Il lettore RNA M6 A YTHDF2 controlla l'immunità antitumorale e antivirale delle cellule NK Parte 1

introduzione

Le cellule natural killer (NK) sono le cellule linfoidi innate predominanti che mediano l'immunità antivirale e antitumorale (Spits et al.,2016). Riconoscono le cellule infette da virus e cancerose attraverso i loro recettori attivanti e inibitori espressi su molteplici superfici e le uccidono tramite un effetto citotossico (Sun e Lanier, 2011).

Il killer naturale è strettamente correlato all'immunità perché le cellule killer naturali sono una parte importante del sistema immunitario. Le cellule natural killer sono un tipo di cellule immunitarie in grado di identificare e uccidere rapidamente le cellule tumorali e gli agenti patogeni. Possono identificare e attaccare le cellule anormali senza causare danni alle cellule normali.

L'immunità è la capacità del corpo di resistere alle malattie e alle infezioni, ed è la difesa contro l'invasione di agenti patogeni estranei attraverso vari meccanismi del sistema immunitario. Le cellule natural killer sono una delle armi più importanti. Possono combattere direttamente gli agenti patogeni e le cellule tumorali e persino lavorare in combinazione con altre cellule immunitarie per migliorare l’effetto di lotta contro le malattie.

Mantenere una buona immunità è importante per prevenire e curare molte malattie. Alcuni fattori legati all’attività e all’immunità delle cellule killer naturali includono:

1. Alimentazione: buone abitudini alimentari e l'assunzione di nutrienti adeguati possono favorire l'attività delle cellule killer naturali. Ad esempio, sostanze nutritive come le vitamine C, E e l’acido folico svolgono un ruolo importante nell’aumentare l’attività delle cellule killer naturali.

2. Esercizio: un esercizio moderato può migliorare la funzione immunitaria e il numero di cellule killer naturali, promuovendo una migliore risposta immunitaria.

3. Stile di vita sano: smettere di fumare, limitare l'alcol, dormire a sufficienza, ridurre lo stress ed eliminare le emozioni negative può migliorare l'immunità e potenziare l'attività delle cellule killer naturali.

In breve, le cellule killer naturali sono una delle armi più importanti del sistema immunitario. Una buona immunità può proteggere il corpo dalle malattie. Adottando uno stile di vita sano, mantenendo una buona alimentazione e praticando un esercizio moderato, puoi aumentare il numero e l'attività delle cellule killer naturali, migliorare l'immunità e quindi migliorare continuamente la salute del tuo corpo. Si può vedere che abbiamo bisogno di migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria perché la Cistanche deserticola è un materiale medicinale tradizionale cinese che ha molti effetti unici, uno dei quali è quello di migliorare la memoria. L'efficacia di Cistanche deserticola deriva dai molteplici principi attivi che contiene, tra cui acido tannico, polisaccaridi, glicosidi flavonoidi, ecc. Questi ingredienti possono promuovere la salute del cervello attraverso una varietà di percorsi.

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Possono anche produrre un insieme distinto di citochine, come IFN-, TNF- e IL-10, o chemochine, come MIP-1 e - e RANTES, che possono ulteriormente suscitare risposte immunitarie adattative (Spits et al., 2016). Insieme, le attività multifunzionali delle cellule NK aiutano a eliminare i bersagli sensibili e ad amplificare le risposte infiammatorie contro virus e tumori.

Essendo la modificazione post-trascrizionale più diffusa sull'mRNA dei mammiferi, la modificazione N6-metiladenosina (m6A) sta emergendo come un meccanismo di regolazione diffuso che controlla l'espressione genica in diversi processi fisiologici (Yue et al.,2015).

Tuttavia, il modo in cui la metilazione di m6A regola l'immunità cellulo-mediata innata e adattativa resta da comprendere appieno e, fino a questo rapporto, è rimasto sconosciuto nelle cellule NK.

Recentemente, è stato dimostrato che i recettori dell'antigene chimerico (CAR) reindirizzano le cellule NK verso le cellule tumorali che esprimono un antigene corrispondente, creando opportunità per combattere il cancro (Chenet al., 2016; Chu et al., 2014; Han et al., 2015; Liu et al. al., 2020; Tang et al., 2018; Yilmaz et al., 2020).

Pertanto, definire chiaramente il ruolo della modificazione di m6A nelle cellule NK non solo migliorerà notevolmente la nostra comprensione delle modificazioni dell'RNA come strato nuovo e critico di regolazione genica post-trascrizionale che controlla le funzioni delle cellule immunitarie innate, ma potrebbe anche fornirci una nuova opportunità per migliorare la funzione effettrice delle cellule NK e la sopravvivenza per il cancro. immunoterapia.

Le metiltransferasi m6A ("scrittori", ad esempio METTL3 e METTL14) e le demetilasi ("cancellatori", ad esempio la proteina associata alla massa grassa e all'obesità [FTO] e ALKBH5) controllano dinamicamente il panorama della metilazione di m6A (Shi et al., 2019).

