze chimiche, gli estratti vegetali (PE) sono miscele la cui attività biologica e i costituenti attivi spesso non sono ben identificati [5]. Inoltre, le proprietà di trasporto intestinale dell'EP, al contrario delle proprietà dei suoi costituenti, sono strettamente correlate all'uso clinico. Le misurazioni del flusso per un campione di prova attraverso un monostrato di cellule Caco-2 coinvolgono comunemente metodi chimici, come HPLC, LC / MS, ecc. Sebbene questi metodi siano strumenti potenti, sono complessi, dispendiosi in termini di tempo, costosi e occasionalmente richiedono attrezzature sofisticate. Ancora più importante, né una singola componente né una componente minoritaria possono riflettere l'EP nel suo complesso. Pertanto, è necessario stabilire un nuovo approccio indipendente dalla determinazione dei costituenti per identificare e valutare le caratteristiche di trasporto del PE.

CistanchedeserticolaY.C. Ma (CD), una pianta oloparassitaria, è una medicina tradizionale cinese comune usata principalmente per trattare la carenza renale, la debolezza del corpo e la stitichezza, e questi usi sono stati ufficialmente registrati nella Farmacopea cinese [6]. I glicosidi feniletanoidi (PhG), inclusi echinacoside (EC), acteoside (AC), isoacteoside (IS), ecc., sono una classe di composti polifenolici [7]. Sono considerati uno dei principali costituenti bioattivi diCistanchespecie [8]. Studi farmacologici hanno dimostrato che la bioattività diPhGè vario e comprende effetti antiossidanti [9], anti-affaticamento [10], epatoprotettivi [11], immunomodulatori [12], antinfiammatori [7, 13] e neuroprotettivi [14]. Tuttavia, le caratteristiche di trasporto intestinale diPhGnon sono stati indagati. In questo studio, abbiamo esplorato la permeabilità intestinale di un estratto ricco di PhG (PRE) da CD come sistema integrato e la permeabilità di tre principali PhG (AC, IS ed EC) in cellule Caco-2 differenziate. I nostri risultati hanno indicato che la PRE viene trasportata principalmente attraverso una diffusione passiva scarsamente assorbita lungo un gradiente di concentrazione senza efflusso, che fornisce la base farmacocinetica per l'applicazione clinica dei PhG nella CD.

Materiali e Metodi

Materiali

La linea cellulare intestinale umana Caco-2 è stata ottenuta dall'American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). AC, IS e EC (>98%) sono stati acquistati da Must Biotechnology Co. (Chengdu, Cina). Il mezzo dell'aquila modificato di Dulbecco (DMEM), il siero bovino fetale (FBS) e gli amminoacidi non essenziali (NEAA) sono stati prodotti da Gibco BRL (Grand Island, NY, USA). Le piastre TranswellTM a 6 pozzetti (area di crescita della membrana di inserimento 4,67 cm2) sono state ottenute da Corning (Costar) Inc. (Tewksbury, MA, USA). Il collagene della coda di ratto è stato ottenuto da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Tutti i reagenti e le sostanze chimiche per l'analisi HPLC erano di grado analitico.

Preparazione del PRE da Cistanche deserticola

Il materiale CD essiccato all'aria è stato polverizzato ed estratto per percolazione con etanolo al 70%. La frazione ricca di PhG è stata preparata come descritto in precedenza [10] ed estratta con alcool n-butilico saturo d'acqua. Il liquore estratto è stato concentrato ed essiccato a pressione ridotta. La spettrofotometria macroporosa resina-UV [15] ha misurato un contenuto di PhG del 78,4%. Il campione finale rappresentava una resa dell'1,75% di materia prima in peso secco. Il campione ottenuto è stato conservato a -20°C fino a nuovo utilizzo.

