Il lettore RNA M6 A YTHDF2 controlla l'immunità antitumorale e antivirale delle cellule NK Parte 3

YTHDF2 è necessario per la sopravvivenza, la proliferazione e le funzioni effettrici delle cellule NK mediate da IL-15

IL-15 è una delle citochine, se non la più importante, per le funzioni pleiotropiche delle cellule NK. Noi e altri abbiamo scoperto in precedenza che IL-15 svolge un ruolo chiave nella regolazione dell'omeostasi, della sopravvivenza e delle funzioni effettrici delle cellule NK (Becknell e Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson et al., 1994; Wang et al., 2019b; Yu et al.,2013).

La pleiotropia delle cellule si riferisce alla loro capacità di svolgere diverse funzioni in diversi ambienti. La pleiotropia cellulare è strettamente correlata all’immunità perché molte cellule del sistema immunitario possono svolgere una varietà di ruoli diversi.

Nel sistema immunitario, le cellule T sono un tipo di cellule molto critico. Riconoscono e attaccano gli agenti patogeni, regolando anche l'attività di altre cellule immunitarie. La pleiotropia delle cellule T è molto importante perché quando il sistema immunitario incontra un nuovo agente patogeno, le cellule T devono svolgere ruoli diversi in un breve periodo per rispondere efficacemente. Ad esempio, quando il sistema immunitario incontra un’infezione batterica, le cellule T devono svolgere il ruolo di uccidere i batteri, e quando il sistema immunitario incontra un’infezione virale, le cellule T devono svolgere il ruolo di regolare altre cellule immunitarie.

Inoltre, nel sistema immunitario, anche una classe di cellule chiamate macrofagi ha effetti pleiotropici. Possono fagocitare e abbattere gli agenti patogeni estranei e possono anche attivare altre cellule immunitarie per attaccare gli agenti patogeni. La pleiotropia dei macrofagi è importante perché devono svolgere ruoli diversi in ambienti diversi. Ad esempio, nelle infezioni virali, i macrofagi devono secernere alcune sostanze per combattere il virus, mentre nelle infezioni batteriche, i macrofagi devono fagocitare e digerire i batteri per eliminare l’agente patogeno.

In sintesi, esiste una stretta relazione tra pleiotropia cellulare e immunità. Le cellule pleiotropiche possono svolgere ruoli diversi in ambienti infettati da diversi agenti patogeni, migliorando così la capacità del sistema immunitario di rispondere e migliorando l’immunità del corpo a vari agenti patogeni. Pertanto, dovremmo prestare attenzione alla pleiotropia delle cellule e anche rafforzare la coltivazione dell’immunità per mantenere la salute umana. Si può vedere che abbiamo bisogno di migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come ad esempio aumentare i livelli di acetilcolina e i fattori di crescita. Queste sostanze sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, Cistanche deserticola può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l’apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello riceva nutrienti ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello.

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Nel presente studio, mostriamo che IL-15 ha sovraregolato i livelli di mRNA e proteina di YTHDF2 nelle cellule NK (Fig. 6 A; e Fig. 1, D – F). Pertanto, abbiamo ipotizzato che YTHDF2 sia necessario per la sopravvivenza mediata da IL-15 e per le funzioni effettrici delle cellule NK.

Per prima cosa abbiamo tentato di identificare potenziali fattori di trascrizione a valle della segnalazione IL-15 che regolano direttamente l'espressione YTHDF2. Abbiamo analizzato l'Enciclopedia degli elementi del DNA utilizzando il Genome Browser Database dell'Università della California, Santa Cruz (https://genome.ucsc.edu), che fornisce previsioni sui siti di legame nell'intero genoma, in combinazione con JASPAR (http://jaspar.genereg .netto).

Abbiamo scoperto che STAT5, che è un fattore chiave a valle di IL-15 nelle cellule NK, ha quattro siti di legame entro 2 kb a monte del sito di inizio della trascrizione (TSS) di Ythdf2, indicando che IL-15 può positivamente regolare la trascrizione Ythdf2 nelle cellule NK del topo attraverso STAT5.

Utilizzando l'inibitore STAT5 STAT5-IN-1 (Müller et al., 2008), abbiamo dimostrato che l'inibizione di STAT5 ha comportato una diminuzione di Ythdf2 sia a livello di mRNA che di proteina nelle cellule NK murine (Fig. S4, A e B). Per confermare ulteriormente che YTHDF2 è un fattore a valle regolato da STAT5, abbiamo utilizzato topi Stat5fl/fl Ncr1-iCre (di seguito denominati topi Stat5ΔNK), dove STAT5 è specificatamente eliminato nelle cellule NK di topo (Wiedemann et al., 2020).

