I glicosidi totali di Cistanche Deserticola promuovono il recupero della funzione neurologica inducendo la rigenerazione neurovascolare
Mar 29, 2022
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Fujiang Wang1, Ruiyan Li 2, Pengfei Tu1, Jianping Chen3, Kewu Zeng1* e Yong Jiang1*
Sfondo:La medicina tradizionale cinese Cistanche deserticola è stata segnalata come valida per le malattie cardiovascolari e cerebrovascolari. Tuttavia, i suoi componenti attivi per la protezione dell'ictus ischemico non sono chiari. Abbiamo mirato a esplorare i componenti attivi di C. deserticola contro l'ictus ischemico e i suoi potenziali meccanismi.
Metodi:Abbiamo studiato gli effetti di protezione del cervello di estratti di C. deserticola, glicosidi totali (TG), polisaccaridi (PS) e oligosaccaridi (OS) in un modello di ratto di occlusione-riperfusione dell'arteria cerebrale media (MCAO/R). 2, 3, 5-La colorazione del trifenil tetrazolio cloruro (TTC) è stata utilizzata per valutare il volume dell'infarto cerebrale e il test Evansblue è stato adottato per valutare la permeabilità della barriera ematoencefalica (BBB). Quindi, le espressioni CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin,Keap-1 e Nrf{{13 }} sono stati analizzati utilizzando western blotting o immunofluorescenza e le attività MDA, SOD, CAT e GSH-Px sono state analizzate utilizzando kit.
Risultati:Il trattamento dei TG ha notevolmente ridotto i punteggi del deficit neurologico e i volumi di infarto, ha promosso l'angiogenesi e il rimodellamento neurale e ha mantenuto efficacemente l'integrità della barriera ematoencefalica rispetto al gruppo modello. Inoltre, i TG hanno ridotto significativamente i livelli di MDA e aumentato le attività antiossidanti (SOD, CAT e GSH-Px) nel cervello. Nel frattempo, i TG hanno notevolmente sottoregolato l'espressione Keep-1 e facilitato la traslocazione nucleare Nrf-2. Al contrario, non sono stati osservati effetti protettivi per i gruppi PS e OS.
Conclusione:I TG sono i principali componenti attivi di C. deserticola contro il danno cerebrale indotto da MCAO/R e la protezione avviene principalmente attraverso il percorso Nrf-2/Keap-1.
Parole chiave:Cistanche deserticola,danno cerebrale, glicosidi totali, polisaccaridi, oligosaccaridi, via Nrf-2/Keap-1
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INTRODUZIONE
Gli ictus sono considerati una delle principali cause di morte e disabilità nel mondo (Donnan et al., 2008). Quasi l'87% di tutti i casi di ictus sono innescati da ictus ischemico (Ovbiagele e Nguyen-Huynh, 2011). Attualmente, l'agente più efficace e l'unico farmaco approvato dalla FDA utilizzato per il trattamento dell'ictus ischemico è l'attivatore del plasminogeno tissutale ricombinante. Tuttavia, un gran numero di pazienti colpiti da ictus non risponde a questo farmaco, a causa della sua finestra temporale terapeutica ristretta e del grave rischio di complicanze emorragiche (Lee et al., 2012; Schellinger e Kohrmann, 2014). Una delle principali sfide del trattamento trombolitico è la lesione da ischemia/riperfusione (I/R), considerata la principale causa di lesione cerebrale e distruzione delle funzioni. La riperfusione dopo l'ischemia cerebrale aumenta il rischio di un'emorragia cerebrale mentre porta a lesioni neurovascolari e produce specie di ossigeno eccessivamente reattive (ROS) che danneggiano la barriera ematoencefalica (Alluri et al., 2015). Numerosi studi hanno confermato che l'interruzione del BBB è una delle principali cause della patogenesi dell'ictus ischemico (Cao et al., 2016b).
Il BBB è costituito principalmente da cellule endoteliali, periciti, astrociti, neuroni e membrane basali. I componenti principali del BBB sono cellule endoteliali microvascolari cerebrali che sono unite da giunzioni strette, limitando così le molecole esogene nel cervello. Le alterazioni patologiche delle giunzioni strette, in particolare occludina, claudina{0}} e zonulaoccludens-1 (ZO-1), influiscono in modo significativo sulla funzione BBB durante un ictus ischemico, in particolare sulla permeabilità della barriera (Liuet al., 2014 ; Hu et al., 2018; Liu et al., 2019). Durante i periodi I/R, un ROS eccessivo è uno dei principali fattori che portano al danno diretto dei neuroni cerebrali (Ding et al., 2014). La sovrapproduzione di ROS porta alla degradazione di alcune giunzioni e all'interruzione del BBB, che si traduce in molecole esogene che entrano nel cervello attraverso il BBB, portando all'aggravamento del danno cerebrale (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al.,2017). Pertanto, la protezione del BBB da parte di antiossidanti è stata considerata un potenziale modo per prevenire il danno da riperfusione.
