Test TUNEL: un potente strumento per la valutazione delle lesioni renali

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Astratto:Il test TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labelling) è un test di lunga data utilizzato per rilevare la frammentazione del DNA associata alla morte cellulare (terminali del DNA 3'-OH) da parte delle endonucleasi. Poiché questi enzimi sono particolarmente attivi nel rene, TUNEL è ampiamente utilizzato per identificare e quantificare la frammentazione del DNA e la morte cellulare in colturerene cellule e reni animali e umani risultanti daldanno tossico o ipossico. La prima caratterizzazione di TUNEL come test apoptotico ha portato a numerose interpretazioni errate dei meccanismi dicellula renale lesione.Tuttavia, TUNEL sta diventando sempre più popolare perdanno renalevalutazione perché può essere utilizzato universalmente nelle cellule in coltura e nei tessuti e per tutti i meccanismi di morte cellulare. Inoltre, è sensibile, accurato, quantitativo, facilmente collegato a particolari cellule o compartimenti di tessuto e può essere combinato con l'immunoistochimica per consentire l'identificazione affidabile dei tipi cellulari o dei probabili meccanismi di morte cellulare. Tradizionalmente, l'analisi TUNEL è stata limitata alla presenza o assenza di un segnale TUNEL. Tuttavia, ulteriori informazioni sul meccanismo di morte cellulare possono essere ottenute dall'analisi dei pattern TUNEL.

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introduzione Il DNA è l'unica molecola nella cellula che può essere riparata, ma non può essere risintesi completamente dopo il danno. La distruzione del DNA è una delle fasi finali di un processo di morte cellulare in più fasi, che è potenzialmente reversibile fino al punto di frammentazione del DNA terminale. Pertanto, quest'ultimo è un attributo comune e un marker meccanicistico di morte cellulare irreversibile [1,2]. La frammentazione del DNA associata alla morte cellulare è solitamente "visualizzata" dal test di marcatura terminale della desossinucleotidil transferasi dUTP nick-end (TUNEL), dal DNA laddering o dal test della cometa [3]. L'elettroforesi a campo di impulso [4] e il saggio di sintesi casuale di oligonucleotidi (ROPS) [5] sono altri due saggi secondari usati raramente. L'uso del test della cometa è limitato al solo in vitro (cellule in coltura) e la sua quantificazione è laboriosa [6]. È possibile eseguire saggi di comete in nuclei cellulari isolati, ma è associato a fattori confondenti aggiuntivi durante l'isolamento dei nuclei. Il secondo, il test di scala del DNA, non è un metodo quantitativo e la speranza iniziale che il pattern ladder rispetto allo striscio distinguesse rispettivamente tra apoptosi e necrosi, è stata dissipata poiché questo approccio si è rivelato inaffidabile [7]. Dei tre metodi principali, TUNEL è il più sensibile, il meno dispendioso in termini di tempo e il più universalmente applicabile. Può essere utilizzato in cellule e tessuti in coltura e per tutti i meccanismi di morte cellulare. È accurato, quantitativo, facilmente collegato a particolari cellule o compartimenti di tessuto e può essere combinato con l'immunoistochimica per consentire l'identificazione affidabile dei tipi cellulari o dei meccanismi di danno cellulare associati ai segnali TUNEL-positivi [2].

Le rotture del DNA misurabili da TUNEL sono prodotte principalmente da endonucleasi apoptotiche. Le endonucleasi più attive nel rene sono la desossiribonucleasi 1 (DNasi I) e l'endonucleasi G (EndoG) [8-10]. La DNasi I è l'endonucleasi apoptotica più attiva e abbondante nei mammiferi [11]. Il rene, le ghiandole salivari, il pancreas e l'intestino sono organi noti per produrre elevate quantità di DNasi I. Le cellule epiteliali nelle ghiandole salivari, nel pancreas e nell'intestino secernono la DNasi I come enzima digestivo nel tratto digerente. Alcune DNasi cellulari I combattono contro il DNA "estraneo" che invade le cellule ospiti [12]. La DNasi I non secreta presenta un pericolo nascosto per il DNA della cellula ospite, ma normalmente le DNasi non agiscono sul DNA della cellula ospite fino alla lesione o alla morte della cellula. Nel rene, la DNasi I è secreta dalle cellule epiteliali tubulari, presumibilmente per distruggere virus e batteri nelle urine. Questa funzione probabilmente ha luogo in combinazione con le proteinasi, in particolare la meprin, che è la principale proteinasi nelle urine [13]. Sebbene sia protettivo contro le infezioni, la presenza di DNasi altamente attiva nel rene rende questo organo vulnerabile alle lesioni, dove l'attività della DNasi è nota per essere citotossica per le cellule ospiti. Le DNasi promuovono la morte cellulare indotta da stimoli tossici o ipossici e distruggono tutte le cellule del DNA del rene dell'ospite rilasciate a seguito della morte cellulare.