Determinazione di AC, IS ed EC mediante HPLC

Un sistema HPLC Shimadzu dotato del software della soluzione LC è stato utilizzato per analizzare il contenuto di AC, IS ed EC in PRE. Una colonna Intersil C18 inversa (4,6 mm × 250 mm, 5 μm) è stata utilizzata e mantenuta a temperatura ambiente. Le fasi mobili erano acetonitrile e acqua contenente lo 0,1% di acido fosforico (v/v) con eluizione a gradiente (Tabella 1) ad una portata di 1,0 ml/min. Il rivelatore dello spettrofotometro UV è stato impostato su 334 nm. Per determinare con precisione il flusso di AC e IS, abbiamo sviluppato un nuovo metodo di rilevamento a fluorescenza HPLC (HPLC-FLD). Dopo un'analisi strutturale e la scansione della lunghezza d'onda di fluorescenza (dati non mostrati), abbiamo ottenuto le condizioni ottimali di rilevamento della fluorescenza per AC (Ex: 338 nm, Em: 448 nm) e IS (Ex: 320 nm, Em: 434 nm)

Il metodo analitico HPLC è stato convalidato utilizzando le seguenti caratteristiche prestazionali: stabilità, linearità, sensibilità, precisione (variabilità intra e intergiornaliera) e accuratezza. Gli analiti nel buffer di trasporto sono stati conservati a 25°C al buio per 24 ore e la loro stabilità è stata misurata. Gli analiti erano altamente stabili in presenza di vitamina C (0,4%) perché i valori di deviazione standard relativa (RSD) nelle aree di picco erano< 3.5%.="" the="" linear="" regression="" equation,="" correlation="" coefficient,="" range="" of="" linearity,="" lod,="" and="" loq="" for="" ac,="" is,="" and="" ec="" are="" shown="" in="" table="" 2.="" the="" lods="" (18–30="" nm)="" and="" loqs="" (60–100="" nm)="" values="" illustrate="" that="" the="" hplc-fld="" and="" hplc-uv="" methods="" are="" highly="" sensitive.="" the="" rsd="" values="" that="" express="" the="" precision="" of="" the="" method="" were="" all="">< 2%="" for="" intra-="" and="" inter-day="" variability,="" indicating="" good="" precision.="" for="" recovery="" evaluation,="" ac,="" is,="" and="" ec="" was="" added="" to="" the="" transport="" buffer="" to="" yield="" three="" (high,="" medium,="" and="" low)="" concentration="" levels.="" the="" recovery="" values="" of="" the="" method="" for="" the="" analytes="" are="" summarized="" in="" table="" 3.="" the="" average="" recoveries="" ranged="" from="" 90.0%="" to="" 96.4%,="" indicating="" good="" accuracy.="" in="" conclusion,="" the="" established="" hplc="" methods="" are="" satisfactory="" with="" respect="" to="" linearity,="" sensitivity,="" precision,="" and="" accuracy="" for="" the="" quantification="" of="" ac,="" is,="" and="" ec="" in="" transport="">

Determinazione del PRE mediante sistema di biodosaggio

Il biodosaggio (capacità antiossidante totale) si è basato sul test FRAP (ferric reducing/antioxidant power) precedentemente descritto [16] e validato in termini di linearità e precisione (variabilità intra e intergiornaliera). La linearità del metodo di biodosaggio è stata determinata in base alle curve di calibrazione. L'intervallo di concentrazione della linearità era 0,0625 − 40 μg/ml (y = 0,0258x+0,0968, R2 = 0,996). La precisione del metodo di biodosaggio stabilito è stata determinata in termini di variabilità intra e intergiornaliera per un'analisi di PRE (10,0 μg/ml). La ripetibilità infragiornaliera del metodo è stata determinata sulla base di cinque determinazioni consecutive nello stesso giorno. La ripetibilità tra giorni è stata misurata sulla base di cinque determinazioni consecutive in tre giorni diversi. I valori RSD per la precisione del metodo erano rispettivamente dell'1,014% e del 4,72% per la variabilità intra e intergiornaliera, indicando una buona precisione. Pertanto, il metodo di biodosaggio stabilito è soddisfacente per quanto riguarda la linearità, la precisione e l'accuratezza per la quantificazione del PRE nel buffer di trasporto.

