Il lettore RNA M6 A YTHDF2 controlla l'immunità antitumorale e antivirale delle cellule NK Parte 6

Modello di melanoma metastatico e sfida MCMV

Le cellule B16F10 (105) sono state iniettate iv nei topi. 14 giorni dopo l'iniezione, i topi sono stati soppressi per l'analisi post-mortem. I noduli metastatici nel polmone sono stati analizzati macroscopicamente e contati. La linea cellulare B16F10 è stata fornita da Hua Yu (City ofHope, Los Angeles, CA). I topi Ythdf2ΔNK e Ythdf2WT sono stati infettati con un'iniezione ip del ceppo Smith MCMV (2,5 × 104 PFU), acquistato dall'American Type Culture Collection (VR-1399). I campioni di sangue periferico sono stati ottenuti tramite puntura sottomandibolare nei giorni 0, 4 e 7 dopo l'infezione.

I noduli di metastasi polmonari si riferiscono a noduli formati da cellule tumorali maligne provenienti da altri siti che migrano ai polmoni attraverso il sangue o il sistema linfatico. Per molti pazienti, questa è una manifestazione comune del cancro ai polmoni.

Tuttavia, sebbene i noduli metastatici polmonari rappresentino una minaccia per la salute fisica dei pazienti, non esiste una relazione diretta tra essi e la memoria. Pertanto, dovremmo affrontare attivamente le sfide del cancro ai polmoni e dei noduli metastatici polmonari e non lasciare che le emozioni negative e l’ansia influenzino la nostra salute fisica e mentale.

Allo stesso tempo, possiamo mantenere e migliorare la memoria attraverso alcuni metodi positivi. Ad esempio, eseguire alcuni esercizi di memoria, come calcoli matematici, leggere, ascoltare musica, giocare, ecc. Inoltre, aderire a buone abitudini di vita, come fare esercizio fisico regolare, dormire a sufficienza, mangiare sano, ecc., può anche migliorare la nostra memoria.

La cosa più importante è mantenere un atteggiamento positivo. Non importa quali difficoltà affronti, devi credere nella tua forza e nella flessibilità del tuo sistema nervoso e, attraverso adattamenti e risposte positive, alla fine supererai con successo le difficoltà.

In breve, anche se i noduli metastatici nei polmoni rappresentano una minaccia per la salute fisica, non sono direttamente correlati alla memoria. Dovremmo affrontarlo in modo positivo e mantenere e migliorare la nostra memoria adattando il nostro stile di vita e mantenendo un buon atteggiamento. Si può vedere che abbiamo bisogno di migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come ad esempio aumentare i livelli di acetilcolina e i fattori di crescita. Queste sostanze sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, Cistanche deserticola può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l’apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello riceva nutrienti ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello. Si può vedere che abbiamo bisogno di migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come ad esempio aumentare i livelli di acetilcolina e i fattori di crescita. Queste sostanze sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, Cistanche deserticola può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l’apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello riceva nutrienti ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello.

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Per misurare le cariche virali nel sangue periferico, nella milza e nel fegato, il DNA è stato isolato utilizzando un kit QIAGEN DNeasy Blood and Tissue Kit per l'analisi qPCR. Sono stati utilizzati i seguenti primer: MCMV-IE1,59-AGCCACCAACATTGACCACGCAC-39 (avanti) e MCMVIE1, ​​59-GCCCCAACCAGGACACACAACTC-39 (retro).

Trattamento in vivo nei topi con IL-15

Per il trattamento in vivo sui topi con IL-15, i topi Ythdf2ΔNK e Ythdf2WT sono stati iniettati con 2 µg ip di IL-15 umana ricombinante (cat. n. 745101; National Cancer Institute) per 5 giorni. I topi trattati e quelli di controllo sono stati poi sottoposti ad eutanasia per un'analisi citometrica a flusso.

Citometria a flusso

Le sospensioni unicellulari sono state preparate da midollo osseo, sangue, milza, fegato e polmone di topi Ythdf2ΔNK e Ythdf2WT come descritto in precedenza (Wang et al., 2018b). L'analisi della citometria a flusso e l'ordinamento delle cellule sono stati eseguiti rispettivamente su un citometro a flusso LSRFortessa X-20 e un FACSAriaFusion Flow Cytometer (BD Biosciences).

I dati sono stati analizzati utilizzando il software NovoExpress (Agilent Technologies).

Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi marcati con colorante fluorescente di BD Biosciences, BioLegend, Invitrogen o Cell Signaling Technology: CD3ε (145-2C11), CD19 (1D3), Gr-1 (RB6-8C5 ),TER-119 (TER-119), CD11c (N418), CD4 (GK1.5), CD8 (53-6.7),CD122 (5H4), CD132 (TUGm2), NK1.1 (PK136), CD11b (M1/70),CD27 (LG.3A10), CD117 (2B8), CD127 (SB/199), CD135 (A2F10.1),KLRG1 (2F1), CD45 ({{46 }}F11), CD45.1 (A20), CD45.2 (104), IFN- (XMG1.2), 2B4 (m2B4), granzima B (QA16A02), perforina(S16009A), Ly49H (3D10), Ly49D ( 4e5), CD69 (H1.2F3), CD226(TX42.1), NKG2D (CX5), NKG2A (16A11), NKp46 (29A1.4), TIGIT(1G9), PD-1 (J43), annessina V, Ki67 (b56), Tbet (4b10) e Eomes (WD1928), fosfo-p44/42 Erk1/2 (Thr202/Tyr204, #9101), fosfo-Akt (Ser473, #5315), proteina ribosomiale fosfo-S6 ,fosfo-Stat3 (Tyr705, #9145) e fosfo-Stat5 (Tyr694,#9539).

Per la valutazione della proliferazione delle cellule NK, le cellule sono state etichettate con 5 µM CTV (Invitrogen) secondo il protocollo del produttore prima di trasferirle nei topi riceventi. La colorazione intracellulare di Ki67, Tbet ed Eomes è stata eseguita fissando e permeabilizzando con il kit Foxp3/Transcription Factor Staining (eBioscience).

Per il rilevamento delle proteine ​​fosforilate, le cellule NK spleniche purificate sono state pretrattate con IL umana ricombinante -15 (50 ng/ml) per 1 ora e quindi fissate con Phosflow Fix Buffer I, seguite da permeabilizzazione con Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) e colorazione con anticorpi.

Trasferimento cellulare adottivo

Per valutare l'effetto del deficit di Ythdf2 sulla maturazione delle cellule NK, una miscela di cellule 5 × 106 BM con un rapporto 1:1 da topi CD45.1 o Ythdf2ΔNK CD45.2 è stata cotrasferita in topi Rag2−/−Il2rg−/−. La ricostituzione dei riceventi è stata valutata mediante citometria a flusso 8 settimane dopo il trapianto.

Per gli esperimenti di proliferazione omeostatica indotta da linfopenia, un numero uguale di cellule NK spleniche purificate da topi CD45.1 o Ythdf2ΔNK CD45.2 è stato cotrasferito in topi Rag2−/−Il2rg−/− seguito dalla valutazione delle percentuali relative di cellule NK WT e Ythdf2ΔNK trasferite nella milza di destinatari Rag2−/−Il2rg−/− mediante citometria a flusso nei punti temporali indicati.

Per il modello di melanoma metastatico, 106 cellule NK espanse con IL-2 da topi Ythdf2ΔNK o Ythdf2WT sono state iniettate iv in topi Rag2−/−Il2rg−/−. 1 giorno dopo, le cellule B16F10 (105) sono state iniettate iv nei topi. 14 giorni dopo l'iniezione, i topi sono stati soppressi per l'analisi post-mortem. In alcuni esperimenti, le cellule sono state marcate con CTV (5 µM, Invitrogen) per tracciare la proliferazione cellulare prima del trasferimento.

Saggio di traffico in vivo

Per rilevare il traffico di cellule NK dal midollo osseo al sangue periferico, 1 µg di anticorpo anti-CD45 marcato con APC iv è stato iniettato nei topi C57BL/6. Due minuti dopo l'iniezione dell'anticorpo, i topi sono stati sottoposti ad eutanasia immediatamente e le cellule BM sono state raccolte per la citometria a flusso dopo che le cellule sono state colorate con anticorpi CD3 e NK1.1. Le cellule NK parenchimali sono state identificate dalla mancanza di colorazione CD45, mentre le cellule NK sinusoidali sono state identificate dalla presenza della marcatura CD45. Pertanto, il rapporto tra cellule NK nei sinusoidi (CD45+) e quelle nelle regioni parenchimali (CD45−) indica il traffico di cellule NK dal sangue midollare alla periferia in uno stato stazionario.

