Effetti protettivi delle microvescicole delle cellule progenitrici endoteliali sulla lesione delle cellule renali di ratto indotta da Ang II
Mar 11, 2022
Astratto.L'ipertensione cronica può portare adanno ai reni,nota come nefropatia ipertensiva o nefrosclerosi ipertensiva. Un'ulteriore comprensione dei meccanismi molecolari attraverso i quali si sviluppa la nefropatia ipertensiva è essenziale per una diagnosi e un trattamento efficaci. Il presente studio ha studiato i meccanismi mediante i quali le cellule progenitrici endoteliali (EPC) riparano il ratto primariorenecellule (PRK). I test ELISA, Cell Counting Kit‑8 e citometria a flusso sono stati utilizzati per analizzare gli effetti delle EPC o EPC‑MV sullo stress ossidativo, l'infiammazione, la proliferazione cellulare, l'apoptosi e il ciclo delle PRK indotte da AngII. È stato stabilito un modello di lesione PRK utilizzando l'angiotensina II (Ang II). Dopo l'induzione di Ang II, la proliferazione di PRK è stata ridotta, l'apoptosi è stata aumentata e il ciclo cellulare è stato bloccato nella fase G1 prima di entrare nella fase S. È stato riscontrato che i livelli di specie reattive dell'ossigeno e malondialdeide erano aumentati, mentre i livelli di glutatione perossidasi e superossido dismutasi erano diminuiti. Inoltre, i livelli delle citochine infiammatorie IL‑1, IL‑6 e TNF‑ erano significativamente aumentati. Pertanto, Ang II ha danneggiato i PRK stimolando lo stress ossidativo e promuovendo la risposta infiammatoria. Tuttavia, quando le PRK sono state co-coltivate con le EPC, il danno indotto da Ang II è stato significativamente ridotto. L'attuale studio ha raccolto le microvescicole (MV) secrete dalle EPC e le ha co-coltivate con PRK indotte da Ang II e ha identificato che le EPC‑MV conservavano il loro effetto protettivo sulle PRK. In conclusione, gli EPC proteggono i PRK dai danni indotti da Ang II tramite MV secreti.
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introduzione
L'ipertensione è un fattore di rischio per l'incidenza di malattie cardiovascolari e cerebrovascolari e la mortalità ad esse associata (1). Ilrenipossono causare ipertensione e sono uno degli organi bersaglio del danno da ipertensione (2). Cronicomalattie renali(CKD) è stata una delle principali cause di aumento della mortalità tra gli individui con pressione alta in tutto il mondo negli ultimi due decenni (3,4). Pertanto, è urgente promuovere il trattamento della nefropatia ipertensiva e studiarne il meccanismo patologico. Precedenti studi hanno dimostrato che l'angiotensina II (Ang II) ha indotto un danno vascolare e ha svolto un ruolo chiave nelle malattie vascolari attraverso diversi meccanismi, come l'induzione dell'apoptosi (5), l'arresto del ciclo cellulare (6), l'aumento dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) ( 7), favorendo la risposta allo stress ossidativo aumentando la secrezione di malondialdeide (MDA) e riducendo la secrezione di glutatione perossidasi (GSH‑Px) e superossido dismutasi (SOD) (8,9). Ang II promuove anche la produzione di fattori correlati all'infiammazione, come IL‑6, IL‑1 e TNF‑ (10‑12). Il danno indotto da Ang II è stato quindi utilizzato per modellare l'ipertensione in vitro, incluso nel ratto primariorenecellule (PRK) (13,14).