Le proteine ​​lettrici di Them6A (proteine ​​della famiglia contenente il dominio YTH [YTHDF] YTHDF1, YTHDF2 e YTHDF3 e proteine ​​del fattore di crescita simile all'insulina 2 leganti l'mRNA [IGF2BP] IGF2BP1, IGF2BP2 e IGF2BP3) si legano preferenzialmente all'RNA metilato e mediano funzioni specifiche, tra cui promuovendo il traduttore che influenza la stabilità degli mRNA modificati da m6A (Huang et al.,2018; Shi et al., 2019; Wang et al., 2014; Wang et al., 2015).

Studi recenti hanno dimostrato che la metilazione di m6A è coinvolta nell'immunità mediata dalle cellule immunitarie innate e innate (Shulman e Stern-Ginossar, 2020). L'eliminazione della proteina m6Awriter METTL3 nelle cellule T di topo interrompe l'omeostasi e la differenziazione cellulare prendendo di mira il percorso IL-7/SOCS/STAT5 (Li et al., 2017). METTL3 mantiene le funzioni soppressive delle cellule T reg attraverso la segnalazione IL-2/STAT5 (Tong et al.,2018).

La metilazione dell'RNA m6A svolge un ruolo essenziale nello sviluppo precoce delle cellule B (Zheng et al., 2020). Un recente rapporto ha mostrato che la metilazione mRNA m6A mediata da METTL3- promuove l'attivazione delle cellule dendritiche (DC) (Wang et al., 2019a).

Gli mRNA modificati da m6A che codificano per catepsine lisosomiali possono essere riconosciuti da YTHDF1 nelle DC, sopprimendo così la capacità di priming incrociato delle DC e inibendo le risposte immunitarie antitumorali (Han et al., 2019).

Le modifiche di m6A controllano anche la risposta immunitaria innata all'infezione virale (Liu et al., 2019; Rubio et al.,2018; Winkler et al., 2019). Tuttavia, non è stato riportato se e come le modifiche di m6 influenzano la risposta immunitaria mediata dalle cellule NK alle cellule tumorali e ai virus. YTHDF2 è un lettore di m6A ben noto che agisce riconoscendo e legandosi specificamente agli RNA contenenti m6A e promuovendo la degradazione delle trascrizioni target (Wang et al., 2014).

Secondo il database di BioGPS (Wu et al., 2013) e i nostri dati preliminari, le cellule NK murine esprimono YTHDF2 ad un livello elevato, mentre il suo ruolo nella regolazione delle cellule NK è sconosciuto. Questo ci ha motivato a studiare YTHDF2 nelle cellule NK utilizzando un approccio di knockout condizionale.

Mostriamo che la deplezione di Ythdf2 nelle cellule mouseNK ha significativamente compromesso l'antitumorale e l'immunità antivirale delle cellule NK. Inoltre, YTHDF2 controllava l'omeostasi, la maturazione e la sopravvivenza delle cellule NK allo stato stazionario. Pertanto, le modifiche YTHDF2 o m6Am in generale svolgono ruoli sfaccettati nella regolazione delle cellule NK.

Risultati

YTHDF2 è sovraregolato nelle cellule NK murine da IL-15, infezione da CMV murino e progressione del tumore

Per studiare il ruolo delle modifiche di m6A nelle cellule NK, abbiamo prima esaminato i livelli di espressione di scrittori, cancellatori e lettori di m6A nelle cellule NK murine utilizzando il database BioGPS (http://biogps.org).

Di conseguenza, l'espressione dell'mRNA di Ythdf2 era la più alta tra gli altri enzimi e lettori m6A (Fig. 1 A). È interessante notare che abbiamo scoperto che le cellule NK hanno anche mRNA costitutivo ed espressione proteica di Ythdf2 a livelli elevati rispetto alla maggior parte delle altre cellule immunitarie, comprese le cellule B. , macrofagi e DC (Fig. 1 B e Fig. S1 A).

Le cellule NK possono essere attivate dall'IL-15, che è un regolatore chiave dell'omeostasi e della sopravvivenza delle cellule NK (Becknell e Caligiuri, 2005). Sfruttando il database Gene Expression Omnibus (GEO), abbiamo scoperto che le cellule NK attivate da IL-15 hanno livelli di mRNA di Ythdf2 più elevati rispetto ad altri enzimi e lettori m6A che abbiamo testato (Fig. 1 C; analizzato da GEO con accesso n. GSE106138).

Coerentemente con la nostra analisi dei dati GEO, la nostra PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) e l'immunoblotting hanno mostrato che l'attivazione di IL-15 delle cellule NK sovraregolava significativamente Ythdf2 sia a livello di mRNA che di proteina e che Ythdf2 aveva un livello di espressione molto elevato in IL{ Cellule NK attivate da {4}} rispetto ad altri enzimi e lettori m6A che abbiamo testato (Fig. 1, D – F; e Fig. S1 B).