Renisono organi filtranti che rimuovono i composti tossici dal corpo. L'elevata attività della DNasi I nei reni rende le cellule renali molto sensibili alle lesioni da composti tossici e dai loro prodotti metabolici. Ciò rende TUNEL il metodo più appropriato e applicabile per misurare le lesioni renali. In questa recensione, ci concentreremo su TUNEL come test ampiamente utilizzato, informativo e preciso per la misurazione della morte cellulare e del danno tissutale nel rene. Discuteremo gli aspetti di TUNEL in quanto si applica a malattie e lesioni renali e identificheremo le qualità, le tecniche e le caratteristiche sottoutilizzate di TUNEL per promuovere l'uso produttivo e appropriato di questo potente test nella ricerca, nella diagnostica e nella terapia delle malattie renali. Discuteremo anche vari modelli di immagine TUNEL che possono essere collegati ai meccanismi di morte cellulare. I punti sollevati in questa recensione sono ampiamente applicabili per l'uso di TUNEL in organi diversi dal rene.

Parole chiave:TUNEL; morte cellulare; rene; DNasi; endonucleasi; lesione tissutale

Principi TUNELIl test TUNEL è stato sviluppato nel 1992 da Gorczyca et al. [14] e Gavrieli et al. [15], utilizzando rispettivamente l'etichettatura del fluorocromo e dell'avidina-perossidasi. A quel tempo, c'era un disperato bisogno di nuovi metodi per valutare l'apoptosi e TUNEL ha colmato con successo questa lacuna. Inizialmente commercializzato come test per le rotture del filamento di DNA durante o associato all'apoptosi [14,16], in assenza di test migliori, TUNEL è diventato rapidamente il test standard per l'apoptosi [17,18]. Tuttavia, è stato riconosciuto quasi immediatamente dai ricercatori che TUNEL ha misurato indiscriminatamente qualsiasi frammentazione del DNA, non solo quella associata all'apoptosi [19-21]. Tuttavia, la necessità di test apoptotici era così grande che le rare segnalazioni di TUNEL non specifiche per l'apoptosi sono state generalmente ignorate. Ciò ha portato a un'enorme quantità di segnalazioni di falsi positivi di apoptosi nel rene e in altri organi, al punto che fino al 20 percento delle cellule totali sono state riportate apoptotiche anche senza lesioni [22-25] quando un minimo dello 0,01 percento potrebbe essere un'evidenza statisticamente significativa di danno tissutale.

Il test TUNEL ha vissuto una rinascita negli ultimi anni dalla fine del boom degli studi sull'apoptosi alcuni anni fa. La nostra ricerca PubMed di articoli di riviste che coinvolgono termini "rene" e "TUNEL" ha prodotto oltre 1500 risultati dal 1992 al 2020. Nel 2019 sono stati pubblicati 170 articoli, il numero più alto in un solo anno negli ultimi 28 anni (Figura S1) e che costituiscono la maggior parte degli articoli esaminati per questa recensione. Numerosi studi hanno utilizzato la positività al TUNEL come misura universale della morte cellulare associata alla frammentazione del DNA in altri tipi di morte cellulare oltre all'apoptosi. Ad esempio, la ferroptosi, una forma recentemente scoperta di morte cellulare programmata e non apoptotica innescata dal danno ossidativo che si verifica durante l'ischemia-riperfusione renale (IR) nei topi, può essere rilevata da TUNEL [26]. La pirotosi, che è una forma infiammatoria di morte cellulare programmata distinta dall'apoptosi e dalla necrosi, è associata a segnali TUNEL-positivi [27,28]. La positività al TUNEL è stata osservata durante la necroptosi che ha contribuito alla progressiva deplezione delle cellule dei tubuli renali nei ratti sottoposti a nefrectomia subtotale [29]. Nel rene e in altri tessuti, segnali TUNEL positivi sono stati trovati in necrosi [30,31], autofagia disregolata [32-35], anoikis [36,37], catastrofe mitotica [35,38], autolisi [39], pautolisi [39], proptosi [40] e aponeurosi [30], dimostrando che TUNEL è un test veramente universale per la morte cellulare irreversibile.

Il test TUNEL si basa sull'etichettatura delle estremità 3'OH da parte di un enzima del DNA specifico dell'estremità 3'OH, la deossinucleotidil transferasi terminale (TdT) (Figura). L'uso della DNA polimerasi o del frammento di Klenow DNA polimerasi al posto del TdT può aiutare a determinare il tipo di estremità 3'OH (intaccature, spazi vuoti o oligo sporgenti) perché le DNA polimerasi hanno bisogno di uno stampo (il filamento di DNA opposto) e quindi non etichetteranno estremità del DNA sospese o sporgenti. È importante ricordare che la produzione delle estremità del DNA 3ZOH non è esclusiva delle endonucleasi apoptotiche (degradanti del DNA). Le estremità del DNA 3'OH sono un importante segnale "comunicatore", un denominatore comune della maggior parte degli enzimi del DNA. Sono prodotti e utilizzati da quasi tutti gli enzimi del DNA negli eucarioti, comprese le endonucleasi di riparazione del DNA (apuriniche/apirimidiniche, AP), le esonucleasi, le DNA polimerasi, le DNA ligasi, le DNA transferasi e le topoisomerasi. Inoltre, i coniugati 3'Id 3z-zucchero o 3z-proteina possono essere convertiti in termini 3'OH rispettivamente da fosfatasi, glicosilasi e proteinasi. Questo è il motivo per cui è necessaria una comprensione precisa di ciò che viene misurato per l'applicazione di successo di TUNEL e l'interpretazione dei suoi risultati.

