Il lettore RNA M6 A YTHDF2 controlla l'immunità antitumorale e antivirale delle cellule NK Parte 4

È noto che YTHDF2 agisce come un lettore di m6A, che riconosce e lega gli RNA contenenti m6A e regola la degradazione delle trascrizioni di m6A.
Abbiamo quindi eseguito l'immunoprecipitazione dell'RNA (RIP)-seq utilizzando l'anticorpo YTHDF2 per mappare le trascrizioni target legate da YTHDF2 nelle cellule NK. I siti di legame YTHDF2- sono stati arricchiti nella regione della sequenza codificante le proteine ​​e 39UTR (Fig. S5, E e F).

Il legame tra lettori e memoria è molto stretto. La lettura è uno dei modi migliori per migliorare le nostre capacità di memoria.

Quando leggiamo, il nostro cervello attraversa un processo complesso. Mentre scansioniamo le parole e le trasformiamo in significato, il nostro cervello crea costantemente nuove connessioni neuronali. Queste connessioni neuronali costituiscono il nostro sistema di memoria e ci aiutano a immagazzinare informazioni nella memoria a lungo termine.

Inoltre, la lettura stimola la nostra immaginazione e creatività, il che aiuta anche a migliorare la nostra memoria. Quando costruiamo immagini e scene nella nostra mente, il nostro cervello è attivamente impegnato, quindi si formano più connessioni neuronali, il che rafforza le nostre capacità di memoria.

Infine, leggere migliora anche la nostra attenzione e concentrazione. Quando ci concentriamo sulla lettura, il nostro cervello si esercita costantemente, ancora e ancora, il che rende la nostra memoria più forte.

Nel complesso, la lettura può avere un impatto estremamente positivo sulla nostra memoria. Coltivando l'abitudine di leggere e stimolando il nostro cervello attraverso la lettura, possiamo migliorare le nostre capacità di memoria e godere di una vita più ricca e interessante. Si può vedere che abbiamo bisogno di migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria perché la Cistanche deserticola è un materiale medicinale tradizionale cinese che ha molti effetti unici, uno dei quali è quello di migliorare la memoria. L'efficacia di Cistanche deserticola deriva dai molteplici principi attivi che contiene, tra cui acido tannico, polisaccaridi, glicosidi flavonoidi, ecc. Questi ingredienti possono promuovere la salute del cervello attraverso una varietà di percorsi.

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Abbiamo identificato 3.951 potenziali picchi di legame YTHDF2 da 1.290 trascrizioni, 426 (33%) dei quali sono stati rilevati con un significativo arricchimento di m6A. L'analisi di arricchimento GO ha mostrato che le 1.290 trascrizioni target YTHDF2 erano arricchite nella traduzione delle proteine, nel legame dell'RNA e nello splicing dell'RNA (Fig. S5 G).

Abbiamo quindi identificato le potenziali trascrizioni target dalle trascrizioni sovrapposte tramite RNA-seq, m6A-seq e RIP-seq e abbiamo scoperto che un set di 29 trascrizioni legate da YTHDF2 e contrassegnate con m6A (in entrambe le cellule Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK NK) erano espresse in modo differenziale tra le cellule NK da topi Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK (Fig. 7 G). Tra questi, 12 trascrizioni erano sovraregolate e 17 trascrizioni erano sottoregolate nelle cellule NK dei topi Ythdf2ΔNK rispetto a quelle delle cellule NK Ythdf2WT (Fig. 7 G).

Sulla base della nostra caratterizzazione funzionale di YTHDF2 e dell'analisi GO dai dati RNA-seq, la carenza di Ythdf2 influenza la divisione e la proliferazione delle cellule NK, possibilmente facilitando la degradazione dell'mRNA dei checkpoint del ciclo cellulare o dei regolatori negativi durante la divisione cellulare.

Tra i 12 trascritti sovraregolati, è stato segnalato che tre regolano negativamente la divisione cellulare o la proliferazione, tra cui Mdm2 (murine double minute 2 [MDM2]; Frum et al., 2009; Giono e Manfredi, 2007; Giono et al., 2017), Tardbp ( Proteina legante il DNA TAR 43 [TDP43]; Ayala et al., 2008; Sanna et al., 2020) e Crebzf (fattore di trascrizione CREB/ATFBZIP; Hu et al., 2020; López-Mateo et al.,2012) , suggerendo che sono i potenziali bersagli di YTHDF2 nelle cellule NK.

Da notare che i picchi m6A si adattano bene ai siti di legame YTHDF2- al 39UTR di Mdm2 e Tardbp e al 59UTR dei geni Crebzf, come mostrato da Integrative Genomics Viewer (Fig. 7 H).

Il RIP utilizzando l'anticorpo m6A o YTHDF2 seguendo qPCR ha confermato che Mdm2, Tardbp e Crebzf erano effettivamente m6Ametilati e arricchiti prevalentemente da YTHDF2 nelle cellule NK (Fig. 7, I e J), ​​supportando i dati m6A-seq e RIP-seq, che indicano che questi tre geni sono potenziali bersagli delle cellule inNK YTHDF2.

Per indagare se YTHDF2 regola l'espressione di Mdm2, Tardbp e Crebzf modulando la stabilità dell'mRNA, abbiamo misurato la degradazione dell'mRNA dei tre target mediante inibizione della trascrizione con actinomicina D nelle cellule NK dei topi Ythdf2ΔNK e Ythdf2WT.