Per pazienti confunzione renaledeterioramento, danno alle cellule endoteliali e diminuzione della rigenerazione e riparazione sono le principali cause della perdita delle microvescicole peritubulari (MVs) (15). Le cellule progenitrici endoteliali (EPC) derivate dal midollo osseo possono promuovere la riparazione endoteliale (16,17). Precedenti studi hanno rivelato che le EPC possono migliorare la rigenerazione cardiovascolare (18) e regolare l'angiogenesi (19), oltre ad esercitare effetti terapeutici su malattie acuterenaledanno da ischemia-riperfusione (20) e in pazienti contrapianto renale(21). Tuttavia, per quanto ne sappiamo, l'effetto delle EPC sulla nefropatia ipertensiva non è stato riportato in precedenza. Abbiamo ipotizzato che le EPC possano avere un effetto protettivo contro la nefropatia ipertensiva inrenalecellule. Le MV sono secrete continuamente da una varietà di cellule del corpo, come cellule epiteliali, cellule tumorali e cellule staminali, ed esistono in diversi fluidi corporei, come sangue, urina e latte, dove mediano le funzioni biologiche (22). Prove crescenti hanno suggerito che l'effetto protettivo delle EPC è strettamente associato al rilascio di MV (23,24) Nel presente studio, è stata esaminata la potenziale applicazione delle EPC‑MV per il trattamento della nefropatia ipertensiva studiando gli effetti e i meccanismi protettivi attraverso il quale gli EPC‑MV proteggono dal danno PRK indotto da Ang II, per fornire una base teorica biologica per il trattamento della nefropatia ipertensiva.
Parole chiave:EPC‑MVs, nefropatia ipertensiva, Ang II, ROS, MVs, infiammazione, rene, renale
Materiali e metodi
Animali.Un totale di 12 8 ratti maschi Wistar-Kyoto (WKY) di una settimana di età (peso, 80‑120 g) sono stati ottenuti dal Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (licenza n. SCXK, Guangdong, 2015-0063). I ratti sono stati posti in una stanza con temperatura e umidità costanti (temperatura, 23±2˚C; umidità, 50±10 percento), sotto un ciclo di luce/buio di 12 ore con accesso ad libitum al cibo e all'acqua standard dei topi in una gabbia di polistirolo. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Hainan Medical University (Haikou, Cina; approvazione n. HYLL‑2021‑053) e sono stati eseguiti secondo le linee guida del National Institutes of Health (25).
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Isolamento e coltura di PRK.I ratti WKY con libero accesso all'acqua hanno digiunato per 12 ore prima dell'esperimento. I topi WKY sono stati sottoposti a eutanasia utilizzando un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital sodico (200 mg/kg di peso corporeo), quindi ilrenisono stati rimossi in modo asettico e la porzione corticale delreneè stato asportato e trapiantato in un piccolo bicchiere. Ilrenalela corteccia è stata tagliata in frammenti di tessuto di ~ 1 mm3, lavata tre volte con PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), centrifugata a 1,{3}} xg a 25˚C per 5 minuti e il surnatante è stato scartato. I frammenti di tessuto sono stati aggiunti alla collagenasi di tipo I (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) a una concentrazione finale di 1 g/l e i frammenti di tessuto sono stati fatti oscillare e digeriti a 37˚C per 30 min. Dopo la filtrazione attraverso uno schermo di acciaio inossidabile da 200 mesh (0,075 mm), le cellule sono state separate mediante centrifugazione a gradiente di densità Ficoll (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) (26). Dopo centrifugazione a 1,000 xg a 25˚C per 2 minuti, la sospensione intermedia è stata raccolta e miscelata con terreno MEM/F12 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), inoculata in una piastra da 6 pozzetti e coltivato a 37˚C con meno del 5% di CO2. Dopo 24 h, il mezzo è stato rimosso e sostituito con un mezzo fresco e il terreno non è stato attaccatorenalecellule e tessuti sono stati scartati. Dopo 48 h, il mezzo è stato nuovamente rimosso, le cellule sono state lavate due volte con PBS e sono state denotate come PRK (27,28); il principale costituito erano cellule mesangiali glomerulari di ratto. Le PRK sono state coltivate per tre generazioni e trattate con Ang II (1 µM; Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) a 37˚C per 24 h per stabilire la PRKdanno renalemodello. L'infiammazione indotta da Ang II nel rattorenalecellule epiteliali tubulari sono state eseguite come precedentemente descritto da Nair et al (29).