Rispetto ad altri due metodi primari di misurazione della frammentazione del DNA, la scala del DNA e il test della cometa, TUNEL ha il vantaggio di essere basato sull'identificazione dei terminali del DNA piuttosto che sui frammenti (Figura 2). Teoricamente, TUNEL dovrebbe essere più sensibile e lineare per l'identificazione della frammentazione iniziale (bassa) del DNA rispetto alla scala del DNA o alla cometa, che hanno entrambi un periodo di latenza di accumulo di piccoli frammenti ad alta mobilità. In ogni caso, gli studi che combinano TUNEL con la cometa )41,42] o la scala del DNA [43,44] hanno qualche vantaggio nel catturare la frammentazione precoce del DNA con la massima sensibilità.

Applicazioni TUNELTUNEL viene utilizzato per identificare e quantificare il danno renale negli studi tossicologici clinici e di base in una vasta gamma di applicazioni, comprese le esposizioni a trattamenti medici [45], ambientali [46], agricoli [41] e industriali [47] e animali [48] ] e scienze alimentari [49]. TUNEL è applicabile a tutti i tipi cellulari, organi e specie che hanno DNA e DNasi, che include quasi tutte le specie. TUNEL è stato utilizzato per identificare e quantificare il danno renale in una vasta gamma di animali, tra cui pesce zebra [50], pesce riso giapponese [51], polli [48], gerbilli [52], topi [41], ratti [45], rabb its [53], maialini [54] e umani [55]. Un importante vantaggio di TUNEL è che può essere utilizzato sia in cellule in coltura fisse che in tessuti fissi. Ciò fornisce coerenza metodologica per il confronto tra risultati in vitro e in vivo in studi in cui i meccanismi possono essere studiati nelle cellule renali in coltura, mentre le implicazioni in vivo sono valutate nei reni animali. Può essere utilizzato anche qualsiasi cosa tra cellule intere e tessuti, inclusi sferoidi cellulari in coltura [56] e fette di rene ex vivo [57,58].

L'intensità di TUNEL in termini di potenza del segnale o il numero di cellule TUNEL positive può variare tra le specie a seconda dell'attività delle DNasi. Nella nostra esperienza, il rene di ratto ha una DNasi I più attiva rispetto al rene di topo e la forza del segnale TUNEL-positivo è correlata a questo. Quando il rene viene confrontato con altri organi, il suo segnale TUNEL-positivo è molto intenso e simile ad altri organi con un'elevata attività della DNasi I, come l'intestino e le ghiandole salivari. All'altra estremità dello spettro, la più bassa potenza del segnale TUNEL-positivo si osserva nel cervello e nelle cellule tumorali/tumorali, dove l'espressione della DNasi I è molto probabilmente inattivata dallo splicing alternativo nella regione codificante [59]. Il segnale TUNEL positivo si osserva in tutti i tipi cellulari del rene. In media, l'epitelio tubulare è danneggiato più spesso dei glomeruli, specialmente nelle lesioni acute (Figura 3A). Ciò si correla bene con l'attività della DNasi I prevalente in questi tipi di cellule. A giudicare dalle differenze di sesso ed età osservate nei nostri esperimenti, la DNasi I è più abbondante e attiva nei maschi rispetto alle femmine e agli animali di mezza età rispetto agli animali di età avanzata o neonatale. Tuttavia, nessuna differenza netta nella positività al TUNEL è evidente in relazione al sesso o all'età, probabilmente perché l'importante o è predominato da altri fattori. In alcuni modelli renali (come l'ischemia-riperfusione), la DNasi I è indotta [9]; mentre in altri, non è e può anche essere soppresso (ad esempio, nella tossicità del cisplatino) [10]. È stato dimostrato che l'attivazione delle endonucleasi, se presenti, avviene entro le prime 24 ore dopo il danno renale [9,60,61]. Pertanto, non sorprende che almeno la metà delle applicazioni TUNEL nella ricerca sui reni in questa revisione sia stata utilizzata per il danno renale acuto (AKI) poiché la valutazione dell'AKI viene spesso effettuata entro 24-72 h dopo la lesione, quando le endonucleasi sono più attive . L'elenco degli studi sull'AKI è lungo e include lesioni tossiche, settiche, da trapianto e ipossiche. In questo lavoro, abbiamo esaminato i modelli, i tipi di esposizione, i trattamenti, le tempistiche di valutazione e i tipi di cellule interessati da questi studi. Gli studi che sono stati esaminati hanno riguardato modalità acute e miste di danno renale e malattia renale cronica.