Oltre alla rottura del BBB, l'I/R può provocare lesioni neurovascolari e morte neuronale (Jung et al., 2010). Durante un ictus, l'aumento della morte delle cellule neuronali può derivare da stress ossidativo (Chi et al., 2018) e numerosi studi hanno dimostrato che i ROS aggravano la gravità dell'ictus e il danno neurologico (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). Sebbene gli studi clinici non abbiano ottenuto risultati soddisfacenti, la neuroprotezione è ancora una strategia promettente per il trattamento dell'ictus ischemico acuto (Moretti et al., 2015). Pertanto, trovare farmaci di neuroprotezione efficaci per il trattamento dell'ictus è un vantaggio per i pazienti con ictus.
La medicina tradizionale cinese (MTC) adotta misure per intervenire contro lo squilibrio interno dell'organismo (Gaire, 2018). A causa della complessa patogenesi dell'ictus ischemico, l'effetto multifattoriale della MTC e dei suoi costituenti attivi svolgono un ruolo critico nel trattamento dell'ictus. La Cistanche deserticola YC Ma, diffusa nelle aree aride o semi-aride della Mongolia e della Cina nord-occidentale, è stata un'erba MTC ampiamente utilizzata per il trattamento di varie malattie come l'oblio e la depressione per più di 1,{3}} anni in Cina. Moderni studi farmacologici hanno indicato che gli estratti grezzi di C. deserticola ha mostrato molteplici attività farmacologiche, come il miglioramento della funzione di apprendimento e memoria, neuroprotezione, miglioramento dell'immunità, effetti antiossidanti, anti-invecchiamento e antifatica (Ko e Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li et al., 2015). Analisi chimica di C. deserticola ha mostrato che i suoi costituenti principali includono glicosidi feniletanoidi, glicosidi iridoid, polisaccaridi e oligosaccaridi (Jiang e Tu,2009). Tuttavia, i componenti attivi di C. deserticola per la protezione del cervello non sono molto chiari.
La proprietà neuroprotettiva di C. deserticola implica il suo potenziale terapeutico nelle malattie cognitivo-correlate come ictus e depressione, così come il morbo di Alzheimer (Wang et al.,2017). Tuttavia, la ricerca sull'impatto degli ictus di C. deserticola, compresi i suoi componenti attivi e meccanismi d'azione, è molto limitata. Nel presente lavoro, abbiamo esplorato l'effetto protettivo di tre estratti di C. deserticola, glicosidi totali (TG, glicosidi feniletanoidi e altri glicosidi), polisaccaridi (PS) e oligosaccaridi (OS) sulle lesioni cerebrali I/R. I nostri risultati possono contribuire all'applicazione clinica accurata di C. deserticola e fornire un agente candidato per la terapia dell'ictus ischemico.
Cistanche ha tpotenziale terapeuticonelle malattie cognitive come ictus e depressione,così come il morbo di Alzheimer.
MATERIALI E METODI
Sostanze chimiche e reagenti
Gli steli di Cistanche deserticola sono stati acquistati da Alashan, Mongolia Interna, e identificati da uno degli autori (P.-F. Tu). TG, PS e OS sono stati preparati secondo il nostro metodo precedentemente segnalato (Gao et al., 2015) . L'analisi quantitativa dei TG è stata eseguita mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) come precedentemente descritto (Li et al, 2019) e il suo cromatogramma è mostrato nella Figura 1. I componenti principali dei TG sono echinacoside, tubuloside A, acteoside, isoacteoside e 2'- acetilatteoside; il loro contenuto è rispettivamente di 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g e 12,045 mg/g. Il contenuto di PS e OS è rispettivamente del 69,42% e del 65,24%, come determinato dall'HPLC e dall'analisi dell'acido fenolo-solforico, rispettivamente (Zhang A. et al., 2018; Shi et al, 2019).
I riferimenti standard di echinacoside (A0282), tubulosideA (A0942), acteoside (A0280), isoacteoside (A0281) e 2'-acetylacteoside (A0943) sono stati acquistati da Chengdu MustBiotechnology (Sichuan, Cina). La purezza di tutti gli standard è superiore al 98 percento. I kit Nissl stain H&E sono stati acquistati da Boster (Wuhan, Cina). Edaravone (T0407-1) è stato acquistato da TargetMol (Shanghai, Cina). Rabbit anti-rat MAP-2 (ab32454), Nrf-2(ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) e mouseanti-rat CD31 (ab24590) sono stati acquistati da Abcam Inc (Cambridge, MA, USA). Coniglio anti-ratto Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) e Occludin (BS72035) sono stati acquistati da Bioworld Technology (Nanchino, Cina). Cell SignalingTechnology Inc. (Boston, MA, USA) è stata la fonte di Synapsin coniglio anti-ratto-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-SmoothMuscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) è stato acquistato da Proteintech Group, Inc. (Chicago, USA). Gli anticorpi secondari sono stati forniti da Zhongshan GoldenBridge Biotechnology (Pechino, Cina). Hoechst 33258 è stato ottenuto da Beyotime (Jiangsu, Cina).
