Il lettore RNA M6 A YTHDF2 controlla l'immunità antitumorale e antivirale delle cellule NK Parte 2

YTHDF2 è necessario per la funzione antivirale delle cellule NK

Per determinare se il deficit di Ythdf2 influisce sull'attività antivirale delle cellule NK, abbiamo iniettato 2,5 × 104 PFU di MCMV nei topi Ythdf2WT e nei topi Ythdf2ΔNK.

L’attività antivirale e l’immunità sono inseparabili e hanno una stretta relazione. I virus sono microrganismi molto piccoli, ma possono causare molte malattie e persino la morte nei casi più gravi.

L'attività antivirale si riferisce alla capacità del corpo di combattere i virus. Le persone con alti livelli di attività antivirale possono eliminare i virus più rapidamente e resistere efficacemente all’insorgenza della malattia. L'immunità si riferisce alle sostanze difensive prodotte dall'organismo dopo il periodo di adattamento, che possono eliminare le sostanze nocive dall'organismo.

Dormire a sufficienza, seguire una dieta sana ed esercitare sono estremamente importanti per mantenere una buona salute. Questi fattori possono migliorare l’immunità umana e quindi potenziare l’attività antivirale del corpo. Soprattutto durante questo periodo di pandemia di COVID-19, è importante rimanere in salute.

Inoltre, un umore stabile ha anche un grande impatto sul sistema immunitario. Un atteggiamento ottimista può far sentire le persone a proprio agio fisicamente e mentalmente, migliorando così l’immunità e l’attività antivirale. Al contrario, le emozioni pessimistiche ridurranno l'immunità del corpo e renderanno il corpo più vulnerabile agli attacchi dei virus.

In breve, l'attività antivirale e l'immunità sono correlate e dovremmo prestare attenzione a migliorare l'immunità e l'attività antivirale del corpo in vari modi per garantire la salute fisica e uno stile di vita sano. Si può vedere che dobbiamo migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola ha effetti antiossidanti, antinfiammatori e antinvecchiamento, che possono aiutare a ridurre l’ossidazione e le reazioni infiammatorie nel cervello, proteggendo così il cervello. salute del sistema nervoso. Inoltre, Cistanche deserticola può anche promuovere la crescita e la riparazione delle cellule nervose, migliorando così la connettività e la funzione delle reti neurali. Questi effetti possono aiutare a migliorare la memoria, l’apprendimento e la velocità di pensiero e possono anche prevenire lo sviluppo di disfunzioni cognitive e malattie neurodegenerative.

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I risultati hanno mostrato che i topi Ythdf2ΔNK erano più suscettibili all'infezione da MCMV, come dimostrato da una significativa perdita di peso e da un aumento dei titoli virali nel sangue, nella milza e nel fegato rispetto ai topi Ythdf2WT (Fig. 3, A e B; e Fig. S2, A e B) .

Abbiamo anche osservato una riduzione significativa della percentuale e del numero assoluto di cellule NK totali nella milza e nel sangue dei topi Ythdf2ΔNK rispetto a quelli dei topi Ythdf2WT dopo l'infezione (Fig. 3, C e D; e Fig. S2, C e D). Ulteriori analisi hanno mostrato che le cellule NK dei topi Ythdf2ΔNK avevano un'espressione di Ki67 significativamente inferiore rispetto ai topi Ythdf2WT (Fig. 3, E-G).

Tuttavia, la vitalità delle cellule NK era simile tra i topi Ythdf2WT e i topi Ythdf2ΔNK, come mostrato dalla colorazione dell'annexina V (Fig. S2 E). Questi dati indicano che la carenza di YTHDF2 nelle cellule NK determina un difetto nella proliferazione cellulare piuttosto che nella sopravvivenza cellulare durante l'infezione virale.

Le cellule NK inibiscono l'infezione da MCMV attraverso i recettori attivanti Ly49H e Ly49D e il processo è caratterizzato da una risposta antivirale mediata da perforina o IFN (Arase et al., 2002; Lee et al., 2009; Loh et al., 2005; Orr et al., 2005; al., 2010; Sumaria et al., 2009). Abbiamo scoperto che i topi Ythdf2ΔNK avevano cellule NK Ly49H+ e Ly49D+ significativamente ridotte nella milza e nel sangue rispetto ai topi Ythdf2WT dopo l'infezione (Fig. 3, H–J; e Fig. S2, F–K).

Ulteriori analisi hanno dimostrato che, sebbene in percentuale, solo le cellule Ly49D+Ly49H+ hanno mostrato una differenza nei topi Ythdf2ΔNK rispetto a quella dei topi Ythdf2WT, il numero di cellule assolute delle cellule Ly49D−Ly49H+ NK, delle cellule Ly49D+Ly49H− NK e delle cellule Ly49D+Ly49H+ NK nei topi la milza e il sangue erano tutti significativamente diminuiti nei topi Ythdf2ΔNK rispetto ai topi Ythdf2WT dopo l'infezione (Fig. S2, L-W).

