UMOD e l'architettura della malattia renale

Astratto

L’identificazione dei fattori genetici associati al rischio, all’insorgenza e alla progressione della malattianefropatiaha il potenziale per fornire intuizioni meccanicistiche eprospettive terapeutiche. In meno di due decenni, i progressi tecnologici hanno prodotto una miniera di informazioni sull’architettura genetica dell’uomomalattia renale cronica. Lo spettro dell’influenza genetica spazia da varianti (ultra) rare con effetti di grande dimensione, coinvolte nelle malattie mendeliane, a varianti comuni, spesso non codificanti e con effetti di piccole dimensioni, che contribuiscono alle malattie poligeniche. Qui, esaminiamo il paradigma diUMOD, il gene che codifica per l'uromodulina, per illustrare come una proteina specifica del rene di grande importanza fisiologica sia coinvolta in uno spettro di disturbi renali. Questo nuovo campo di indagine illustra l'importanza della variazione genetica nella patogenesi eprognosi della malattia, conimplicazioni terapeutiche.

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Con una prevalenza globale stimata superiore al 10%, un elevato onere individuale e sociale e opzioni terapeutiche limitate,malattia renale cronica(IRC) è un grave problema di salute pubblica. Anche nelle sue fasi iniziali, la malattia renale cronica è associata a molteplici complicanze ed esiti avversi e rappresenta un importante fattore di rischio per un’accelerazione della malattia.malattia cardiovascolaree invecchiamento [15]. Per decenni, la mancanza di comprensione meccanicistica delle molteplici funzioni assicurate dal rene ha rallentato lo sviluppo di interventi farmacologici mirati alla CKD e alle sue complicanze associate [10, 32].

Il raggruppamento familiare delle patologie renali, l’elevata ereditarietà dei parametri di funzionalità renale e la variabile suscettibilità dei ceppi animali consanguinei al danno renale guidano forti sforzi per decifrare l’architettura genetica delle malattie renali [5, 15, 37, 60]. Le prime scoperte genetiche in nefrologia sono state la mappatura della malattia del rene policistico autosomico dominante (ADPKD) nel 1985 [51] e l'identificazione di una mutazione in COL4A5 che causa la sindrome di Alport nel 1990 [1]. Seguì rapidamente l’identificazione dei geni coinvolti nelle classiche malattie glomerulari e tubulari, tra cui la sindrome nefrosica resistente agli steroidi, la cistinosi nefropatica, la malattia di Dent, le sindromi di Bartter e Gitelman, il diabete insipido nefrogenico e l’ADPKD [10]. In meno di due decenni, l’avvento di nuove tecnologie, tra cui il sequenziamento di nuova generazione (NGS) e gli studi di associazione sull’intero genoma (GWAS), hanno portato all’identificazione di centinaia di geni che causano disturbi renali ereditari o associati ai parametri di funzionalità renale e al rischio di insufficienza renale cronica. . A loro volta, queste intuizioni hanno migliorato la nostra comprensione dei processi che operano nei segmenti nefronali normali e malati, fornendo così nuovi bersagli terapeutici [10, 60, 67]. Queste scoperte sono state rese possibili grazie a studi collaborativi che hanno riunito famiglie con disturbi rari e ampie coorti multietniche per la scoperta rispettivamente di varianti genetiche rare e comuni. In questa breve recensione, utilizzeremo il paradigma della variazione genetica nell’UMOD, il gene che codifica per l’uromodulina, la proteina più abbondante nel rene e nell’urina normale, per illustrare come gli approcci genetici abbiano il potenziale per fornire informazioni sull’architettura della CKD. . Questi studi hanno coinvolto diverse coorti svizzere, che vanno dalla popolazione normale alle malattie rare, e sviluppi tecnologici supportati dal Centro nazionale svizzero di competenza renale. CH.