Coltura cellulare

Le cellule Caco-2 sono state coltivate a 37°C e 95% di umidità relativa in un'atmosfera contenente il 5% di CO2 e mezzo costituito da DMEM, 10% FBS, 1% NEAA, 1% L-glutammina, penicillina (100 U/ml) e streptomicina (100 μg/ml). Il mezzo è stato cambiato a giorni alterni durante la crescita e la differenziazione cellulare. Le cellule sono state coltivate in palloni di plastica da 75 cm2 e raccolte ogni 3-5 giorni con lo 0,05% di EDTA-tripsina. Per gli esperimenti di trasporto, le cellule sono state seminate ad una densità di 1×105 cellule / cm2 su inserti Transwell rivestiti di collagene. Circa 21 giorni dopo la semina, i monostrati sono stati utilizzati per gli esperimenti di trasporto. La loro integrità è stata determinata misurando la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) attraverso i monostrati con un EVOM dotato di ENDOHM-SNAP (World Precision Instruments, Inc., USA). I valori TEER del monostrato di celle Caco-2 dovevano superare i 500 O∙cm2.

Esperimenti di trasporto

Il monostrato è stato lavato con tampone di trasporto (P-buffer contenente 10 mM HEPES, 1 mM piruvato di sodio, 10 mM di glucosio, 3 mM CaCl2 e 145 mM NaCl, pH 7,4) e quindi pre-incubato per 20 min a 37°C. Dopo aver rimosso il tampone di trasporto, il tampone di trasporto fresco contenente campioni di prova è stato aggiunto alla camera apicale (AP) (1,5 ml) negli studi direzionali da AP a basolaterale (BL) o alla camera BL (2,5 ml) negli studi direzionali da BL ad AP. Per i saggi AC, IS ed EC che utilizzano HPLC, un'aliquota (300 μl) è stata rimossa da ciascuna camera ricevente a intervalli di tempo diversi (30, 60, 90 e 120 min). La camera ricevente è stata reintegrata con lo stesso volume di tampone di trasporto preriscaldato fresco (37 °C) dopo ogni campionamento. I campioni raccolti sono stati conservati a -20°C per un ulteriore utilizzo. Per la determinazione PRE utilizzando il biodosaggio, sono stati prelevati solo i campioni a 120 minuti. A causa dell'instabilità di PRE, AC, IS ed EC, è stato aggiunto lo 0,4% (p / v) di vitamina C per stabilizzare i campioni al fine di determinare il contenuto di AC, IS ed EC mediante HPLC e i campioni per il biodosaggio PRE sono stati analizzati immediatamente dopo essere stati campionati. È stato calcolato il coefficiente di permeabilità apparente (Papp o 'Papp) valore di ciascun campione.

Analisi dei dati

I valori di Papp nelle direzioni AP BL o BLAP di AC, IS e EC sono stati calcolati sulla base della seguente equazione: Papp = (4Q/4t)/(A C0), dove Papp è il coefficiente di permeabilità apparente (cm/s) determinato da HPLC. (4Q/4t) è la velocità di comparsa del composto in esame (AC, IS o EC) sul lato del ricevitore (μmol/s); A è la superficie dell'inserto (cm2 ); C0 è la concentrazione iniziale del composto di prova sul lato donatore (μmol/ml). In particolare, l'unità di massa "μg" è stata utilizzata al posto di "μmol" quando sono stati calcolati i valori di 'Papp. I dati sono espressi come mezzi ± SD.