I nostri dati suggeriscono che il controllo dell'infezione da MCMV da parte di YTHDF2 sembra essere mediato principalmente dalle cellule NK Ly49D+Ly49H+. La produzione di granzima B e IFN da parte delle cellule NK nei topi Ythdf2ΔNK era paragonabile a quella dei topi Ythdf2WT (Fig. S2, X e Y).

Abbiamo riscontrato una produzione di perforina significativamente ridotta da parte dei topi Ythdf2ΔNK rispetto a quella dei topi Ythdf2WT sia nella milza che nel sangue 7 giorni dopo l'infezione (Fig. 3, K-M), indicando che YTHDF2 influenza principalmente l'attività antivirale mediata dalla perforina contro MCMV nelle cellule NK. Questi dati suggeriscono che YTHDF2 è fondamentale per l'espansione delle cellule NK e la funzione effettrice durante l'infezione da MCMV.

YTHDF2 controlla l'omeostasi delle cellule NK e la maturazione terminale allo stato stazionario

I risultati di cui sopra secondo cui la carenza di Ythdf2 nelle cellule NK ha aumentato le metastasi tumorali e ha ridotto la capacità delle cellule NK di controllare l'infezione da MCMV ci ha incoraggiato a studiare se YTHDF2 è necessario per il mantenimento delle cellule NK allo stato stazionario.

Come mostrato nella Figura 4 A, la frequenza e il numero assoluto delle cellule NK erano significativamente ridotti nel sangue periferico, nella milza, nel fegato e nei polmoni ma non nel midollo osseo (BM) dei topi Ythdf2ΔNK rispetto ai topi Ythdf2WT.

Tuttavia, non ci sono stati cambiamenti significativi tra il progenitore linfoide comune, il progenitore delle cellule pre-NK e il progenitore delle cellule NK raffinato (NKP) nel BM (Fathman et al., 2011) tra i topi Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK (Fig. S3 A), indicando che YTHDF2 potrebbe non influenzare lo sviluppo iniziale delle cellule NK nel nostro modello. Per esplorare i potenziali meccanismi responsabili della diminuzione delle cellule NK nei topi Ythdf2ΔNK, abbiamo studiato la proliferazione cellulare, la vitalità e la capacità di traffico delle cellule NK dopo la delezione di Ythdf2 allo stato stazionario.

La percentuale di cellule NK proliferanti era paragonabile tra i topi Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK, come evidenziato dalla colorazione Ki67 (Fig. S3 B). La vitalità delle cellule NK era equivalente anche tra i topi Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK, come mostrato dalla colorazione dell'annessina V (Fig. S3 C).

Per verificare se YTHDF2 influenza l'uscita delle cellule NK dal midollo osseo alla periferia, ai topi Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK è stato iniettato iv un anticorpo antiCD45 per marcare le cellule immunitarie e sacrificati dopo 2 minuti e le loro cellule BM sono state analizzate. Ciò ci ha permesso di quantificare il numero di cellule NK nelle regioni sinusoidali e parenchimali del midollo osseo, un indicatore del traffico di cellule NK dal midollo osseo al sangue periferico in uno stato stazionario (Leong et al., 2015).

I risultati hanno mostrato una riduzione significativa della frequenza delle cellule NK CD45+ nei topi Ythdf2ΔNK rispetto ai topi Ythdf2WT nei sinusoidi (Fig. 4 B), indicando che il deficit di Ythdf2 ostacola l'uscita delle cellule NK dal midollo osseo al sistema di circolazione in vivo .Le cellule immunitarie subiscono una proliferazione omeostatica durante la linfopenia indotta da alcune infezioni virali o causata dalla chemioterapia (Sun et al., 2011).

Sebbene abbiamo scoperto che YTHDF2 è superfluo per la proliferazione delle cellule NK allo stato stazionario, abbiamo osservato una diminuzione significativa della proliferazione cellulare durante l'infezione da MCMV (Fig. 3, E-G). Abbiamo quindi studiato il ruolo di YTHDF2 nella regolazione della proliferazione omeostatica delle cellule NK in un contesto linfopenico in vivo. Abbiamo cotrasferito un numero uguale di cellule NK spleniche da topi CD45.2 Ythdf2ΔNK o topi congenici CD45.1 a topi Rag2−/−Il2rg−/− carenti di linfociti.

I risultati hanno mostrato che una percentuale maggiore di cellule NK derivava da topi di controllo CD45.1WT rispetto a topi CD45.2 Ythdf2ΔNK il giorno 3 dopo il trasferimento cellulare (Fig. S3 D). Ulteriori analisi hanno dimostrato che la riduzione delle cellule NK nei topi Ythdf2ΔNK era dovuta alla ridotta proliferazione cellulare (Fig. S3 E) ma non all'apoptosi cellulare (Fig. S3 F), suggerendo che YTHDF2 guida la proliferazione omeostatica delle cellule NK in vivo in condizioni linfopeniche.

Un'ulteriore differenziazione delle cellule NK murine può essere classificata in stadi immaturi (CD11b−CD27+), maturi intermedi (CD11b+CD27+) e maturi terminali (CD11b+CD27−) in base ai livelli di CD11b e CD27 ( Chiossone et al., 2009; Geiger e Sun, 2016).