I risultati hanno mostrato che Mdm2 e Tardbp, ma non Crebzf, avevano un'emivita più lunga nelle cellule NK dei topi Ythdf2ΔNK rispetto a quelle dei topi Ythdf2WT (Fig. 7, K – M), suggerendo che Mdm2 e Tardb sono regolati direttamente da YTHDF2 nelle cellule NK.

Utilizzando l'immunoblotting, abbiamo confermato che i livelli proteici di MDM2 e TDP43 erano sovraregolati nelle cellule NK dei topi Ythdf2ΔNK (Fig. S5 H). Per confermare ulteriormente che questi due geni sono bersagli funzionali di YTHDF2, abbiamo usato Mdm2- o Tardbp -siRNA specifico per abbattere l'espressione dei due geni in vitro (Fig. S5, I e J).

Abbiamo quindi confrontato la proliferazione cellulare e la sopravvivenza delle cellule Ythdf2ΔNKNK con e senza knockdown di Mdm2 o Tardbp in presenza di IL-15. I risultati hanno mostrato che l'abbattimento di Tardbp potrebbe almeno parzialmente salvare il difetto nella proliferazione cellulare e nella sopravvivenza cellulare nelle cellule NK dei topi Ythdf2ΔNK (Fig. 7, N e O).

Tuttavia, l'abbattimento di Mdm2 non ha avuto effetti di salvataggio (Fig. S5, K e L). Questi risultati indicano che YTHDF2 regola la proliferazione e la divisione delle cellule NK almeno parzialmente inibendo la stabilità dell'mRNA di Tardbp.

Discussione

In questo studio, riportiamo i molteplici ruoli della metilazione m6A mediata da YTHDF2- nell'immunità delle cellule NK. Abbiamo scoperto che YTHDF2, uno dei lettori più importanti delle modifiche di m6A, è fondamentale per il mantenimento dell'omeostasi, della maturazione, della sopravvivenza mediata da IL-15 e dell'attività antitumorale e antivirale delle cellule NK.

Abbiamo anche identificato un nuovo ciclo di feedback positivo tra STAT5 e YTHDF2, a valle di IL-15, che contribuisce alle funzioni effettrici e alla sopravvivenza nelle cellule NK di topo. Il nostro studio chiarisce i ruoli biologici della metilazione di YTHDF2 o m6A in generale nell'immunità innata delle cellule NK. Colma la lacuna di conoscenza su come YTHDF2 regola la risposta immunitaria innata alla trasformazione maligna e all’infezione virale.

I nostri risultati forniscono una nuova direzione per sfruttare l’immunità antitumorale delle cellule NK e contemporaneamente far avanzare la nostra comprensione delle modifiche di m6A nel modellare l’immunità innata. La proteina lettrice di m6A YTHDF2 regola la stabilità degli mRNA bersaglio (Du et al., 2016; Wang et al., 2014). Numerosi studi hanno supportato l’ampio impatto di YTHDF2 in vari processi biologici.

YTHDF2 sopprime la normale espansione e l'autorinnovamento delle cellule staminali ematopoietiche, ma è anche necessario per il mantenimento delle cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (Li et al., 2018; Mapperley et al., 2021 Paris et al., 2019; Wang et al., 2018a). Recentemente, questo gene è coinvolto nel contenimento dell’infiammazione durante l’infezione batterica (Wu et al., 2020a). Il ruolo e il meccanismo di YTHDF2 nello sviluppo del tumore sono stati ben studiati.

YTHDF2 promuove lo sviluppo delle cellule staminali leucemiche e l'inizio della leucemia mieloide acuta (Parigi et al., 2019). Oltre alla leucemia, è stato dimostrato che YTHDF2 promuove lo sviluppo di tumori solidi, tra cui il cancro alla prostata (Liet al., 2020), il glioblastoma (Dixit et al., 2021) e il carcinoma epatocellulare (Chen et al., 2018; Hou et al., 2019; Zhang et al.,2020), prendendo di mira diverse trascrizioni modificate da m6A, come i soppressori di astumor LHPP e NKX3-1 (Li et al., 2020), IGFBP3 (Dixit et al., 2021), OCT4 ( Zhang et al., 2020) e SOCS2 (Chenet al., 2018).

Sebbene YTHDF2 svolga un ruolo promotore nella progressione del tumore, il nostro studio rivela un ruolo benefico di YTHDF2 nella risposta immunitaria alle cellule tumorali, in particolare nelle cellule NK, che è una componente chiave dell'immunità innata contro le infezioni virali e la trasformazione maligna.

Pertanto, il futuro sviluppo di inibitori di YTHDF2 per colpire le cellule tumorali per la terapia del cancro dovrebbe essere perseguito con cautela poiché l'inibizione di YTHDF2 può compromettere la risposta antitumorale dell'ospite da parte delle cellule NK. D'altro canto, sfruttando l'attività antitumorale di YTHDF2 nelle cellule NK o in altre cellule immunitarie si dovrebbe considerare il suo potenziale effetto agendo direttamente sulle cellule tumorali. Il targeting differenziale di YTHDF2 nelle cellule tumorali e nelle cellule immunitarie dovrebbe massimizzare l'attività antitumorale.

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