FIGURA 1|I cromatogrammi HPLC dei TG (A) e riferimenti standard (B).
Animali
I ratti Sprague-Dawley (maschio, del peso di 250–300 g) sono stati ottenuti da Vital River Laboratory Animal Technology (Pechino, Cina) e alloggiati in una stanza climatizzata tenuta su un ciclo luce/oscurità di 12 ore. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida ARRIVE per la ricerca sugli animali (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) e approvati dall'InstitutionalAnimal Care and Use Committee del Peking University HealthScience Center (LA2019123).
Protocolli sperimentali sugli animali
I ratti sono stati sottoposti a MCAO/R, come descritto in precedenza (Wang et al., 2018). In breve, sono state esposte l'arteria carotide comune sinistra (CCA), l'arteria carotide esterna (ECA) e la carotidarteria interna (ICA) e una sutura monofilamento di nylon 3-0 è stata inserita dall'ECA nell'ICA fino a raggiungere l'arteria cerebrale media ( MCA). Dopo 1,5 ore di occlusione MCA, è stata simulata la riperfusione rimuovendo il filamento. Durante la procedura chirurgica, la temperatura corporea di tutti i ratti è stata mantenuta a 37,0 gradi.
Amministrazione dei farmaci
I ratti sono stati separati casualmente in sei gruppi utilizzando il software SPSS versione 22.0 come descritto (Jiang et al., 2014): normalgroup (NOR); gruppo modello (MOD); gruppo edaeavone (farmaco positivo, 6 ml/kg, EDI); gruppo TG (280 mg/kg, TG); Gruppo PS (280 mg/kg, PS) e gruppo OS (280 mg/kg, OS). TG, PS e OS sono stati somministrati ig una volta al giorno dopo MCAO/R per 14 giorni. I gruppi NOR e MOD sono stati trattati con soluzione salina normale. I numeri degli animali sono mostrati nella tabella 1.
TABELLA 1|Numero di animali per diversi gruppi sperimentali e vari parametri a 14 giorni dopo la somministrazione.
Misurazione del peso e punteggi di deficit neurologico modificati (mNSS)
Il peso corporeo è stato monitorato il 14° giorno utilizzando una scala digitale ADVENTURE™ (OHAUS, New Jersey, USA). La NSS è stata valutata secondo il metodo descritto da FJ Wang (Wang et al., 2018), con revisioni minori.
2, 3, 5-Colorazione di cloruro di trifeniltetrazolio (TTC)
Il volume dell'infarto è stato misurato come descritto in precedenza (Wanget al., 2015). In breve, i cervelli sono stati sezionati in sette blocchi coronali equidistanti (2 mm). Queste sezioni sono state colorate con il 2% di TTC (Coolaber, Pechino, Cina) a 37 gradi per 15 min. Infarctvolume ( percent )=(volume dell'emisfero ischemico omolaterale-volume dell'emisfero ischemico controlaterale)/volume dell'emisfero controlateralischemico × 100.
Colorazione Nissl e H&E
I ratti sono stati profondamente anestetizzati e l'intero cervello è stato quindi rimosso rapidamente dal cranio e fissato utilizzando paraformaldeide al 4% e incorporato in cera di paraffina, e sezionato in fette di 7 µm di spessore. Le sezioni sono state colorate con Nissl e H&E. In questo studio, sei campi casuali di 200 × 200 µm sono stati catturati in ciascun campione di tessuto con un microscopio ottico. Il numero dei corpi di Nissl è stato contato con il software IPP versione 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, USA).
Saggio blu di Evans
Ai ratti è stato iniettato il 2% di EB (Coolaber Science & TechnologyCo., LTD) dopo MCAO/R. Due ore dopo, i ratti sono stati anestetizzati e l'intero cervello è stato quindi rapidamente rimosso e omogeneizzato in acetone. I supernatanti sono stati analizzati a 620 nm da un lettore di assorbanza 800 TS (BioTek, USA).
Misurazione delle attività di catalasi (CAT), superossido dismutasi (SOD), malondialdeide (MDA) e glutatione perossidasi (GSH-Px)
Tutti i campioni di siero sono stati centrifugati a 4,000 × rpm per 15 minuti a 4 gradi e quindi analizzati per rilevare le attività di MDA, CAT, SOD e GSH-Px seguendo le istruzioni del produttore (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd , Cina).