Risultati

Composizione di Acteoside, Isoacteoside ed Echinacoside in PRE da Cistanche Deserticola

Poiché AC, IS ed EC sono considerati i principali PhG bioattivi delle specie di Cistanche [8], abbiamo analizzato il loro contenuto in PRE tramite HPLC-UV. Il cromatogramma rappresentativo è mostrato in Fig. 1. L'identificazione di questi costituenti si è basata sul confronto dei tempi di ritenzione e dello spettro UV con quelli di standard autentici a una lunghezza d'onda di 334 nm. I contenuti di AC, IS e EC in PRE erano rispettivamente del 26,60%, 1,84% e 32,83%. Pertanto, questi tre composti rappresentano il 61,27% di PRE; inoltre, i risultati di cui sopra indicano che il contenuto di PhG in PRE è del 78,4%. Pertanto, AC, IS e EC rappresentano circa l'80% dei PhG in PRE.

Capacità antiossidanti totali di PRE, AC, IS ed EC

Sono stati riportati studi sull'attività antiossidante dei PhG da CD [9] e AC, IS e EC rappresentano circa l'80% dei PhG in PRE. Pertanto, le capacità antiossidanti totali di PRE, AC, IS ed EC sono state analizzate e sono espresse utilizzando i valori FRAP (× 10-6 mmol). Come mostrato in Fig. 2, quando il valore FRAP era 8 × 10-6 mmol, le concentrazioni finali di PRE, AC, IS e EC erano rispettivamente di 6,20 μg/ml, 3,14 μg/ml, 22,92 μg/ml e 4,89 μg/ml, indicando che la capacità antiossidante totale di questi quattro campioni era classificata come segue: AC > EC > PRE > IS. La bioattività della PRE è attribuita ai suoi gruppi di principi attivi (AIG). Per circa il 60% di PRE, AC ed EC hanno mostrato un'attività antiossidante totale più forte rispetto a PRE e IS. Poiché l'IS (1,84%) costituisce una frazione molto piccola di PRE, anche altri componenti, come l'IS debolmente antiossidante, sono chiaramente attivi nella PRE. Sorprendentemente, l'attività antiossidante totale differiva di quasi 7 volte tra AC e il suo isomero IS, indicando non solo il numero di gruppi ossidrilici fenolici [9] ma anche la posizione dei gruppi ossidrilici fenolici nella molecola influenzata dall'effetto antiossidante.

Validazione dei monostrati Caco-2

Per convalidare il sistema monostrato cellulare Caco-2, i valori Papp di propranololo (un marcatore ben trasportato) e giallo Lucifero (un marcatore scarsamente trasportato) dall'AP al BL attraverso i monostrati Caco-2 sono stati determinati rispettivamente come 1,51 × 10-5 cm/s e 2,8 × 10-7 cm/s, e questi valori concordavano con quelli pubblicati nelle relazioni precedenti [17, 18]. Il test dell'attività della fosfatasi alcalina ha anche confermato che i monostrati delle cellule Caco-2 erano qualitativamente paragonabili all'epitelio intestinale [19]

La permeabilità di Acteoside, Isoacteoside ed Echinacoside

In generale, i valori di Papp dei farmaci ben assorbiti erano elevati (> 1,0 × 10-5 cm/s), mentre quelli dei farmaci scarsamente assorbiti erano bassi (< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3].="" as="" shown="" in="" table="" 4,="" the="" papp="" values="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" nearly="" on="" the="" order="" of="" 10–7="" cm/s,="" indicating="" that="" these="" compounds="" were="" poorly="" permeable.="" furthermore,="" efflux="" or="" active="" transport="" were="" not="" observed="" because="" the="" ratios="" of="" papp="" bl="" to="" ap="" papp="" ap="" to="" bl="" for="" ac,="" is="" and="" ec="" was="" between="" 0.90="" ~="" 1.55,="" and="" the="" criterion="" of="" net="" efflux="" proposed="" by="" the="" fda="" guidance="" is="" a="" ratio="" less="" than="" 2="" [20].="" based="" on="" the="" kinetic="" curves="" presented="" in="" fig.="" 3,="" the="" bidirectional="" transport="" percentages="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" at="" 200="" μm="" increased="" linearly="" with="" time.="" the="" transport="" rate="" (tr)="" values="" of="" the="" three="" compounds="" increased="" linearly="" in="" both="" directions="" between="" approximately="" 100="" and="" 300="" μm="" (fig.="" 4).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" ac,="" is="" and="" ec="" is="" also="" passive="">