Abbiamo scoperto che l'espressione di Ythdf2 aumentava con la maturazione e che CD11b−CD27+, CD11b+CD27+ e CD11b+CD27− mostravano rispettivamente i livelli di espressione più basso, intermedio e più alto di Ythdf2 (Fig. S3 G ), indicando che YTHDF2 potrebbe essere coinvolto nella maturazione delle cellule NK. Abbiamo quindi studiato il ruolo di YTHDF2 nella maturazione delle cellule NK definita dai marcatori di superficie cellulare CD11b e CD27.

Abbiamo scoperto che la perdita di Ythdf2 nelle cellule NK ha comportato una diminuzione significativa della frequenza delle cellule NK mature terminali e/o un aumento delle cellule NK mature immature e intermedie nella milza, nel fegato, nel polmone e nel sangue ma non nel midollo osseo (Fig. 4 C e Fig. S3 H), indicando che YTHDF2 regola positivamente la maturazione delle cellule NK terminali. Coerentemente con questi dati, i livelli di KLRG1, che è un marcatore di maturazione delle cellule NK terminali, erano significativamente più bassi nei topi Ythdf2ΔNK nella milza, nel fegato e nel polmone ma non nella BM rispetto ai topi quello dei topi Ythdf2WT nei corrispondenti organi o compartimenti tissutali (Fig. 4 D).

Per determinare se la diminuzione del numero di cellule NK mature dovuta al deficit di Ythdf2 è intrinseca alla cellula, abbiamo creato chimere nei topi Rag2−/−Il2rg−/− iniettando cellule BM da topi CD45.1 WT e CD45.2 Ythdf2ΔNK, miscelati con un rapporto 1:1. rapporto.

Come dimostrato dalla citometria a flusso a 8 settimane dopo il trapianto, una proporzione ridotta di cellule NK mature terminali è stata derivata da cellule BM CD45.2 Ythdf2ΔNK rispetto a quelle da cellule di controllo CD45.1 WT (Fig. 4 E), suggerendo che la maturazione terminale delle cellule NK controllata da YTHDF2 è intrinseco alla cellula. I fattori di trascrizione T-box Eomes e Tbet sono fondamentali per la maturazione delle cellule NK (Daussy et al., 2014; Gordon et al., 2012).

La colorazione intracellulare ha rivelato una riduzione significativa dei livelli proteici di Eomes nelle cellule NK dei topi Ythdf2ΔNK rispetto ai topi Ythdf2WT (Fig. S3 I). Inoltre, abbiamo scoperto che la riduzione dei livelli di proteine ​​e mRNA degli Eome si verificava specificamente nelle cellule NK mature terminali (CD11b+CD27−) (Fig. S3, J-L).

Tuttavia, a differenza di Eomes, l'espressione di Tbet era equivalente nelle cellule NK tra i topi Ythdf2ΔNK e Ythdf2WT (Fig. S3, I e K), indicando che YTHDF2 probabilmente regola la maturazione terminale delle cellule NK prendendo di mira Eomes.

YTHDF2 promuove la funzione effettrice delle cellule NK

La nostra scoperta che il deficit di Ythdf2 ostacolava l'omeostasi e la maturazione delle cellule NK ci ha motivato a determinare se YTHDF2 reprimeva anche la funzione effettrice delle cellule NK. Il principale meccanismo che regola la funzione delle cellule NK è il contributo relativo dei recettori inibitori e attivanti (Chan et al., 2014).

Abbiamo quindi controllato i livelli di espressione delle molecole associate all'attivazione o all'inibizione delle cellule NK. Abbiamo scoperto che i livelli di espressione dei recettori attivanti CD226 e NKG2D, ma non del CD69, erano diminuiti nelle cellule NK spleniche dei topi Ythdf2ΔNK rispetto a quelli dei topi Ythdf2WT (Fig. 5 A), mentre i recettori inibitori NKG2A, TIGIT e PD{{ 7}} erano simili tra i topi Ythdf2ΔNK e i topi Ythdf2WT (Fig. 5 A e Fig.S3 M).

Inoltre, le cellule NK Ythdf2ΔNK hanno prodotto una quantità significativamente inferiore di cellule NK IFN- rispetto alle cellule NK Ythdf2WT quando stimolate con IL-12più IL-18 o con cellule di linfoma di topo YAC-1 (Fig. 5, B e C ).

Abbiamo quindi testato la capacità citotossica delle cellule NK Ythdf2ΔNK. Abbiamo scoperto che le cellule NK Ythdf2ΔNK avevano significativamente ridotto la citotossicità contro le linee cellulari di linfoma di topo carenti di MHC di classe I RMA-S (Fig. 5 D) ma mostravano una citotossicità simile contro le cellule RMA sufficienti di classe I di MHC (Fig. S3 N) come mostrato da un test 51Crassay . Presi insieme, questi risultati dimostrano che YTHDF2 è essenziale per la funzione effettrice delle cellule NK.

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