Analisi Western Blotting
I tessuti cerebrali (100 mg) raccolti da ciascun ratto sono stati omogeneizzati e lisati nel tampone di lisi RIPA e quindi analizzati per rilevare la concentrazione proteica utilizzando un kit BCA (Beijing TransGenBiotech Co., Ltd.). Le proteine totali del tessuto sono state caricate su gel SDS-PAGE al 10 percento e trasferite su una membrana di nitrocellulosa. La membrana è stata bloccata utilizzando latte scremato al 5 percento, quindi incubata per una notte con anticorpi primari a 4 gradi . La membrana è stata quindi incubata con un anticorpo secondario. L'analisi Western blot è stata analizzata utilizzando il sistema di imaging digitale Kodak (5200 Multi, Tanon, Cina).
Analisi immunofluorescente
È stata eseguita la colorazione dell'immunofluorescenza per CD31, a-SMA, ZO-1,claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 eKeap-1. Gli anticorpi primari contro Nrf-2,CD31, a-SMA, ZO-1, claudina5, occludin, PDGFRb, SYN,PSD95, MAP-2 e Keap-1 sono stati diluiti in 1:200 e 1:100, rispettivamente. Gli anticorpi secondari di Alexa Flur 488 IgG anti-coniglio di topo e IgG anti-coniglio di capra rodamina (TRITC) sono stati entrambi diluiti a 1:200. I nuclei sono stati colorati con Hoechst 33258. Le immagini sono state acquisite utilizzando Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System (PerkinElmer, USA). L'espressione proteica è stata analizzata utilizzando il software IPP versione 6.0.
Analisi statistica
Tutti i dati sono stati descritti come media ± DS. Software SPSS versione 22.0è stato eseguito per l'analisi statistica. L'ANOVA unidirezionale è stata utilizzata per confrontare diversi gruppi. P < 0.05="" è="" stata="" considerata="" la="" differenza="">
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RISULTATI
I TG aumentano il peso corporeo e riducono i danni cerebrali nei ratti MCAO/R
Dopo 14 giorni di cura con TG, PS, Oss ed EDI, sono stati valutati il peso corporeo, i deficit neurologici e i volumi di infarto dei ratti I/R. I risultati hanno mostrato che i pesi corporei nel gruppo MOD erano notevolmente diminuiti, mentre i pesi ridotti nei gruppi TG, PS e EDI erano ovviamente aumentati (Figura 2A). I punteggi del deficit neurologico sono stati sostanzialmente ridotti da EDI e TG (Figura 2B). Le fette di cervello nei ratti del gruppo NOR erano di un rosso intenso e non ci sono stati infarti, mentre i ratti del gruppo MOD hanno mostrato un grande infarto cerebrale ipsilaterale. Dopo il trattamento con TG, i volumi dell'infarto sono stati significativamente ridotti (Figure 2C, D). Il trattamento di PS e OS non ha mostrato effetti evidenti sugli indici di cui sopra. I dati di cui sopra hanno mostrato che TG potrebbe alleviare notevolmente il danno cerebrale indotto da I/R, ma PSs e OS non potrebbero.
FIGURA 2|I TG riducono il danno cerebrale indotto dall'ischemia cerebrale focale transitoria.
I TG migliorano il danno istopatologico nei ratti MCAO/R
Al fine di determinare alcuni degli effetti del trattamento con TG, PS e OS sui danni istopatologici, è stata eseguita la colorazione H&E per rivelare il danno patologico. Le strutture istomorfologiche dei cervelli nel gruppo NOR sono state organizzate regolarmente. I cambiamenti morfologici nei gruppi TG erano più lievi di quelli nel gruppo MOD. Tuttavia, i gruppi di trattamento PS e OS non hanno mostrato un miglioramento significativo dei cambiamenti morfologici (Figura 3).
I TG attenuano il danno neuronale dopo ratti indotti da I/R
La colorazione Nissl ha mostrato i cambiamenti istopatologici dei neuroni nella penombra dell'area ischemica. Come mostrato nella Figura 4, i neuroni normali avevano un nucleolo chiaro e una struttura intatta. Nel gruppo MOD, i neuroni avevano spazi intercellulari ingranditi. I corpi estranei erano scomparsi, rimpiccioliti e profondamente macchiati. Tuttavia, questi cambiamenti sono stati osservati raramente nei gruppi EDI, TG e PS. Questi risultati hanno illustrato che TG e PS potrebbero attenuare significativamente il danno neuronale indotto da ischemia/riperfusione.
I TG attenuano l'interruzione del BBB dopo i ratti trattati con I/R
Il saggio blu di Evans è un metodo classico per la ricerca del cambiamento della permeabilità BBB. I risultati dell'esperimento hanno mostrato che è stato osservato un aumento del blu di Evans nel gruppo MOD, mentre c'era un blu di Evans significativamente diminuito nei ratti trattati con TG e EDI. Inoltre, non vi era alcuna differenza significativa tra i gruppi di terapia PS e OS (Figura 5). Questi risultati hanno suggerito che i TG potrebbero attenuare significativamente l'interruzione del BBB.