La presenza di danno renale con segnale TUNEL positivo nei tubuli o nel glomerulo dipende dal tipo di agente dannoso o malattia. Ad esempio, la nefrite da lupus nell'uomo e il danno da nanoparticelle di nichel sono stati descritti come dotati di segnali TUNEL-positivi strettamente glomerulari [62,63]. D'altra parte, l'ischemia-riperfusione e la nefropatia diabetica indotta da streptozotocina nei ratti hanno prodotto cellule TUNEL-positive solo nei tubuli [64,65]. I tubuli prossimali, l'ansa di Henle, i tubuli distali e i dotti collettivi sono spesso TUNEL-positivi nei modelli di ischemia-riperfusione. Cellule TUNEL-positive sia nei glomeruli che nei tubuli sono state descritte in ratti esposti a farmaci come ciclosporina A [66] e doxorubicina [67] o materiali di prodotti di consumo come nanoparticelle di ossido di zinco [68] e in un modello di ratto di diabete mellito [68] 69]. L'AKI indotto dallo shock settico nell'uomo era anche associato a cellule TUNEL positive sia glomerulari che tubulari [70]. l'ostruzione strangolata dell'intestino tenue ad anello chiuso ha causato la positività al TUNEL nel rene in3h [87].

L'AKI può verificarsi dopo il trapianto e lesioni ipossiche. Il rigetto dell'allotrapianto nell'uomo è comunemente associato all'elevazione delle cellule TUNEL-positive [88,89]. Dopo l'ischemia fredda, le cellule TUNEL-positive sono state generalmente osservate entro 2-24 h durante la riperfusione [90], o più strettamente, tra 14 e 17 h dopo l'ischemia [91], e talvolta siamo ancora osservati fino a 7 giorni in rigetto del trapianto [92]. Allo stesso modo, nei modelli di ischemia-riperfusione, le cellule TUNEL-positive sono state osservate più spesso 24 ore dopo la riperfusione [44,93,94], o nell'intervallo tra 4 [95,96] e 72 ore [97]. Sia nel trapianto che negli studi ischemici AKI, le cellule TUNEL-positive sono state localizzate nelle cellule epiteliali tubulari distali e prossimali [44,93]. Nel toporenidopo il danno da ischemia-riperfusione, le cellule TUNEL-positive sono state descritte come concentrate nella giunzione corticomidollare, il solito bersaglio del danno ischemico [98].

Nel trapianto umano sono state osservate lesioni miste acute e croniche, in cui nello stesso studio esposizioni tossiche, stati patologici e/o valutazioni erano sia acute (es. ore, giorni) che croniche (es. settimane, mesi, anni) rigetto (biopsia da 1 settimana a 3 anni dopo il trapianto) [88], infezione da virus dell'epatite E suina (7 e 14 giorni dopo l'inoculazione) [52], stress da pneumoperitoneo da CO2 nell'idronefrosireni(idronefrosi a 2 settimane, 2 giorni dopo il pneumoperitoneo) [53], glomerulonefrite proliferativa mesangiale indotta dal veleno di serpente (da 1 a 14 giorni dopo l'iniezione) [99], ostruzione ureterale unilaterale (da 1 a 14 giorni di ostruzione) [100], esposizione all'acetato di uranile (da 1 a 28 giorni di esposizione) [101], nefropatia da acido aristocolico (5 e 30-giorni di esposizione giornaliera) [102] e iperossia neonatale (testato da 1 a 60 giorni dopo la nascita, esposto a iperossia prima 14 giorni) [103]. Quattordici giorni dopo l'impatto è un momento di valutazione molto comune per questo tipo dilesioni renali[52,53,99,101,103]. Nella maggior parte dei casi, le cellule TUNEL-positive erano localizzate nei tubuli e nei dotti collettivi. L'unica eccezione è stata la tossicità del veleno di serpente, che ha danneggiato principalmente i glomeruli [99].