I PRK sono stati identificati utilizzando un test di immunofluorescenza (IF).Dopo aver risciacquato tre volte con PBS e fissate con paraformaldeide al 4% a 25˚C per 1 ora, le cellule sono state incubate (25˚C) con Triton X‑100 per 2 ore, seguito da BSA al 5% (Pechino Solar Science & Technology Co., Ltd.) a 25˚C per 30 min. Le PRK sono state quindi incubate per una notte al buio con ‑actina muscolare liscia (‑SMA; 1 µg/ml; n. cat. ab7817; Abcam) e vimentina (1:250; n. cat. ab92547; Abcam) a 4˚C. Dopo aver risciacquato tre volte con PBS, le cellule sono state incubate con anticorpi secondari marcati con Alexa Fluor® 488‑ (1:100; cat. n. ab150077; Abcam) o 647 (1:200; cat. n. ab150075; Abcam) a 37 ˚C per 1 ora. Quindi, le cellule sono state colorate con DAPI (0,5 µg/ml; Beyotime Institute of Biotechnology) a 25˚C per 5 min. Infine, le immagini sono state catturate utilizzando un microscopio a fluorescenza (ingrandimento, x400; Leica Microsystems GmbH).
Cultura e identificazione delle EPC.Il femore e la tibia del ratto sono stati sezionati e ciascun tubo del midollo osseo è stato lavato con PBS sterile. La miscela risultante è stata centrifugata (1,000 xg; 25˚C; 15 min) e le particelle sono state risospese in mezzo MEM/F12. Le cellule sono state isolate mediante centrifugazione in gradiente di densità Ficoll (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) (1,000 xg; 25˚C; 20 min) e poste in un pallone da coltura da 25 cm2 rivestito con fibronectina (BD Biosciences). Le cellule sono state mantenute in un mezzo completo in condizioni standard (37˚C; 5% di CO2). Il mezzo di coltura è stato cambiato dopo 4 giorni e le cellule aderenti sono state coltivate per altri 3 giorni (30). Per identificare le EPC è stata utilizzata la colorazione della lipoproteina a bassa densità (Dil‑Ac‑LDL) con complesso Dil (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.). Per il sistema di co-coltura, sono stati aggiunti PRK (1x104) alla camera inferiore di una piastra di co-coltivazione (Corning, Inc.) per 24 ore e quindi sono stati aggiunti Ang II (1 µM) o 200 µl di PBS e EPC (3x104 ) aggiunto alla camera superiore e incubato a 37˚C per 24 ore prima che fosse eseguita un'ulteriore analisi della funzione cellulare. Durante lo screening dei PRK e della migliore proporzione di EPC, le proporzioni del numero di cellule erano 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 e 1:7.
Preparazione di EPC‑MV. Le EPC sono state coltivate per 7 giorni come descritto in precedenza (30), lavate due volte con PBS e affamate di siero per 12 ore. Successivamente, il mezzo MEM/F12 contenente EPC in coltura è stato raccolto e centrifugato a 4˚C (1,000 xg; 15 min) e il surnatante è stato estratto a 4˚C (100,000 xg; 60 min) per la raccolta di EPC‑MV secrete. Dopo l'inclusione nella resina epossidica Pon 812 (Structure Probe, Inc.), è stata posta a 37˚C durante la notte. Quindi, è stata aggiunta una soluzione di fissazione per microscopio elettronico (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) per 4 ore e acetato di uranio (2 percento; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) e citrato di piombo (Wuhan Service Technology Co., Ltd. ) sono stati colorati a 25°C per 15 min. Le MV sono state confermate mediante microscopia elettronica a trasmissione. Nel sistema di co-coltura, sono stati aggiunti 50 µg/ml di EPC‑MV (31) alla camera superiore di una piastra di dosaggio Transwell e i parchi sono stati aggiunti alla camera inferiore come descritto in precedenza e incubati per 24 h.