FIGURA 3|I TG migliorano il danno istopatologico nei ratti MCAO/R.
I TG promuovono l'angiogenesi nei ratti con lesioni I/R
Studi più recenti mostrano che l'angiogenesi gioca un ruolo critico nel recupero funzionale neurologico e nell'esito prognostico dopo ictus ischemico acuto (Yuen et al., 2015). Per valutare gli effetti di TG, PS e OS sull'angiogenesi, sono stati utilizzati CD31 e a-SMA per quantificare i numeri capillari. L'immunofluorescenza ha mostrato che il gruppo MOD ha causato una notevole diminuzione delle espressioni di CD31 (Figure 6A, B) e a-SMA (Figure 6C, D) nella penombra delle aree ischemiche di I/Rrat, rispetto ai ratti normali. Questo risultato ha illustrato che I/R potrebbe causare danni vascolari nella penombra della corteccia degli emisferi ischemici. Tuttavia, il trattamento con TG e EDI ha aumentato notevolmente la densità capillare, l'angiogenesi e l'arteriogenesi come indicato dall'aumento delle espressioni di CD31 e a-SMA. Questi risultati suggeriscono che i TG potrebbero promuovere l'angiogenesi nella penombra ischemica dei ratti I/R, ma i PS e gli OS non potrebbero.
I TG aumentano l'espressione delle proteine di giunzione stretta nei ratti feriti da I/R
L'interruzione del BBB può aumentare il contenuto di acqua del cervello e il gonfiore dei tessuti, causando lesioni cerebrali. Le proteine a giunzione stretta sono componenti strutturali importanti della BBB (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Per verificare se il trattamento con TG, PS e OS dopo l'ictus potesse influenzare l'integrità della BBB, le espressioni di ZO-1, claudina-5 e occludina sono state eseguite mediante analisi di immunofluorescenza. I risultati hanno indicato che le espressioni di claudin-5, occludin e ZO-1 erano visibilmente diminuite nel gruppo MOD. Tuttavia, sono aumentati sostanzialmente dopo 14 giorni di somministrazione di TG. I gruppi PS e OS non hanno mostrato cambiamenti significativi in queste espressioni proteiche (Figura 7). Questi dati hanno indicato che i TG possono regolare le espressioni proteiche della giunzione stretta e probabilmente mantenere l'integrità della BBB dopo la lesione I/R.
I TG aumentano la copertura dei periciti sui capillari nei ratti feriti da I/R
La copertura dei periciti sui capillari gioca un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'integrità della BBB (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Pertanto, abbiamo testato se la copertura dei periciti potesse essere aumentata dal trattamento di TG, PS e OS. I risultati dell'analisi dell'intensità dell'immunofluorescenza hanno mostrato che entrambe le espressioni di PDGFRb e CD31 erano drasticamente diminuite nel gruppo MOD. La somministrazione di TG ai ratti I/R ha recuperato significativamente o addirittura aumentato le intensità di espressione di PDGFRb e CD31, ma è stata osservata una nodifferenza nei gruppi di trattamento PS e OS (Figura 8). Pertanto, il trattamento dei TG potrebbe aumentare significativamente la copertura dei periciti. Questi risultati hanno ulteriormente confermato che i TG possono mantenere l'integrità di BBB dopo I/R.
I TG promuovono il rimodellamento neurale nei ratti I/Rinfortunati
Secondo numerosi studi, la neurogenesi dopo un ictus può migliorare significativamente il recupero funzionale (Grefkes e Ward, 2014; Zhang et al., 2019). La sinaptofisina (SYN), le proteine della densità postsinaptica 95 (PSD-95) e la proteina 2 associata ai microtubuli (MAP-2) sono state utilizzate come marcatori per esaminare la plasticità neuronale nella penombra ischemica della corteccia. Al fine di valutare gli effetti del trattamento con TG, PS e OS sulla neurogenesi nei ratti feriti da I/R, sono state eseguite l'immunofluorescenza e il western blot per le espressioni SYN, PSD95 e MAP-2. Come mostrato nelle Figure 9 e 10, i livelli di espressione SYN, PSD95 e MAP-2 nei ratti I/R dopo 14 giorni di riperfusione sono diminuiti rispetto ai ratti NOR, mentre la cura di TG e PS potrebbe aumentare significativamente i loro livelli di espressione . Il gruppo OS non ha avuto cambiamenti significativi rispetto al gruppo MOD. I dati indicavano che la cura di TG e PS era in grado di promuovere notevolmente il rimodellamento neurale dopo una lesione I/R.