Cronicorenemalattia (CKD), definita come la presenza direnedanno o diminuzione della velocità di filtrazione glomerulare (GFR) nell'uomo per più di 3 mesi, è anche un soggetto comune per la valutazione TUNEL, che può determinare se l'insufficienza renale cronica è associata a progressivadanno ai reni.L'insufficienza renale cronica più comunemente studiata in cui viene applicato TUNEL è la nefropatia diabetica. La lesione identificata dalla positività al TUNEL si è verificata nei tubuli e nei podociti [69] nei pazienti diabetici con insorgenza di diabete prima del test TUNEL che variava da 7 a 30 anni [104,105] e da 2 a 16 settimane dopo il trattamento con streptozotocina nei roditori [106,107]. Un'istopatologia TUNEL-positiva simile è stata riportata nella nefropatia da immunoglobuline A [22]. Nella nefrite da lupus e nella glomerulonefrite membranoproliferativa, la positività al TUNEL è stata osservata principalmente nei glomeruli [62,108,109]. D'altra parte, studi sulla sicurezza dei farmaci di cisplatino [110], clorochina [45], doxorubicina [67], finasteride [23], tacrolimus [111] e levetiracetam [24] hanno osservato principalmente danni tubulari. Allo stesso modo, la lesione acuta continua identificata dalle cellule tubulari TUNEL-positive è stata descritta in studi di nefropatia da acido urico [112], carenza di metionina [48], esposizione alle tossine ambientali microcistina-LR [50] e cadmio [113], e in associazione con ossalato di calcio indottorenepietre [114] e nanoparticelle calcificanti [115]. Sebbene l'identificazione del danno renale progressivo durante la CKD mediante il test TUNEL sia un utile strumento diagnostico, la combinazione del test TUNEL con l'immunoistochimica (IHC) sarebbe forse ancora più istruttiva nel determinare il meccanismo della lesione.

TUNEL Tecniche di Quantificazione e Colocalizzazione

I metodi di quantificazione del TUNEL variano. Nella maggior parte dei rapporti, le cellule/nuclei TUNEL-positivi sono quantificati come percentuale di cellule/nuclei totali [83,116,117]. Questa sembra la cosa giusta da fare, anche se il numero di cellule TUNEL-positive probabilmente non corrisponde esattamente al numero di cellule morte. Alcune cellule potrebbero non aver raggiunto livelli identificabili di frammentazione del DNA, mentre altre potrebbero essere già state eliminate dai macrofagi. Viene anche utilizzata la quantificazione del numero di cellule TUNEL positive per unità quadrata (mm2) [118], ma questo metodo sembra meno preciso perché dipende dalla posizione e dal contenuto del tipo di cellula delle aree. Le sezioni corticali contengono principalmente glomeruli, tubuli, vasi sanguigni e raggi midollari, mentre le sezioni midollari contengono principalmente anse di Henle, dotti collettori e vasi sanguigni. La quantificazione "per Fifield" dipende certamente da quale sia il campo [72,119], e la quantificazione "per sezione" è, ancora di più, indefinita [61,120]. Misurazioni scarsamente identificate, come "punteggio istologico" [121], "indice apoptotico" [113], "tasso di apoptosi" [92], "percentuale di apoptosi" [122] o percentuale di controllo non trattato [123,124], sembrano essere ancor meno appropriato, e rendere l'interpretazione difficile e non confrontabile con la maggior parte degli studi.

La morte cellulare nelle cellule vicine inizia in modo non uniforme perché dipende dalla vascolarizzazione, dal ciclo cellulare e da altre variabili. Ciò si traduce spesso in una colorazione TUNEL irregolare delle cellule nel tessuto [45,96,125]. Sorprendentemente, l'intensità generale del segnale TUNEL positivo non viene utilizzata per la misurazione TUNEL, nonostante dipenda direttamente dal grado di frammentazione del DNA. Ciò è forse dovuto al fatto che le cellule sono considerate morte indipendentemente dall'intensità del segnale TUNEL, poiché una cellula non può essere "più morta" se la colorazione TUNEL è più intensa. Sebbene sia difficile confrontare gli studi che utilizzano un'ampia varietà di metodi per quantificare i risultati di TUNEL, la quantità di cellule TUNEL-positive negli animali di controllo è solitamente inferiore al 2% [75,99,100,116,126]. Una lesione acuta è associata a un aumento di circa 5–40 volte della positività TUNEL [79,126,127]. Durante la lesione cronica, l'aumento delle cellule TUNEL-positive è leggermente inferiore, ~ 2–{19}} volte, [29,43,65] rispetto ai controlli non trattati.

Il test TUNEL iniziale basato sulla colorazione diaminobenzidina (DAB) è stato progettato per la microscopia ottica [14,15]. Questo metodo tradizionale è stato ancora utilizzato in due terzi degli studi esaminati in questa revisione e nella stragrande maggioranza degli studi di biopsia umana. La quantificazione viene eseguita mediante conteggio cellulare manuale e, sebbene precisa, richiede molto tempo. Spesso la quantificazione non viene utilizzata affatto e i risultati vengono presentati utilizzando immagini di campioni trattati e colorati come semplice prova dell'avvenuta morte cellulare. L'automazione può accelerare il processo di quantificazione [128,129]. Tuttavia, DAB non può essere combinato con nessun'altra colorazione nello stesso campione, e quindi TUNEL basato su DAB può fornire solo il numero di cellule morte, senza alcuna identificazione del tipo cellulare (tranne il riconoscimento visivo) o del meccanismo di morte cellulare.