RT-qPCR in tempo reale e immunoblotting

L'RNA è stato isolato utilizzando un RNeasy Mini Kit (QIAGEN) e quindi trascritto al contrario in cDNA con PrimeScript RT Reagent Kit con gDNA Eraser (Takara Bio) secondo le istruzioni del produttore. I livelli di espressione dell'mRNA sono stati analizzati utilizzando SYBRGreen PCR Master Mix e un sistema QuantStudio 12K Flex Real-TimePCR (entrambi di Thermo Fisher Scientific). Le sequenze di primer sono elencate nella Tabella S1.

L'immunoblotting è stato eseguito secondo procedure standard, come precedentemente descritto (Denget al., 2015; Yu et al., 2006). Sono stati utilizzati i seguenti anticorpi: METTL3 (cat. n. 15073-1-AP; Proteintech), METTL14 (cat. n. 26158-1-AP; Proteintech), YTHDF1 (cat. n. 17479-1-AP ; Proteintech), YTHDF2 (cat. n. RN123PW; MBL), YTHDF3 (cat. n.25537-1-AP; Proteintech), ALKBH5 (cat. n. ab195377; Abcam),FTO (cat. n. ab124892; Abcam), MDM2 (n. cat. 33-7100; Invitrogen), TDP-43 (n. cat. PA5-29949; Invitrogen) e -actin (n. cat. {{20 }}Ig; Proteintech).

Saggio di knockdown del siRNA

IL-2–expanded NK cells were transfected with Accell mouse Tardbp siRNA (cat. no. E-040078-00-0005; Dharmacon) or Mdm2 siRNA (cat. no. E-041098-00-0005; Dharmacon) using Accell delivery media (Dharmacon) according to the manufacturer's instructions in the presence of IL-15 (50 ng/ml). The Accell eGFP control pool was used as siRNA control. The transfection efficiency was >90% misurato mediante citometria a flusso. L'efficienza del geneknockdown è stata determinata mediante qPCR e immunoblotting. 3 giorni dopo la trasfezione, l'apoptosi cellulare e la proliferazione sono state analizzate mediante citometria a flusso come descritto sopra.

Saggio reporter della luciferasi

La regione del promotore Ythdf2 che va da –2,000 bp a +100 bp del TSS è stata amplificata da cellule NK murine e clonata in apGL4-Basic Luciferase Reporter Vector (Promega) per generare apGL{ {5}}plasmide reporter Ythdf2. Le cellule HEK293T acquistate dall'ATCC sono state cotrasfettate con i plasmidi reporter pGL4-Ythdf2, nonché con plasmidi di sovraespressione STAT5a o STAT5b o un vettore vuoto, insieme a un plasmide reporter pRL-TK Renilla (Promega) per la normalizzazione dell'efficienza di trasfezione. Le cellule sono state raccolte per la lisi 24 ore dopo la trasfezione e l'attività della luciferasi è stata quantificata fluorimetricamente con il Dual-Luciferase System (Promega). Le sequenze di primer per la clonazione del promotore Ythdf2 e dei plasmidi di sovraespressione STAT5a e STAT5b sono elencate nella Tabella S1.

Saggi ChIP

I test ChIP sono stati eseguiti utilizzando un kit Pierce Magnetic ChIP (cat. n. 26157; Thermo Fisher Scientific) secondo le istruzioni del produttore. In breve, una quantità uguale di ananti-anti-fosfo-Stat5 (Tyr694, cat. No. 9351; Cell Signaling Technologies) o corrispondente controllo IgG di coniglio normale è stata utilizzata separatamente per precipitare i complessi DNA-proteina reticolati derivati ​​da 5 × 106 cellule NK primarie di topo purificate che sono state pretrattate con IL-15 (50 ng/ml) per 1 ora. Dopo l'inversione della reticolazione, il DNA immunoprecipitato dall'anticorpo indicato è stato testato mediante qPCR. Le sequenze di tutti i primer sono elencate nella Tabella S1.

Saggio di citotossicità ex vivo

La citotossicità ex vivo delle cellule NK è stata valutata mediante test standard di rilascio del 51Cr. Come cellule bersaglio sono state utilizzate le linee cellulari di linfoma murino RMA-S (classe MHC Ideficiente) e cellule RMA (classe MHC I sufficiente), un dono di Andre´Veillette (McGill University, Montreal, Canada). I topi sono stati trattati con iniezione ip di acido poliinosinico: policitidilico [poli (I: C); 200 µg/topi] per 18 ore. Le cellule NK attivate da poli(I:C) sono state isolate dalla milza utilizzando il kit di isolamento delle cellule NK EasySepMouse (STEMCELL Technologies). Le cellule NK purificate sono state coltivate in cocoltura con cellule bersaglio in un rapporto di 5:1, 2,5:1 e 1,25:1 in presenza di IL-2 (50 U/ml).