Saggio di proliferazione cellulare.I PRK sono stati digeriti con tripsina, inoculati in piastre da 96 pozzetti a una densità di 3x103 cellule/pozzetto e coltivati per 24 ore. La densità ottica a 450 nm è stata misurata utilizzando 10 µl di reagente Cell Counting Kit‑8 (CCK‑8; Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) a 37˚C per 60 minuti, secondo le istruzioni del produttore, per valutare il tasso di proliferazione cellulare.
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Test dell'apoptosi cellulare.È stato eseguito un test dell'apoptosi cellulare utilizzando un kit di rilevamento dell'apoptosi dell'allegato V‑FITC (BD Biosciences), secondo le istruzioni del produttore. I PRK sono stati raccolti, lavati due volte con PBS ghiacciato (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) e risospesi in 500 µl di tampone legante. Le PRK risospese sono state quindi incubate con 5 µl di annessina V‑FITC e 5 µl di PI al buio per 15 minuti a 23±2˚C. L'apoptosi cellulare è stata valutata mediante citometria a flusso (FCM; FACSCanto II; software BD FACSChorus™, versione: 1.0; BD Biosciences).
Fusione EPC‑MV e PRK.Per osservare se le EPC‑MV fossero fuse con le PRK, le EPC‑MV sono state etichettate con un colorante fluorescente incorporato nella membrana lipidica (PKH26) prima della co‑incubazione. In breve, 50 µg/ml di EPC‑MV sono stati combinati con 2 ml di PKH26 (2x10‑6 M; Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) e miscelati a 23±2˚C per 5 min. La miscela etichettata è stata aggiunta a 2 ml di BSA all'1 percento (v) e centrifugata a 100,000 xg a 4˚C per 60 minuti, quindi risciacquata con PBS freddo. Il precipitato è stato sospeso in 1 ml di mezzo MEM/F12, aggiunto a PRK e incubato a 37˚C per 24 ore. Infine, è stato aggiunto 1 µg/ml di DAPI per la colorazione nucleare a 25°C per 15 minuti. Le immagini cellulari sono state acquisite utilizzando un microscopio a fluorescenza (ingrandimento, x400; Leica Microsystems GmbH).
Saggio del ciclo cellulare.Il test del ciclo cellulare è stato eseguito utilizzando il kit di rilevamento del ciclo cellulare (BD Biosciences). EPC o PRK (1x106) sono stati raccolti, lavati due volte con PBS e quindi fissati in 500 µl di etanolo ghiacciato al 70% per 2 ore a 25˚C. Le cellule sono state quindi lavate due volte con PBS freddo e incubate in PI (400 µl) e RNasi (100 µl) per 30 minuti a 37°C al buio. Il segnale PI è stato rilevato utilizzando FCM (FACSCanto II). Le percentuali delle cellule nelle fasi G1, S e G2 sono state contate e confrontate utilizzando il software FlowJo (versione 10.0.6; FlowJo LLC).
Misurazione ROS di FCM.I PRK sono stati coltivati con una confluenza del 60-70% e raccolti tramite tripsinizzazione. Tutte le cellule sono state incubate con 1,0 µM 2',7'‑diclorodiidrofluoresceina diacetato per 15 minuti a 37˚C. Le cellule sono state quindi lavate due volte con PBS e analizzate tramite FCM per rilevare ROS utilizzando un laser a 488 nm per l'eccitazione e un laser a 535 nm per il rilevamento.