TGs Alter Nrf-2 e Keap{1}} Expressions inI/R Ratti feriti
Lo stress ossidativo è un meccanismo patogeno principale nella lesione I/R (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Gli studi hanno verificato che Nrf-2 è un regolatore principale delle risposte antiossidanti (Thompson et al.,2015). Per studiare le risposte ossidative mediate da Nrf-2 e Keap-1 dopo lesione I/R, abbiamo valutato l'espressione citoplasmatica e la traslocazione nucleare di Keap-1. Nel frattempo, l'espressione di Nrf{{7 }} nei tessuti cerebrali di ratti feriti I/R è stato anche analizzato (Figure 10 e 11). Secondo l'analisi dell'immunofluorescenza, è stato riscontrato che Nrf-2 è localizzato principalmente nel citoplasma nel gruppo NOR. Nel gruppo TGs, l'espressione di Nrf-2 nella localizzazione citoplasmatica era sottoregolata, ma sovraregolata nel nucleo ed è stata osservata anche una ridotta espressione di Keap-1. I dati hanno mostrato che la protezione cerebrale dei TG potrebbe essere associata alla modulazione di Nrf-2 e Keap-1.
FIGURA 4|I TG attenuano il danno neuronale dopo i ratti trattati con I/R.
I TG attenuano lo stress ossidativo del tessuto cerebrale nei ratti con lesioni I/R
Al fine di confermare gli effetti antiossidanti dei TG, sono state valutate le attività di SOD, CAT, GSH-Px e MDA in ratti feriti I/R. Nella Figura 12, il contenuto di MDA è stato notevolmente aumentato nel gruppo MOD e, allo stesso tempo, le attività di SOD, CAT e GSH-Px sono state ridotte rispetto ai ratti normali. Al contrario, il trattamento con TG ha portato a una diminuzione significativa nel contenuto di MDA e un aumento delle attività di SOD, CAT e GSH-Px. Questi risultati hanno ulteriormente confermato l'attività antiossidante dei TG.
DISCUSSIONE
Molti studi suggeriscono che la MTC C. deserticola ha attività biologiche estese, ad esempio migliorando la capacità di apprendimento, la memoria e l'immunità (Dong et al., 2007; Jiang e Tu, 2009; Wanget al., 2017; Xia et al., 2018 ). Tuttavia, i componenti attivi di C. deserticola per la neuroprotezione rimangono poco chiari. Il presente lavoro mira a schermare i componenti attivi di C. deserticola contro l'ictus ischemico sul modello MCAO/R. Tre estratti di C. deserticola (TG, PS e OS) sono stati utilizzati per valutare i loro effetti sui ratti MCAO/R, nonché i possibili meccanismi.
L'ictus è una malattia cerebrovascolare acuta comune. Studi epidemiologici mostrano che l'ictus è più comune negli uomini che nelle donne (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik e Bushnell, 2017). Pertanto, nel nostro esperimento, per i test sono stati adottati ratti maschi. I nostri risultati hanno dimostrato che l'induzione I/R accelerava lo stress ossidativo e il volume dell'infarto, rompendo il BBB e provocando lesioni nervose e cerebrovascolari. Dopo lo screening, è stato riscontrato che i TG riducono il volume dell'infarto e promuovono il rimodellamento neurale e l'angiogenesi. Inoltre, è stato osservato che i TG mantengono l'integrità della BBB dopo la lesione I/R. Al contrario, PS e OS non alleviano in modo significativo il danno I/R. Pertanto, i TG sono considerati la principale frazione attiva della forneuroprotezione di C. deserticola, potenzialmente attraverso la promozione del rimodellamento neurale, dell'angiogenesi e dell'integrità della BBB attraverso l'attivazione del percorso Nrf-2/Keap-1.
FIGURA 5|I TG attenuano l'interruzione del BBB dopo un danno I/R.
Prove crescenti indicano che l'instaurazione di un'efficace circolazione collaterale è significativamente importante per evitare la formazione di infarto e penombra ischemica ed è un trattamento critico in una fase iniziale dell'ictus ischemico (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). La proliferazione delle cellule endoteliali vascolari e delle cellule muscolari lisce dopo l'infarto ischemico determina l'instaurarsi di una circolazione collaterale. Tuttavia, i modelli di ischemia hanno un fenomeno comune, ovvero lo stress ossidativo ampiamente esistito nella microvascolarizzazione cerebrale. I dati dello studio hanno mostrato che un gran numero di antiossidanti può disturbare la funzione del BBB e le proprietà dell'angiogenesi (Mentor e Fisher, 2017). CD31 e a-SMA sono rispettivamente i marcatori delle cellule endoteliali vascolari e delle cellule muscolari lisce (Saboor et al., 2016). Per studiare l'effetto sulla proliferazione cellulare sopra menzionata degli estratti di C.deserticola, abbiamo esaminato le espressioni di CD31 e a-SMA nell'omogenato di penombra ischemica cerebrale. I nostri dati hanno mostrato che i TG hanno migliorato in modo sorprendente le espressioni di CD31 e a-SMA. Tuttavia, non ci sono state differenze significative per i gruppi di PS e OS. Pertanto, abbiamo dedotto che i TG possono ridurre il danno cerebrale promuovendo l'angiogenesi aumentando le espressioni di CD31 e a-SMA, mentre PS e OS non fornivano tale protezione dal danno cerebrale. Questi risultati hanno ulteriormente confermato che solo TG potrebbe prevenire il danno cerebrale I/R.