La permeabilità di PRE

I risultati di cui sopra indicano che la capacità antiossidante totale di PRE è almeno dovuta al 61,27% di AIG da PRE. Pertanto, abbiamo valutato il TR di PRE in base alla sua curva concentrazione-effetto della capacità antiossidante totale e calcolato i valori di Papp al fine di riflettere le caratteristiche di trasporto di PRE. I valori Papp di PRE per AP! BL e BL! AP era (2,16 ± 0,26) × 10-7 cm / s e (3,13 ± 0,29) × 10-7 cm / s, rispettivamente, indicando che questo composto era scarsamente permeabile. Inoltre, l'efflusso o il trasporto attivo non erano evidenti perché il rapporto tra «Papp BL to AP/ 'Papp AP to BL per PRE era di 1,45 [20]. Inoltre, il TR bidirezionale di PRE è aumentato linearmente tra circa 300 e 900 μg/ml (Fig. 5). La mancanza di preferenza direzionale dei risultati suggerisce che la diffusione passiva è il principale meccanismo di trasporto di PRE.

Discussione

Rispetto ai prodotti farmaceutici altamente purificati, l'EP è generalmente una miscela costituita da centinaia di costituenti con proprietà fisiochimiche molto diverse. Pertanto, il PE esercita un'azione sinergica sistematica, multitarget e multicanale a causa del loro complesso AIG [21], che ostacola l'analisi delle caratteristiche di trasporto del PE. Per valutare le proprietà di trasporto dell'EP in modo più scientifico, alcuni ricercatori hanno identificato più componenti, piuttosto che un singolo componente, in PE [22-24]. Tuttavia, un numero limitato di componenti non può riflettere l'IF nel suo complesso. Tuttavia, determinare tutti i componenti in PE è impossibile. Inoltre, se diversi componenti in PE mostrano caratteristiche di trasporto completamente diverse, le caratteristiche di trasporto olistico di PE saranno difficili da identificare.

Nel 1990, i sistemi di biodosaggio sono stati utilizzati per valutare il TR degli agenti antimicrobici [25]. Nel 2005, Eguchi e i suoi colleghi [26] avevano valutato l'attività antiossidante dell'estratto di carota utilizzando mezzi BL da cellule Caco-2 differenziate; questo approccio è più appropriato per riflettere situazioni in vivo.

Sulla base di un precedente rapporto sull'attività dei PhG [9] e dei nostri risultati (Fig. 2), il TR di AIG in PRE può essere valutato determinando la capacità antiossidante totale del mezzo nella camera ricevente. Dopo gli esperimenti di trasporto, abbiamo scoperto che il TR di PRE era simile in entrambe le direzioni, e questo trasporto era insaturo e scarsamente assorbito ('Papp< 1.0="" ×="" 10–6="" cm/s)="" [3],="" and="" it="" did="" not="" indicate="" efflux,="" suggesting="" that="" passive="" diffusion="" down="" a="" concentration="" gradient="" is="" the="" main="" transport="" mechanism="" of="" pre="" (fig.="" 5).="" furthermore,="" the="" transport="" characteristics="" of="" pre="" are="" consistent="" with="" those="" of="" ac,="" is,="" and="" ec,="" the="" effective="" components="" that="" display="" anti-oxidative="" activity="" in="" pre="" (fig.="" 4="" and="" table="" 4).="" this="" result="" was="" expected="" and="" indicated="" that="" the="" present="" bioassay="" system="" is="" appropriate="" and="" reliable="" for="" the="" evaluation="" of="" the="" transport="" characteristics="" of="" aig="" in="" pre="" in="" differentiated="" caco-2="">