Mentre gli studi sull'uomo si basano prevalentemente su TUNEL basato su DAB utilizzando la microscopia ottica, circa la metà degli studi sugli animali utilizza la microscopia a fluorescenza FL (Figura 3). TUNEL fluorescente è visivamente attraente, facilmente interpretabile e presenta diversi importanti vantaggi. Oltre alla quantificazione precisa mediante l'identificazione dei nuclei TUNEL-positivi o dell'intensità media del colore, il segnale TUNEL fluorescente FL può essere colocalizzato con altri colori per l'istochimica (ad esempio, DAPI) (Figura 3A) o IHC (Figura 3B). In quest'ultimo, l'uso di marcatori proteici può aiutare a identificare segnali TUNEL-positivi associati a diversirenecompartimenti o fornire informazioni sul tipo di morte cellulare. Non siamo riusciti a trovare alcun esempio di TUNEL combinato con la doppia colorazione dell'anticorpo IHC. Sebbene una tale combinazione sarebbe molto istruttiva, ad esempio, per l'identificazione di un meccanismo di morte cellulare in determinati tipi cellulari, le difficoltà tecniche associate a tale colorazione possono superare i benefici.

Identificazione direneil tipo di cellula non è certamente un problema per un espertorenepatologo [104]. Per questo motivo, l'uso di marcatori aggiuntivi per l'identificazione del tipo cellulare, ad esempio utilizzando CD31 per l'identificazione delle cellule endoteliali [130], è raro. Tuttavia, viene spesso utilizzato l'uso di marcatori proteici IHC per la caratterizzazione del danno tissutale. La maggior parte degli studi utilizza la positività al TUNEL come unica prova di apoptosi. In altri studi, il riconoscimento che la positività al TUNEL non è specifica per l'apoptosi ha portato alla combinazione di molti marcatori morfologici (p. es., ematossilina ed eosina o colorazione periodica dell'acido-Schiff), biochimici e IHC con la colorazione TUNEL per confermare l'apoptosi. Il marcatore più comunemente usato per l'apoptosi caspasi-dipendente è la caspasi scissa (attiva)-3 utilizzando un anticorpo che non riconosce la caspasi a grandezza naturale-3 [131,132]. Sia il test TUNEL che quello della caspasi scissa-3 hanno mostrato una colorazione esclusivamente tubulare, non glomerulare, nell'ischemia-riperfusione del ratto [64]. Altri studi sulla caspasi hanno utilizzato la caspasi-1 [27], -9 [53], -11 [28] e -12 [75]. Altri marcatori apoptotici includevano la famiglia di proteine ​​Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49] e Bad [43]; recettore apoptotico Fas [52] e recettore apoptotico-ligando FasL [66]; fattori di trascrizione della proteina forkhead box (FOX) Fox01 [133] e Fox03 [27]; e citocromo c [53]. L'infiammazione è stata identificata dall'IHC del fattore di necrosi tumorale-alfa (TNF) [134]; fattori di crescita tumorale TGF [66] e TGF- 1 [135]; serina/treonina chinasi 1 (SGK1) [135]; flavoproteina a trasferimento di elettroni, subunità beta (ETF ) [136]; Giano chinasi-2 (JAK2) [137]; trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT3) [137]; fattore nucleare potenziatore della catena kappa-leggera delle cellule B attivate (NF-κB) [137] e la sua proteina inibitrice IκB [137]. Perrenevalutazione del danno, molecola del danno renale-1 (KIM-1) [24], canale dell'acquaporina-1 (AQP-1) [45], fattore inducibile dall'ipossia {{7} }fattore di trascrizione alfa (HIF-1 ) [103], trasportatore di amminoacidi di tipo Asc-1 (Asc-1) [121], bersaglio della rapamicina nei mammiferi (mTOR) [131] chinasi , e sono state utilizzate transglutaminasi II [89]. Il danno ossidativo renale è stato studiato utilizzando marcatori come 8-idrossiguanosina (8OHdG) [102], lipocalina associata alla gelatinasi neutrofila (NGAL) [102], deacetilasi sirtuina NAD-dipendente-1 (SIRT1) [138] e eme ossigenasi 1 (HO-1) [90]. Le chinasi sono state studiate intensamente, inclusa la via c-Jun della chinasi N-terminale (JNK) [101], la fosfoinositide 3-chinasi/proteina chinasi B/fattore nucleare eritroide 2-fattore di trascrizione del fattore 2 correlato (PI3K/ Via Akt/Nrf2) [46], proteina di giunzione del gap della membrana plasmatica della pannexina-1 (PANX1) [26] e protein chinasi/chinasi regolata dal segnale extracellulare (MAPK/ERK) [26]. Gli studi sulle endonucleasi apoptotiche hanno coinvolto la DNasi attivata dalla caspasi (CAD) [139], la DNasi I [108] e l'EndoG [139], e i marcatori di danno al DNA includevano la proteina tumorale p53 (p53) [99] e la proteina 1 correlata alla dinamina (PARP1 ) [66]. Alcuni studi hanno anche trovato utile la valutazione dell'apoptosi mediata dallo stress del reticolo endoplasmatico e del danno tissutale [75].