L'ictus ischemico può essere pensato come il risultato di un'ischemia cerebrale causata da una compromissione della plasticità neuronale o dal rimodellamento delle aree cerebrali. La maggior parte dei pazienti colpiti da ictus soffre di deficit neurologici. L'attivazione della neurogenesi è una strategia promettente per i pazienti con ictus per migliorare le loro funzioni neurologiche (Cramer e Chopp, 2000). La neurogenesi partecipa direttamente al recupero della funzione neurologica dopo I/Rinjury cerebrale (Zhang et al., 2019). Ricerche precedenti mostrano che i TG possono migliorare il tasso di sopravvivenza delle cellule piramidali dell'ippocampo e indurre la neurogenesi (Lian et al., 2017). Lo stress ossidativo provoca la perdita di neuroni durante molte malattie, come il Parkinson, l'ictus e così via (Duan e Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2trascrive molti geni correlati alla neuroprotezione nella loro regione promotrice, tra cui principalmente SOD, MDA, CAT e g glutamil-cisteina ligasi, ecc. (Satoh et al., 2006). Le proteine SYN, PSD-95 e MAP-2, che sono strettamente associate alla formazione sinaptica e alla neurotrasmissione, possono essere considerate come marcatori della plasticità neuronale della ricerca nella regione della penombra ischemica. Dopo aver studiato, abbiamo scoperto che la cura con I TG potrebbero aumentare significativamente le espressioni di PSD95, SYN e MAP-2, indicando che la protezione cerebrale dei TG era correlata con la maggiore plasticità neuronale durante I/R. Tuttavia, è un peccato che non vi siano differenze evidenti anche per i PSsa come gruppi di sistemi operativi. Questi risultati hanno indicato che i TG potrebbero migliorare la neuroplasticità dopo una lesione cerebrale I/R.
La ricerca di immagini sui pazienti con ictus ha mostrato che la disfunzione BBB può essere considerata un attributo sorprendente del cervello peri-ischemico (Bang et al., 2007). I TJ, che sono composti da proteine citoplasmatiche, proteine transmembrana e molecole di giunzione-adesione tra le cellule endoteliali capillari, sono molto importanti nel mantenimento dell'integrità della BBB (Ye et al., 2019). Tra questi, ZO-1, claudina-5 e occludina sono le proteine più importanti nei TJ. Prove crescenti indicano che l'aumentata permeabilità della BBB indotta dall'ischemia è generalmente correlata alle alterazioni di ZO-1, claudina-5 e occludina (Cao et al.,2016a; Page et al., 2016; Yu et al. ., 2017; Liu et al., 2018). In questo lavoro, i risultati hanno dimostrato che, sebbene i TG potessero aumentare significativamente le espressioni di ZO-1, claudina-5 e proteine occludine nei tessuti cerebrali indotti da MCAO, né i PSs né gli OS lo facevano. Il BBB è costituito da cellule endoteliali cerebrali ed è strettamente associato ai periciti (Nyul-Toth et al., 2016). I periciti sono vitali per l'integrità del BBB (Bell et al., 2010). L'ictus ischemico innesca la morte e il distacco dei periciti dalle cellule endoteliali nella fase acuta, destabilizzando così la microvascolarizzazione e alterando le proprietà del BBB (Zechariahet al., 2013). I nostri dati hanno mostrato che i TG possono aumentare la copertura dei periciti sui capillari e aumentare i livelli di espressione di ZO-1, claudina-5 e occludina. Questi fenomeni hanno dimostrato che i TG potrebbero proteggere efficacemente l'integrità della BBB dopo la lesione cerebrale I/R. In sintesi, i TG possono attenuare il danno cerebrale in diversi modi, come promuovere l'angiogenesi, migliorare la plasticità neuronale e mantenere l'integrità del BBB.