ELISA.Dopo la centrifugazione (1,000 xg; 25˚C; 5 min), il supernatante cellulare di ciascun sottogruppo è stato raccolto per analizzare i livelli di MDA, GSH‑Px, SOD e i fattori infiammatori IL‑6, IL‑ 1 e TNF‑. I seguenti kit sono stati utilizzati secondo le istruzioni del produttore: kit di dosaggio Micro MDA (cat. n. BC0020; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), kit di dosaggio GSH‑Px (cat. n. BC1195; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), kit di rilevamento dell'attività SOD (n. cat. BC0170; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), kit ELISA IL‑1 di ratto (n. cat. RLB{ {13}}; R&D Systems, Inc.), kit ELISA Quantikine IL‑6 ratto (n. cat. R6000B; R&D Systems, Inc.) e kit ELISA Quantikine TNF ratto (n. cat. RTA00; R&D Systems, Inc. ).
Analisi statistica.Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte e tutti i dati sono espressi come media ± DS. I dati sono stati analizzati utilizzando il software SPSS versione 21.0 (IBM Corp.). Le differenze tra più gruppi sono state valutate utilizzando l'ANOVA a una via e il test post hoc di Dunnett. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Risultati
Identification of isolated EPCs and PRKs. The isolated EPCs were identified using Dil‑Ac‑LDL staining (Fig. 1A). Microscopic counting revealed that the degree of coincidence between red (Dil‑Ac‑LDL staining) and blue (nuclear staining with DAPI) fluorescence was >90 percento, confermando che le EPC sono state isolate con successo. I PRK isolati sono stati analizzati tramite IF (vimentina/‑SMA). I risultati hanno dimostrato che il livello di espressione di vimentina/‑SMA nei PRK era alto e positivo, suggerendo il successo dell'isolamento dei PRK (Fig. 1B).
Il rapporto ottimale tra EPC e PRK.È stato esaminato l'effetto della combinazione di diverse proporzioni di PRK/EPC in un sistema di co-coltura ed è stato riscontrato che le PRK coltivate con un rapporto di 1:3 PRK/EPC non presentavano tassi di proliferazione aumentati rispetto alle PRK coltivate con un 2: Rapporto 1, 1:1 o 1:2 di PRK/EPC (Fig. 1C). Inoltre, l'aumento delle proporzioni di EPC (1:4, 1:5, 1:6 e 1:7) ha comportato un aumento significativo della proliferazione di PRK rispetto a quella di EPC (1:3). Pertanto, è stato selezionato un rapporto di 1:3 PRK/EPC per ulteriori studi per prevenire possibili interferenze da EPC eccessivi negli esperimenti successivi.
Effetto della co-coltura EPC sul danno indotto da Ang II.I PRK (1x104) sono stati inoculati con 24 ore di anticipo nel compartimento inferiore di una piastra Transwell. La camera superiore conteneva 200 pi di PBS nel gruppo di controllo e 200 pi di EPC (3x104) nel gruppo sperimentale. Modellaredanno ai reni,1 µM Ang II è stato aggiunto allo scomparto inferiore. Dopo 24 ore, sono stati eseguiti i saggi CCK‑8 e FCM per misurare il tasso di proliferazione dei PRK. I PRK che hanno ricevuto Ang II in assenza di EPC hanno avuto una significativa diminuzione (P<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the="" g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">renemodello cellulare.
Le EPC proteggono le PRK dal danno indotto da Ang II, sono stati esaminati i livelli di stress ossidativo indotto da Ang II nelle PRK co-coltivate con EPC. I risultati del test FCM hanno rivelato che Ang II è aumentato significativamente (P<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).="" similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted="" mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c="" and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while="" prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">
Figure 1. Recovery of PRKs by co‑culture with EPCs following injury induced by Ang II. (A) Confirmation of the isolation of EPCs via Dil‑Ac‑LDL staining. Magnification, x100. (B) Confirmation of the isolation of PRKs using an immunofluorescence assay. Magnification, x400. (C) CCK‑8 analysis of the effects of different proportions of co‑cultured EPCs on the proliferation of PRKs. NS P>0.05 vs PRK: EPC, gruppo 2:1; * P<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.="" (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;="" prks,="" primary="" rat="">renecellule; FCM, citometria a flusso; CCK‑8, kit per il conteggio delle cellule‑8; Dil‑Ac‑LDL, lipoproteina a bassa densità acetilata del complesso Dil; OD, densità ottica; ‑SMA, ‑actina del muscolo liscio; NS, non significativo. risultati opposti per quanto riguarda la secrezione di questi enzimi. La generazione di ROS può quindi essere coinvolta nel danno cellulare indotto da Ang II e può essere migliorata mediante co-coltura con EPC.