m6A-seq

Le cellule NK spleniche purificate sono state espanse con IL-2 (1,000 U/ml, n. cat. Bulk Ro 23-6019; National Cancer Institute) in vitro per 7 giorni. L'RNA totale è stato isolato mediante il reagente TRIzol (Thermo FisherScientific) da 50 milioni di cellule NK espanse con IL-2. L'RNA poliadenilato è stato ulteriormente arricchito dall'RNA totale utilizzando il kit di purificazione dell'mRNA Dynabeads (Invitrogen). I campioni di mRNA sono stati frammentati in frammenti lunghi 100-nt con reagenti di frammentazione dell'RNA (Invitrogen).

L'mRNA frammentato (5 µgmRNA) è stato utilizzato per l'immunoprecipitazione di m6A utilizzando un anticorpo m6A (202003; Synaptic) seguendo il protocollo standard del kit Magna MeRIP m6A (Merck Millipore). L'RNA è stato arricchito tramite RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research) per la generazione di librerie con un KAPA RNA HyperPrep Kit (Roche). Il sequenziamento è stato eseguito presso la struttura genomica di City of Hope su una macchina Illumina HiSeq 2500 con modalità a lettura singola 50-bp. Le letture di sequenziamento sono state mappate sul genoma del mouse utilizzando il software HISAT2 v101 (Kim et al., 2015).

Le letture mappate di immunoprecipitazione e le librerie di input sono state fornite utilizzando il pacchetto R exomePeak (Meng et al., 2014). m6Apeaks sono stati visualizzati utilizzando il software Integrative Genomics Viewer (http://www.igv.org). Il motivo di legame m6A è stato analizzato da MEME (https://meme-suite.org) e HOMER (http://homer.ucsd.edu/homer/motif). I picchi chiamati sono stati annotati mediante intersezione con l'architettura genetica utilizzando Rpackage ChIPseeker (Yu et al., 2015).

StringTie was used to assess expression levels for mRNAs from input libraries by calculating the total exon fragments/mapped reads in millions × exon length in kb (Pertea et al., 2015). The differentially expressed mRNAs were selected with log2(fold change) >1 orlog2(cambio piega)<−1 and P < 0.05 using the R package edgeR (Robinson et al., 2010).

YTHDF2 RIP-seq

50 milioni di cellule NK espanse con IL-2 sono state raccolte e lavate due volte con PBS freddo, e il pellet cellulare è stato lisato con 2 volumi di tampone di lisi (Hepes 10 mM, pH 7,6, 150 mM KCl, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5 mM ditiotreitolo, cocktail di inibitori della proteasi 1:100 [Thermo Fisher Scientific] e 400 U/ml di inibitore della RNasi SUPERase-In [Thermo Fisher Scientific]).

Il lisato è stato incubato su ghiaccio per 5 minuti e centrifugato per 15 minuti per eliminare il lisato. Un decimo del volume del lisato cellulare è stato salvato come input. Il resto del lisato cellulare è stato incubato con 5 µg di anti-YTHDF2 (cat. n. RN123PW; MBL) accoppiato con sfere magnetiche di proteina A (cat. n. 10001D; Invitrogen) a 4 gradi per 2 ore con rotazione delicata. Successivamente, le sfere sono state lavate cinque volte con 1 ml di tampone di lavaggio ghiacciato (HEPES 50 mM, pH 7,6,200 mM NaCl, EDTA 2 mM, 0,05% NP-40, ditiotreitolo 0,5 mM e RNasi 200 U/ml inibitore).

I campioni immunoprecipitati sono stati sottoposti a digestione con proteinasi K in tampone di lavaggio integrato con 1% SDS e 2 mg/ml di proteinasi K (ThermoFisher Scientific) incubati con agitazione a 1.200 giri/min a 55 gradi per 1 ora. L'RNA totale è stato estratto sia dall'RNA input che da quello immunoprecipitato aggiungendo il reagente TRIzol a 5 volumi seguito da Direct-zol RNA Miniprep (Zymo Research).

La libreria di cDNA è stata generata con un kit KAPA RNA HyperPrep (Roche) e sequenziata su una piattaforma Illumina HiSeq 2500. I risultati dell'identificazione dei picchi con immunoprecipitazione e librerie di input sono stati generati dal pacchetto R RIPSeeker (Li et al., 2013). HOMER è stato utilizzato per trovare motivi della distribuzione dei dati nelle regioni dei picchi. I cosiddetti picchi sono stati annotati mediante intersezione con l'architettura del gene e della trascrizione utilizzando ChIPpeakAnno (Zhu et al., 2010).