Dato un gran numero di studi meccanicistici esaminati e il vantaggio di combinare TUNEL con i marcatori IHC per l'identificazione dei meccanismi di morte cellulare, ci si aspetterebbe molti studi che utilizzano la colocalizzazione tra i due. L'analisi può essere eseguita mediante una colocalizzazione pixel per pixel tra cellule TUNEL-positive e marcatori IHC, intensità media del marcatore IHC nelle aree TUNEL-positive o intensità del segnale TUNEL-positivo nelle aree positive del marcatore IHC. Sfortunatamente, questo vantaggio di TUNEL è stato utilizzato solo in pochi studi. Le cellule TUNEL-positive sono state colocalizzate con caspasi scissa-3 inrenetubuli durante la tossicità del paracetamolo nei ratti [74]. La colocalizzazione IHC con segnale TUNEL-positivo ha consentito l'identificazione della morte cellulare delle cellule mesangiali durante la nefrite di Habu [99]. Al microscopio ottico, la colocalizzazione con marcatori meccanicistici di tossicità è stata effettuata in sezioni seriali, come riportato da Ott et al. [89].

TUNEL Problemi e Limitazioni

Diversi potenziali problemi possono verificarsi e dovrebbero essere previsti quando si lavora con TUNEL. Uno è che i terminali del DNA 30OH si verificano non solo durante la morte cellulare a causa dell'azione dell'endonucleasi, ma anche come normale metabolita intermedio in quasi tutte le reazioni enzimatiche con il DNA. Una funzione cellulare primaria che produce 30OH terminali è la sintesi del DNA, in cui numerosi frammenti di Okazaki possono teoricamente produrre un segnale TUNEL falso positivo, specialmente nelle modifiche altamente sensibili del test. In occasionedanno renale,La riparazione del DNA può anche contribuire a falsi segnali TUNEL-positivi come risultato di un'azione dell'endonucleasi AP. Una massiccia lesione renale ossidativa indotta da lesioni chimiche (perossido di idrogeno, bleomicina) o fisica (irradiazione gamma) può aumentare il numero di estremità 30OH, aumentando le letture TUNEL false positive a parte la frammentazione del DNA mediata dall'endonucleasi.

Più spesso e più probabilmente, condizioni sperimentali della reazione TdT impostate in modo improprio (tempo, temperatura, attività enzimatica o cofattori) possono comportare un segnale di fondo positivo TUNEL artificialmente elevato. Sebbene rimanga indefinito su ciò che è considerato il normale valore di base per i campioni di tessuto renale non trattati, sembra plausibile che circa l'1% delle cellule totali sia un numero ragionevole. Certamente, un background del 10 percento o superiore è una chiara evidenza di condizioni di analisi non caratterizzate e non raffinate o di una deviazione dalle condizioni di conservazione del campione appropriate.

Un altro problema da aspettarsi è la bassa attività della DNasi I in alcuni tipi di cellule (p. es., endotelio),renecompartimenti (p. es., glomeruli) o tessuti patologici (p. es., tumori). Ci si dovrebbe aspettare che queste cellule mostrino una bassa positività TUNEL, non perché siano resistenti alle lesioni, ma perché non c'è abbastanza attività endonucleasica per produrre un segnale misurabile in TUNEL. Nella nostra esperienza, anche le variazioni tra il {{0}},01 percento e lo 0,1 percento delle cellule TUNEL positive possono essere statisticamente significative e utilizzate come prova solida di danno renale (di un altro tessuto).

Infine, un problema con la quantificazione della colorazione TUNEL sorge quando la quantità di frammentazione del DNA è troppo elevata, ad esempio, nelle fasi avanzate della morte cellulare o in lesioni ad alta intensità, dove il DNA rimanente non può essere adeguatamente contrastato con DAPI a causa dello smontaggio del doppia elica (Figura 3D). In questi casi, i segnali TUNEL-positivi sono "sospesi nell'aria" e apparentemente non associati a un nucleo. Diventa responsabilità di un patologo interpretarli come cellule TUNEL-positive piuttosto che come un artefatto. Con TUNEL marcato con fluoresceina, c'è il pericolo di identificare l'autofluorescenza di fondo nel tessuto come TUNEL-positività [140]. In questi casi, si consiglia di passare allo spettro rosso TUNEL [51,54].