A differenza del valore canonico di Papp, che è comunemente usato per riflettere il trasporto di un singolo composto, il "valore di Papp ottenuto dal TR basato sulla curva concentrazione-effetto" può non solo riflettere i componenti che penetrano nei monostrati con una struttura intatta, ma coinvolgere anche altri fattori legati all'attività bersaglio, come i metaboliti dei componenti, prodotti chimicamente degradati e persino alcune citochine secrete dalle cellule Caco-2 in risposta alla stimolazione che possono influenzare la bioattività target. Pertanto, il multifattore sopra menzionato, piuttosto che solo i componenti intatti trasportati, determina il valore 'Papp. Pertanto, "Papp può essere correlato più fortemente all'interno delle situazioni Vivo rispetto al valore Papp canonico [26]. In questo studio, abbiamo chiarito la natura passivamente diffusa e scarsamente assorbita della PRE in base al suo "valore Papp", e questa natura può essere correlata all'alto dosaggio e al lungo periodo di trattamento clinico della CD [27]. Tuttavia, questi risultati forniranno una guida più sistematica per i medici nell'applicazione della CD quando sono state identificate solo le caratteristiche di trasporto della maggior parte degli AIG nella CD, non solo i PhG.

Tuttavia, l'elemento di bioattività selezionato deve essere sufficientemente sensibile da essere rilevato nel mezzo della camera ricevente, il che rappresenta una sfida per l'istituzione di un sistema di biodosaggio per valutare le caratteristiche di trasporto dell'EP. Inoltre, la bioattività dovrebbe anche dipendere dal maggior numero possibile di componenti. Nel nostro studio, il test della capacità antiossidante totale era più appropriato di molti altri metodi (S1 Fig.). Ma anche così, il nostro test può rilevare solo il TR di PRE a 120 minuti.

Collettivamente, il presente studio ha stabilito un nuovo sistema di biodosaggio per valutare la permeabilità intestinale della PRE in cellule Caco-2 differenziate. I risultati ottenuti hanno mostrato che una diffusione passiva scarsamente assorbita lungo un gradiente di concentrazione senza efflusso è il principale meccanismo di trasporto della PRE (Fig. 5), che fornisce la base farmacocinetica per l'applicazione clinica dei PhG nella CD. L'uso di un nuovo sistema di biodosaggio per valutare il TR e quindi calcolare i valori di Papp per valutare la proprietà di trasporto intestinale di AIG negli EP è chiaramente fattibile. Questo approccio può anche essere adatto per altri PE data la bioattività appropriata

Informazioni di supporto

S1 Fig. Effetti di PRE su (A) anione superossido, (B) radicale idrossile, (C) prodotto di perossidazione lipidica e (D) radicale DPPH. Le procedure di analisi sono state eseguite in base ai rapporti precedenti [1, 2] senza utilizzare il buffer di trasporto. I valori IC50 (concentrazione di inibizione al 50%) e SC50 (concentrazione di scavenging al 50%) sono stati calcolati sulla base delle curve concentrazione-risposta standard. (DOCX)

Contributi dell'autore

Ideazione e progettazione degli esperimenti: YG XC YQ. Eseguiti gli esperimenti: YG CZ FL LF RC YS. Analizzati i dati: CZ YG YQ. Reagenti/materiali/strumenti di analisi forniti: RC. Ha scritto l'articolo: YG YQ

Dipartimento di Ricerca Centro di Farmacologia e Tossicologia, Istituto di Sviluppo di Piante Medicinali, Accademia Cinese di Scienze Mediche e Peking Union Medical College, Pechino, P.R. Cina,

Heilongjiang Università di Medicina Cinese, Harbin, Heilongjiang, P.R. Cina