Ang II può anche danneggiare le cellule promuovendo la secrezione di citochine infiammatorie, mentre le EPC possono prevenire l'infiammazione (32). Successivamente, è stato studiato se Ang II promuove la secrezione di citochine infiammatorie nelle PRK e se le EPC potrebbero esercitare il loro ruolo protettivo inibendo la secrezione di citochine infiammatorie. La secrezione di IL‑1, IL‑6 e TNF‑ è stata significativamente sovraregolata nei PRK dall'aggiunta di Ang II. Al contrario, nelle PRK co-coltivate con EPC, i livelli di IL‑1, IL‑6 e TNF‑ (Fig. 2E‑G) erano relativamente inferiori (P<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">
L'effetto protettivo degli EPC viene esercitato tramite MV.I meccanismi attraverso i quali le EPC esercitano effetti protettivi sull'Ang II indottorenele cellule sono state ulteriormente analizzate isolando le MV dalle EPC (Fig. 3A). Gli EPC‑MV sono stati etichettati con PKH26 e aggiunti ai PRK insieme ad Ang II in una piastra Transwell, come descritto in precedenza. La fluorescenza PKH26 è stata rilevata nel citoplasma delle PRK (Fig. 3B), indicando che le EPC‑MV si erano fuse con le PRK. Quindi, è stato riscontrato che la diminuzione del tasso di proliferazione indotta da Ang II, l'apoptosi promossa e l'arresto del ciclo nella fase G1, erano inibiti dagli EPC‑MV (Fig. 3C‑E). Simile alle PRK co-coltivate con EPC, le PRK coltivate in presenza di EPC‑MV ed esposte ad Ang II avevano livelli ridotti di ROS e MDA (Fig. 4A e B), livelli aumentati di GSH e SOD (Fig. 4C e D) e diminuzione della secrezione delle citochine infiammatorie IL‑1, IL‑6 e TNF‑ (Fig. 4E‑G), rispetto al gruppo Ang II.
Discussione
Per quanto ne sappiamo, il presente studio ha dimostrato per la prima volta che le EPC possono proteggere le PRK dal danno cellulare indotto da Ang II. Questo effetto protettivo è, almeno in parte, mediato da MV che sono secreti dalle EPC e si fondono con le PRK durante la co-coltura. Aggiungendo MV arricchiti ai PRK esposti ad Ang II, si è scoperto che gli EPC‑MV da soli potrebbero proteggere i PRK dal danno indotto da Ang II inibendo lo stress ossidativo e l'infiammazione. Gli MV sono definiti come nanodetriti di membrana (0.05‑1 µm) (33) e vengono eliminati dalla superficie cellulare dopo l'attivazione, lo stress o l'apoptosi. Inoltre, le MV possono essere derivate da vari tipi cellulari, come piastrine, cellule endoteliali, EPC e globuli bianchi (34,35). Le MV esprimono marcatori di superficie cellulare specifici, che variano con la cellula di origine e la loro formazione e possono esercitare effetti antinfiammatori, anticoagulanti e angiogenici (36). Le MV rilasciate dalle EPC possono trasportare le informazioni biologiche della loro cellula madre e quindi esercitare una funzione simile sulle cellule bersaglio (33). Ad esempio, gli EPC‑MV proteggono i cardiomiociti dall'ipertrofia e dall'apoptosi indotte da Ang II (28), migliorano la funzione endoteliale e la capacità di regolare l'angiogenesi (37) e alleviano la disfunzione endoteliale indotta dallo stress ossidativo (38). Tuttavia, per quanto ne sappiamo, l'effetto degli EPC‑MV sulla nefropatia ipertensiva non è stato riportato in precedenza. Pertanto, il presente studio mirava a studiare i potenziali effetti protettivi di EPC e EPC‑MV indanno delle cellule renali.