Abbiamo trattato le cellule NK spleniche dei topi Stat5WT e Stat5ΔNK con IL-15. Abbiamo scoperto che YTHDF2 è sostanzialmente diminuito nelle cellule NK dei topi Stat5ΔNK rispetto alle cellule NK dei topi Stat5WT sia a livello di loroRNA che a livello proteico (Fig. 6, B e C; e Fig. S4, C eD).

Il test reporter della luciferasi ha mostrato che sia STAT5a che STAT5b hanno attivato direttamente la trascrizione del gene Ythdf2 (Fig. 6, D ed E). I risultati dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) –qPCR hanno mostrato che STAT5 ha un arricchimento significativo su quattro siti rispetto al normale controllo IgG, indicando un legame diretto nelle cellule NK del topo (Fig. 6 F). Insieme, i nostri risultati dimostrano che l'espressione YTHDF2 è regolata da STAT5 a valle della segnalazione IL-15 nelle cellule NK.

Ci siamo poi chiesti se le cellule NK carenti di Ythdf2- fossero difettose nella loro risposta all'IL-15. Abbiamo isolato cellule NK spleniche da topi Ythdf2ΔNK e topi Ythdf2WT e le abbiamo coltivate in vitro in presenza di IL-15. Abbiamo scoperto che la crescita delle cellule NK era significativamente ridotta nei topi Ythdf2ΔNK rispetto ai topi Ythdf2WT (Fig. 6 G). Il test di marcatura CellTrace Violet (CTV) ha mostrato che la proliferazione delle cellule NK era compromessa dalla carenza di Ythdf2 (Fig. 6 H).

 L'analisi della distribuzione del ciclo cellulare ha rivelato una frazione significativamente maggiore di cellule NK dai topi Ythdf2ΔNK nella fase G0/G1 ma una frazione significativamente ridotta di cellule NK dai topi Ythdf2ΔNK nella fase S (Fig. 6 I), suggerendo che si verifica una carenza di Ythdf2 nell'arresto di fase G0/G1 nelle cellule NK.

Inoltre, si è verificato un aumento da due a tre volte delle cellule NK apoptotiche (annexin V+Sytox-Blue+/−) dei topi Ythdf2ΔNK rispetto a quelle dei topi Ythdf2WT (Fig. 6 J), indicando la sopravvivenza difettosa delle cellule NK dopo la perdita di Ythdf2. Questi risultati suggeriscono che YTHDF2 regola la reattività delle cellule NK all'IL-15 in vitro. Poiché IL-15 è scarsamente tradotto e secreto in vivo allo stato stazionario (Corbel et al., 1996; Fehniger et al.,2001), per esplorare se le cellule NK carenti di Ythdf2- sono difettose nella loro risposta a IL-15 in vivo, abbiamo trattato i topi con IL-15.

Abbiamo scoperto che le cellule Ythdf2-deficienti rispetto a quelle WT NK mostravano una proliferazione cellulare significativamente ridotta e un aumento dell'apoptosi cellulare quando i topi venivano trattati con IL-15 (Fig. 6 K; e Fig. S4, E–J). Questi dati suggeriscono che YTHDF2 regola la reattività delle cellule NK all'IL-15, specialmente in alcune condizioni con un livello elevato di IL-15. Abbiamo anche scoperto che i livelli di mRNA e proteine ​​di IFN-, granzima B e perforina erano significativamente ridotti nelle cellule NK Ythdf2ΔNK rispetto alle cellule NK Ythdf2WT in risposta a IL-15 (Fig. 6, L–N), indicando che YTHDF2 contribuisce anche alle funzioni effettrici delle cellule NK mediate da IL-15 in vitro.

Collettivamente, i nostri dati dimostrano che YTHDF2 è necessario per la sopravvivenza, la proliferazione e le funzioni effettrici delle cellule NK mediate da IL-15. Successivamente, abbiamo studiato i meccanismi a valle mediante i quali YTHDF2 regola la sopravvivenza, la proliferazione e la funzione effettrice delle cellule NK mediate da IL-15. Abbiamo scoperto che le cellule NK dei topi Ythdf2ΔNK e dei topi Ythdf2WT avevano livelli simili dei recettori IL-15 CD122 (IL-15R ) e CD132 (IL-15R c; Fig. S4 K). La segnalazione di IL-15 è mediata da almeno tre vie di segnalazione a valle nelle cellule NK: Ras–Raf–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR e JAK1/3–STAT3/5 (Mishra et al., 2014).

Per studiare quale percorso di segnalazione è regolato da YTHDF2 nelle cellule NK, abbiamo esaminato i livelli di fosforilazione delle cellule NK ERK, AKT, S6, STAT3 e STAT5 da topi Ythdf2ΔNK o topi Ythdf2WT dopo stimolazione con IL-15.