Saggio di stabilità dell'mRNA

Cellule NK spleniche purificate provenienti da topi Ythdf2ΔNK e Ythdf2WT sono state coltivate con IL-15 (50 ng/ml). 3 giorni dopo la coltura, le cellule sono state trattate con actinomicina D (5 µg/ml, n. cat. A9415; Sigma) per il tempo indicato. Le cellule senza trattamento sono state utilizzate a 0 ore. Le cellule sono state raccolte al momento indicato e l'RNA totale è stato estratto dalle cellule per qPCR. L'emivita dell'mRNA è stata calcolata utilizzando il metodo precedentemente descritto da Weng et al.(2018). Le sequenze di primer sono elencate nella Tabella S1.

Analisi di database on-line

Abbiamo utilizzato la risorsa online BioGPS (http://biogps.org) per analizzare l'espressione tessuto-specifica di Ythdf2. I set di RNA-seqdata provenivano da GEO con i nn. GSE106138,GSE113214 e GSE25672. Sono stati esportati dati normalizzati dalle analisi RNA-seq e il punteggio z dell'espressione genica è stato visualizzato con la funzione Heatmap.2 all'interno della libreria gplots R

Statistiche

I test t di Student non accoppiati (a due code) sono stati eseguiti utilizzando il software GraphPad Prism. L'ANOVA unidirezionale o bidirezionale è stata eseguita quando tre o più gruppi indipendenti sono stati confrontati. I valori P sono stati aggiustati per confronti multipli utilizzando la procedura Holm-Sˇ´ıdak. P < 0.05 è stato considerato significativo. *, P < {{10}}.05; **, P<0,01; e ***, P < 0,001.

Materiale supplementare on-line

La Fig. S1 mostra i livelli proteici di YTHDF2 nelle cellule immunitarie, comprese le cellule NK in risposta alla stimolazione di IL-15, all'infezione da MCMV e alla progressione del tumore; la generazione di topi con delezione specifica di Ythdf2 per cellule NK. La Fig. S2 mostra i titoli virali nella milza e nel fegato di topi infettati con MCMV e la percentuale e il numero assoluto di cellule NK Ly49H+ e/o Ly49D+ nei topi infettati con MCMV. La Fig. S3 mostra la proliferazione, la sopravvivenza, la maturazione e l'espressione dei recettori attivanti e inibitori delle cellule NK dei topi Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK. La Fig.S4 mostra la regolazione dell'espressione YTHDF2 mediante la segnalazione IL-15-STAT5 e l'espressione dei componenti dei recettori IL-15, la via PI3K-AKT e la via MEK-ERK nelle cellule NK di Ythdf2WT e Ythdf2ΔNK topi. La Fig. S5 mostra test RNA-seq, m6A-seq e RIP-seq a livello di trascrittoma nelle cellule NK. La tabella S1 elenca i primer utilizzati nello studio.

Disponibilità dei dati

I dati RNA-seq, m6A-seq e RIP-seq sono stati depositati presso il National Center for Biotechnology Information GEO con il n. GSE174027. I restanti dati che supportano i risultati di questo studio sono disponibili su richiesta presso gli autori corrispondenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health (NS106170, AI129582, CA247550, CA163205, CA223400, CA068458 e CA210087), dalla Leukemia and Lymphoma Society (1364-19), dal California Institute for Regenerative Medicine (DISC2COVID{{ 9}}) e il premio per il progetto eccezionale 2021 della Breast Cancer Alliance. Questo lavoro è stato anche parzialmente sostenuto da un premio USDA (USDA/NIFA 2020-67017-30843).

Contributi degli autori: S. Ma, J. Yu e MA Caligiu hanno ideato e progettato il progetto. S. Ma, J. Yan, J. Zhang e J. Yu ha eseguito esperimenti e/o analisi dei dati. Z. Chen, L.-S.Wang, JC Sun e J. Chen hanno contribuito con reagenti e supporto materiale. S. Ma, J. Yu, J. Chen e MA Caligiuri hanno scritto, rivisto e/o rivisto l'articolo. Tutti gli autori hanno discusso i risultati e commentato il manoscritto.

Divulgazioni: J. Chen ha segnalato "altro" da Genovel BiotechCorp. al di fuori del lavoro presentato ed è uno dei fondatori scientifici di Genovel Biotech Corp. e un consulente scientifico di oncologia razziale. Non sono state riportate altre informazioni.

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