Nel presente studio, è stato stabilito un modello di lesione PRK inducendo danni con Ang II. Coerentemente con i precedenti rapporti (26,39), Ang II ha ridotto la proliferazione di PRK, aumentato l'apoptosi e arrestato il ciclo cellulare nella fase G1 prima di entrare nella fase S. Sulla base di questi marcatori correlati all'ipertensione, si è concluso che il modello di ipertensione PRK indotta da Ang II è stato stabilito con successo. Inoltre, è stato stabilito che la co-coltura con EPC proteggeva le PRK dai danni indotti da Ang II. Dopo la co-incubazione di EPC con PRK più Ang II, i livelli di enzimi dello stress ossidativo e fattori infiammatori nei PRK erano diminuiti. Pertanto, i potenziali meccanismi attraverso i quali le EPC esercitano i loro effetti protettivi sui PRK possono coinvolgere la regolazione dello stress ossidativo e dell'infiammazione. Per quanto ne sappiamo, l'attuale studio ha dimostrato per la prima volta che le EPC possono migliorare la risposta allo stress ossidativo indotto da Ang II e l'infiammazione nelle PRK.
Le EPC proteggono efficacementefunzione renalein CKD (40) e svolgono un ruolo importante nel mantenimento dell'integrità vascolare e nella riparazione del danno endoteliale (15), oltre a ridurre la perdita vascolare, migliorare la funzione d'organo e aumentare il tasso di sopravvivenza nella sepsi (41). L'evidenza accumulata suggerisce che le EPC possono esercitare un ruolo protettivo attraverso la secrezione di MV (37,42,43). Per testare l'effetto protettivo delle EPC‑MV nelle PRK, le EPC‑MV sono state isolate ed etichettate con PKH26, quindi le MV marcate sono state co‑incubate con PRK più Ang II. Gli EPC‑MV si sono fusi con i PRK e hanno inibito significativamente la risposta allo stress ossidativo e l'infiammazione indotta da Ang II, e questi risultati sono simili a quelli di Fu et al (44). L'effetto inibitorio delle EPC‑MV sui livelli degli enzimi dello stress ossidativo era maggiore di quello delle sole EPC; ciò può essere attribuito al fatto che le MV sono presenti a una concentrazione maggiore nelle PRK trattate con EPC‑MV rispetto a quelle coltivate in co-coltura con EPC. Questi risultati suggeriscono che l'effetto protettivo delle EPC sulle PRK contro il danno cellulare indotto da Ang II può dipendere dalle MV secrete. Una limitazione del presente studio è che i potenziali meccanismi attraverso i quali gli EPC‑MV regolano i microRNA/mRNA/gli assi di trasduzione del segnale non sono stati completamente esaminati. Il ruolo e i meccanismi attraverso i quali gli EPC‑MV esercitano protezione controdanno ai renidovrebbe essere valutato in un modello animale di nefropatia ipertensiva, che è una direzione promettente per la ricerca futura. In conclusione, il presente studio ha dimostrato che le EPC possono proteggere le PRK dallo stress ossidativo indotto da Ang II e dall'aumento dell'infiammazione attraverso la secrezione di MV. Ciò fornisce una nuova direzione per il trattamento della nefropatia ipertensiva e stabilisce un modello in vitro per lo studiodanno renale.