I pattern TUNEL come fonte di informazioni aggiuntive

Diversi modelli TUNEL possono essere chiaramente distinti e utilizzati per determinare un potenziale meccanismo e grado di lesione (Tabella 1, Figura 3). Di solito, un tipo di pattern TUNEL di soli nuclei è prodotto da una lesione lieve, mentre una lesione più forte (cioè, un'esposizione elevata) provoca una colorazione più forte e la disintegrazione di nuclei o cellule. Un modello TUNEL rigorosamente apoptotico è la frammentazione nucleare a seguito della formazione di corpi apoptotici (Figura 3E). Piccoli frammenti di nuclei TUNEL-positivi, che sono probabilmente corpi apoptotici, sono stati osservati nell'ischemia-riperfusione di ratto a 24-72 ore [97]. Corpi apoptotici sono stati osservati anche con l'etichettatura TUNEL dei nuclei nell'epitelio tubulare renale e nell'interstizio 14 giorni dopo il danno da ischemia-riperfusione nei ratti [141]. L'aumento delle dosi di olio di lavanda ha ridotto i pattern TUNEL dei soli nuclei e li ha convertiti in TUNEL simili a necrosi con perdita citoplasmatica [94]. Quest'ultimo era il risultato della distruzione dell'involucro nucleare dovuta all'azione delle proteinasi e delle lipasi nella necrosi. TUNEL citoplasmatico (Figura 3F) visto come un citoplasma TUNEL-positivo è stato osservato al microscopio ottico nel modello di rabdomiolisi nei tubuli di ratto [142] e in podociti coltivati ​​in presenza di alto glucosio e nella nefropatia diabetica nei topi [135]. TUNEL citoplasmatico è stato anche descritto nell'ischemia-riperfusione renale nei topi utilizzando TUNEL fluorescente FL [98] e nell'ischemia-riperfusione nei ratti mediante microscopia ottica [143]. Danno profondo ed esclusivamente tubulare indotto da cloruro di mercurico con forte colorazione TUNEL citoplasmatica indicativa di danno della membrana nucleare [60]. Se la lesione continua o la dose dell'agente dannoso aumenta, TUNEL citoplasmatico può essere convertito in un'immagine "disordinata" di TUNEL disperso (Figura 3G) attribuita a fasi tardive della distruzione cellulare a causa della necrosi e della fuoriuscita di citoplasma cellulare e detriti. Ad esempio, TUNEL sia citoplasmatico che disperso è stato osservato in topi trattati con cisplatino [71,72] e ratti [144], e nel danno podocitario in ratti diabetici indotti da streptozotocina [145]. TUNEL necrotico disperso è stato osservato anche durante la nefrotossicità indotta da acetato di uranile nei topi [101]. Infine, un'altra variabile del segnale TUNEL a cui prestare attenzione è l'intensità dei segnali TUNEL-positivi, che possono deviare da cellula a cellula a seconda del numero di rotture (grado di lesione) subite da ciascuna cellula, come documentato da alcuni studi [45,96,125 ]. Per i modelli in cui si osserva un'intensità del segnale TUNEL variabile, si raccomanda la quantificazione sia del numero di oggetti TUNEL positivi che dell'intensità media della colorazione.

Conclusioni

A causa dell'elevata attività delle endonucleasi apoptotiche nel rene, in particolare DNasi I ed EndoG, l'uso di TUNEL perricerca e diagnosi del reneè molto istruttivo. Potrebbe diventare ancora più utile se TUNEL viene applicato oltre il suo utilizzo iniziale come metodo per identificare l'apoptosi. L'applicazione di TUNEL esclusivamente per gli studi sull'apoptosi è un buon esempio di come la scienza possa essere inavvertitamente mal indirizzata da un metodo utilizzato in modo inappropriato. Nonostante il suo utilizzo come test per lesioni prevalentemente acute, TUNEL può essere applicato con successo per valutare sia AKI che CKD. Tuttavia, nell'insufficienza renale cronica, il grado di positività al TUNEL dovrebbe essere inferiore rispetto al danno acuto. Poiché l'attività delle endonucleasi (principalmente, DNasi I) è molto più elevata nell'epitelio tubulare rispetto ad altri compartimenti renali, il danno ai tubuli renali è generalmente visto come più prominente. Tuttavia, le lesioni glomerulari o vascolari possono anche essere studiate utilizzando TUNEL se la lesione si verifica effettivamente in questi compartimenti. La colocalizzazione di TUNEL fluorescente FL con marcatori IHC consente l'identificazione e l'associazione di tipi cellulari e meccanismi di morte cellulare con segnali TUNEL. La quantificazione di TUNEL può fornire preziose informazioni sul grado di morte cellulare e l'applicazione di software di analisi delle immagini può essere molto utile a questo proposito. Considerando la varietà di modelli TUNEL, immagini rappresentative sono fortemente suggerite per stabilire e dimostrare

Segnali TUNEL considerati positivi. Infine, i modelli TUNEL dovrebbero essere utilizzati come fonte di informazioni aggiuntive, come il meccanismo di morte cellulare e il grado di tossicità. Ad esempio, la distinzione tra corpi apoptotici TUNEL-positivi, la presenza di segnali TUNEL citoplasmatici o pattern TUNEL dispersi può aiutare a identificare le cellule TUNEL-positive apoptotiche rispetto a quelle necrotiche per interpretazioni più precise dei risultati della ricerca e della diagnostica.

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