I risultati hanno mostrato che il deficit di Ythdf2 non ha influenzato la fosforilazione di ERK, AKT, S6 e STAT3 dopo stimolazione con IL-15 (Fig. S4, L e M) ma ha inibito significativamente l'attivazione di STAT5, come evidenziato dai ridotti livelli di fosforilazione di STAT5 in Ythdf{{ 7}}cellule NK carenti rispetto a quelle delle cellule NK dei topi Ythdf2WT (Fig. 6 O), indicando che YTHDF2 è richiesto per la segnalazione ottimale di IL-15/STAT5 nelle cellule NK attivate.

Poiché abbiamo dimostrato che STAT5 fosforilato a valle di IL-15 si lega al promotore di Ythdf2 (Fig. 6, D-F), e qui abbiamo dimostrato che YTHDF2 è necessario per una fosforilazione ottimale di STAT5, i nostri dati suggeriscono un ciclo di feedback positivo STAT5-YTHDF2 a valle di IL-15 che può controllare la sopravvivenza, la proliferazione e le funzioni effettrici delle cellule NK.

L'analisi dell'intero trascrittoma identifica Tardbp come bersaglio YTHDF2 nelle cellule NK

Per affrontare il meccanismo molecolare con cui YTHDF2 regola le cellule NK, abbiamo prima eseguito il sequenziamento dell'RNA (seq) nelle cellule NK Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK espanse IL-2. La delezione di Ythdf2 nelle cellule NK ha prodotto 617 geni espressi in modo differenziale, inclusi 252 geni sovraregolati e 365 geni sottoregolati (Fig. S5 A).

L'analisi dell'ontologia genetica (GO) ha mostrato che i geni espressi in modo differenziale erano significativamente arricchiti nei processi legati al ciclo cellulare, alla divisione cellulare e alla divisione cellulare, tra cui mitoticcitocinesi, segregazione cromosomica, fuso, nucleosoma, corpo centrale e cromosoma (Fig. 7 UN).

L'analisi dell'arricchimento del set di geni (GSEA) ha dimostrato un arricchimento significativo dei target E2F, del checkpoint G2 / M e dei set di geni caratteristici del fuso mitotico nelle cellule Ythdf2ΔNKNK (Fig. S5 B). I geni correlati al ciclo cellulare e alla divisione cellulare, inclusi Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 e Plk1 (Bertoli et al., 2013), erano significativamente diminuiti nelle cellule NK dei topi Ythdf2ΔNK (Fig. 7 B ).

Anche i geni di segregazione del fuso e dei cromosomi come Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 e Tpx2 (Gorbsky, 2015) erano significativamente sottoregolati nelle cellule NK dei topi Ythdf2ΔNK rispetto alle cellule NK dei topi Ythdf2WT (Fig. 7 C).

Inoltre, i geni di sopravvivenza cellulare, inclusi Birc5 (Niu et al., 2010), Septin4 (Larisch et al., 2000) e Rffl (Yanget al., 2007), erano significativamente diminuiti nelle cellule NK dei topi Ythdf2ΔNK (Fig. 7D). Anche i geni della funzione effettrice delle cellule NK, inclusi Klrk1, Ncr1, CD226 e Gzma (Bezman et al., 2012), erano significativamente sottoregolati nelle cellule NK dei topi Ythdf2ΔNK (Fig. 7 D).

Questi dati supportano i nostri ruoli caratterizzati di YTHDF2 nella regolazione della proliferazione, sopravvivenza e funzioni effettrici delle cellule NK. Abbiamo quindi eseguito m6A-seq in cellule NK espanse IL-2 da topi Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK. L'analisi delle componenti principali ha mostrato che tre repliche biologiche di ciascun genotipo si raggruppavano insieme (dati non mostrati), suggerendo una buona ripetibilità dei campioni m6A-seq.

L'ottimizzazione ipergeometrica dell'analisi di arricchimento del motivo (HOMER) ha identificato il motivo di consenso m6A (GGAC), indicando il successo dell'arricchimento delle trascrizioni modificate da m6A (Fig. 7 E). Le modifiche di m6A erano prevalentemente localizzate nelle trascrizioni codificanti le proteine ​​e i picchi erano arricchiti nelle 59 regioni non tradotte (UTR) e 39UTR, in particolare attorno ai codoni di inizio e fine (Fig. 7 F e Fig. S5 C).

L'analisi di arricchimento dei geni con picchi m6A ha rivelato che la maggior parte delle trascrizioni marcate con m6A nelle cellule NK erano arricchite in percorsi coinvolti nel ciclo cellulare e nella proliferazione cellulare (Fig. S5 D).

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