Abbiamo quindi studiato il percorso di segnalazione per esplorare il meccanismo alla base della protezione del cervello dei TG. Il processo di lesione I/R è multifattoriale e quindi numerosi meccanismi sono coinvolti nella patogenesi. Lo stress ossidativo è un fattore di rischio fondamentale che contribuisce al danno cerebrale indotto da I/R (Suda et al., 2013), come il danno alla struttura BBB, la disfunzione endoteliale vascolare e l'aggravamento del danno neuronale ischemico (Xiong et al., 2015; Caglayan et al. al., 2019; Priestley et al., 2019). Pertanto, lo stress ossidativo è diventato un bersaglio terapeutico attraente nel danno cerebrale indotto da I/R. Gli enzimi di fase 2, che sono mediati dal fattore nucleare E2-fattore correlato-2 (Nrf-2), hanno è stato considerato un mezzo importante attraverso il quale i neuroni si proteggono dallo stress ossidativo (Suzukiand Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). Prove crescenti indicano che l'attivazione di Nrf-2 durante I/R è un potenziale bersaglio terapeutico per la neuroprotezione (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, come importante regolatore della difesa antiossidante endogena, media il livello di eme ossigenasi 1 (HO-1) e altri enzimi antiossidanti, come NAD(P)H chinone ossidoreduttasi1 (NQO1), SOD, CAT, GSH e MDA (Siow et al., 2007; Dinget al., 2014). Inoltre, Nrf-2 svolge un importante ruolo regolatore nell'angiogenesi. Il presente studio mostra che Nrf-2 può essere notevolmente potenziato e attivato nel processo di sviluppo vascolare (Wei et al., 2013).
Come descritto in precedenza (Jiang e Tu, 2009), i TG contengono molti composti bioattivi, ad esempio echinacoside, tubuloside A, acteoside, isoacteoside e 2'-acetilacteoside, e alcuni di loro hanno mostrato funzioni neuroprotettive dopo danno cerebrale I/R (Penget al ., 2016). L'echinacoside ha molti effetti farmacologici, come antiossidante, anti-senescenza, neuroprotezione, antinfiammatorio, promozione della cicatrizzazione, epatoprotezione, promozione della formazione ossea e attività antitumorali (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. et al., 2018; Ji et al., 2019; Xu et al., 2019). Recentemente, l'echinacoside è stato identificato come un potente antiossidante nel sistema nervoso centrale (Lu et al., 2016). L'echinacoside può ridurre il contenuto di MDA e migliorare le attività di SOD e GSH Px nel danno cerebrale da ischemia e l'analisi dell'aggancio molecolare ha mostrato che l'echinacoside può legarsi a Keap-1, portando alla traslocazione nucleare Nrf-2 (Li et al. , 2018). Lo studio di Xia ha mostrato che l'acteoside potrebbe diminuire il volume dell'infarto e il contenuto idrico cerebrale per migliorare i deficit neurologici nei ratti MCAO/R attraverso la mitigazione dello stress ossidativo (Xia et al., 2018). Altri studi hanno dimostrato che l'isoacteoside potrebbe aumentare le attività degli enzimi antiossidanti cellulari, SOD e CAT nelle cellule H2O2-trattate V79-4 (Chae et al., 2005). Sulla base delle segnalazioni di cui sopra sui composti attivi contenuti nei TG, è possibile dedurre che i TG potrebbero proteggere dall'ictus ischemico attraverso le vie antiossidanti.
Li ha riportato gli effetti neuroprotettivi dei feniletanoidiglicosidi (PhG) sull'apoptosi indotta da H2O2- sulle cellule PC12 tramite la via Nrf2/ARE (Li et al., 2018). Questi PhG sono stati significativamente soppressi innescando la traslocazione nucleare Nrf2 e aumentando le espressioni di HO-1, NQO1, subunità catalitica glutammato-cisteina ligasi (GCLC) e subunità modificatrice glutammato-cisteina ligasi (GCLM) (Li et al., 2018; Gong et al., 2019). Pertanto, questi risultati suggeriscono che il percorso Nrf-2/ARE svolga un ruolo cruciale negli effetti protettivi mediati da PhGs sulle cellule neuronali. Allo stesso modo, in questo studio, abbiamo scoperto che i TG potrebbero diminuire il livello di MDA e aumentare i livelli di SOD, CAT e GSH-Px nei ratti I/R. Nel frattempo, i TG potrebbero sovraregolare l'espressione di Nrf2 nel nucleo, sottoregolare l'espressione corrispondente in tecitoplasma e riducono significativamente l'espressione di Keap-1. Pertanto, il percorso Nrf-2/Keap-1 può essere coinvolto negli effetti neuroprotettivi mediati dai TG. Un'ulteriore convalida di questo percorso verrebbe eseguita in futuro in colture cellulari in vitro con modelli di lesioni da privazione/riossigenazione di ossigeno-glucosede. Inoltre, C. estratti di deserticola sono stati somministrati nel nostro studio per 14 giorni ininterrottamente. Poiché la neurogenesi dell'adulto influenzerebbe l'interpretazione degli effetti neuroprotettivi durante i 14 giorni di riperfusione, la neurogenesi non può essere esclusa nel nostro attuale progetto di esperimento per esplorare l'effetto neuroprotettivo delle TC. Questo è il limite della nostra ricerca.
In conclusione, sono i TG di C. deserticola che possono migliorare l'angiogenesi e la neurogenesi oltre a mantenere l'integrità del BBB nei ratti con lesioni I/R, ma non i PS e gli OS. Gli effetti potrebbero essere mediati dall'attivazione del percorso Nrf-2/Keap-1.