I livelli proteici di YTHDF2 erano anche significativamente sovraregolati nelle cellule NK di topi transgenici (Tg) IL-15 che avevamo precedentemente generato rispetto ai controlli WT (Fig. S1 C; Fehniger et al., 2001). Le cellule NK sono fondamentali mediatori dell'immunità dell'ospite contro infezioni virali e neoplasie (Spits et al., 2016). Abbiamo quindi valutato il pattern di espressione di YTHDF2 nelle cellule NK durante l'infezione murina da CMV (MCMV).

Utilizzando il database GEO, abbiamo scoperto che Ythdf2 era sovraregolato al giorno 1,5 dopo l'infezione in due database indipendenti (Fig. 1 G e Fig. S1 D). Un test di immunoblotting ha confermato che anche i livelli proteici di YTHDF2 erano sovraregolati al giorno 1,5 dopo l'infezione con MCMV (Fig.S1 E), indicando che YTHDF2 può svolgere un ruolo critico nell'immunità antivirale mediata dalle cellule NK.

Oltre a controllare l’infezione virale, le cellule NK contribuiscono all’immunosorveglianza antitumorale. Abbiamo quindi esaminato i livelli di Ythdf2 durante lo sviluppo del tumore. Utilizzando il modello di metastasi del melanoma B16F10, abbiamo riscontrato una riduzione delle cellule NK nel polmone nella fase avanzata dello sviluppo del tumore (Fig. S1 F), che è coerente con un rapporto precedente (Cong et al., 2018).

Abbiamo scoperto che i livelli di mRNA e proteina di Ythdf2 erano significativamente sovraregolati nelle cellule NK nella fase iniziale dello sviluppo del tumore (Fig. 1 H e Fig. S1 G). Nel loro insieme, questi dati dimostrano che YTHDF2 è altamente espresso nelle cellule NK ed è sovraregolato durante l'infezione virale e la tumorigenesi, portandoci a ipotizzare che YTHDF2 svolga un ruolo nella regolazione della difesa delle cellule NK contro la tumorigenesi e l'infezione virale.

Il deficit di YTHDF2 compromette l'immunità antitumorale delle cellule NK

Per definire il ruolo di YTHDF2 nell'antitumorale mediata dalle cellule NK, abbiamo prima generato topi floxati Ythdf2 (Fig. S1, H e I). Abbiamo quindi generato topi knockout condizionali specifici delle cellule NK (di seguito denominati topi Ythdf2ΔNK) incrociando topi Ythdf2fl/fl con topi Ncr1-iCre (Narni-Mancinelli et al., 2011). La delezione di Ythdf2 nelle cellule NK è stata verificata mediante qPCR e immunoblotting (Fig. S1, J e K).

Abbiamo quindi creato un modello di melanoma metastatico mediante iniezione endovenosa di cellule B16F10 nei topi Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK. Come mostrato nella Figura 2 A, i topi Ythdf2ΔNK hanno mostrato un carico molto maggiore di noduli metastatici rispetto a quello dei topi Ythdf2WT.

Abbiamo riscontrato una riduzione significativa della percentuale e del numero assoluto di cellule NK infiltranti nei tessuti tumorali dei topi Ythdf2ΔNK rispetto a quelli osservati nei topi Ythdf2WT (Fig. 2, B e C). Nel frattempo, le cellule NK infiltrate dai topi Ythdf2ΔNK hanno mostrato una diminuzione significativa nell'espressione di IFN-, granzima B e perforina rispetto a quelle dei topi Ythdf2WT (Fig. 2, D-F).

Tuttavia, le percentuali di cellule T CD4+ e cellule T CD8+ e la loro espressione di IFN- erano comparabili tra i topi Ythdf2WT e i topi Ythdf2ΔNK (Fig. S1, L–O), suggerendo che YTHDF2 nelle cellule NK è essenziale per controllare le metastasi tumorali.

Per confermare il requisito intrinseco cellulare di YTHDF2 per l'immunità antitumorale mediata dalle cellule NK, abbiamo trasferito adottivamente un numero uguale di cellule NK da topi Ythdf2ΔNK o topi Ythdf2WT a topi Rag2−/−Il2rg−/−, che mancano di cellule T, B e NK , 1 giorno prima di un'iniezione di cellule tumorali B16F10 (Fig. 2 G). Abbiamo riscontrato un'incidenza significativamente maggiore di metastasi tumorali nei topi trasferiti con cellule NK Ythdf2ΔNK rispetto ai topi iniettati con cellule NK Ythdf2WT (Fig. 2 G).

Allo stesso modo, in questo modello, abbiamo anche riscontrato una riduzione significativa della percentuale e del numero assoluto di cellule NK Ythdf2ΔNK infiltrate (Fig. 2, H e I), nonché una diminuzione dell'espressione di IFN-, granzima B e perforina nei topi che hanno ricevuto in modo adottivo cellule NK Ythdf2ΔNK trasferite rispetto a quelle che hanno ricevuto cellule NK Ythdf2WT (Fig. 2, J-L). Questi dati indicano un ruolo intrinseco cellulare di YTHDF2 nella regolazione dell'immunità antitumorale delle cellule NK.

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