Lo spettro della frequenza allelica e della dimensione dell’effetto nella malattia

Una volta stabilita l’influenza genetica su un aspetto specifico della funzione renale, indagini specifiche possono decifrare l’architettura genetica dei disturbi legati a quel tratto. Tre criteri sono importanti quando si considerano le varianti alleliche associate alla malattia: (i) la frequenza della variante nella popolazione; (ii) la dimensione dell'effetto della variante sul fenotipo; e (iii) il numero di varianti genetiche che agiscono sul fenotipo [52]. Questi criteri sono classicamente rappresentati su un grafico X – Y, con la prevalenza della variante genetica sull'asse x e l'entità della sua dimensione dell'effetto sull'asse y (Fig. 1). Questa relazione visualizza lo spettro della variazione allelica, andando da varianti (ultra-) rare (frequenza allelica minore< 1°/00) with large effect size, involved in Mendelian disorders, to common variants (frequency>5%), con effetti di piccola entità coinvolti nei comuni disturbi poligenici [34]. Queste varianti genetiche possono essere identificate utilizzando nuove tecnologie tra cui rispettivamente NGS e GWAS. Si prevede che le varianti a effetto intermedio, non catturate da GWAS ma suscettibili di approcci di sequenziamento, facciano parte del continuum (Fig. 1). Sia gli studi basati sulla popolazione che le coorti di malattie rare sono essenziali per tale scoperta genetica.

Coorti SKIPOGH e CoLaus: ereditarietà e studi GWAS

Due coorti svizzere basate sulla popolazione hanno fornito un supporto inestimabile agli studi che studiano l’ereditarietà dei parametri di funzionalità renale e il ruolo delle variazioni UMOD nella CKD (Fig. 2).

Lo studio CoLaus ("Cohorte Lausannoise") è uno studio longitudinale basato sulla popolazione avviato nel 2003 nella città di Losanna. I partecipanti al CoLaus sono stati selezionati casualmente dall'elenco completo degli abitanti di Losanna nel 2003 [16]. I criteri di inclusione erano (i) consenso informato scritto; (ii) età compresa tra 35 e 75 anni; (iii) disponibilità a partecipare all'esame e a donare un campione di sangue; e (iv) origine caucasica. Alla fine del reclutamento nel 2006, il set di dati CoLaus di base comprendeva 6538 partecipanti (tasso di partecipazione: 34%). I partecipanti sono stati visitati per la prima volta dal 2003 al 2006, poi seguiti dal 2009 al 2012, dal 2014 al 2017 e dal 2018 al 2021. In tutte e quattro le visite, i partecipanti hanno partecipato a una visita medica mattutina presso l'ospedale universitario di Losanna dopo un digiuno notturno, che comprendeva un prelievo di sangue, valutazione delle caratteristiche antropometriche e completamento di un questionario sanitario dettagliato che indaga fattori relativi allo stile di vita, stato socioeconomico e civile, storia personale e familiare di malattia, nonché assunzione di farmaci [39]. Il progetto CoLaus comprende una serie di "sottostudi" volti a esplorare specifici risultati legati alla salute e esposizioni ambientali (https://www.colaus-psycolaus.ch/).

Fig. 1 Architettura genetica della malattia: spettro della frequenza allelica e dimensione dell'effetto. Varianti in geni importanti possono essere coinvolte in un continuum tra malattie rare e complesse, a seconda della frequenza allelica di rischio nella popolazione (asse x) e della forza della dimensione dell'effetto (odds ratio, asse y). Gli alleli (ultra)-rari possono essere identificati mediante sequenziamento di prossima generazione (NGS), mentre le varianti comuni possono essere identificate utilizzando studi di associazione sull'intero genoma (GWAS). Si prevede che varianti di effetti di dimensioni intermedie completino la dicotomia, manifestandosi come una malattia mendeliana non completamente penetrante o un modello oligo/poligenico che modifica l'espressività della malattia. Figura adattata da Manolio et al. [34]

Fig. 2 Infografica che riassume il disegno degli studi basati sulla popolazione CoLaus e SKIPOGH

Lo Swiss Kidney Project on Genes in Hypertension (SKIPOGH) è una coorte basata su famiglie e popolazioni che studia i determinanti genetici e ambientali della funzione renale e della pressione sanguigna. SKIPOGH è uno studio multicentrico e longitudinale con partecipanti reclutati nella città di Losanna e nei cantoni di Ginevra e Berna [46, 49]. All’inizio, i soggetti idonei sono stati selezionati casualmente dallo studio CoLaus basato sulla popolazione a Losanna e dallo studio Bus Santé basato sulla popolazione a Ginevra [26]. A Berna i soggetti sono stati selezionati casualmente utilizzando l’elenco telefonico cantonale. I criteri di inclusione erano (i) consenso informato scritto; (ii) età minima 18 anni; (iii) discendenza europea; e (iv) almeno uno, e idealmente tre, familiari di primo grado disposti a partecipare allo studio. Il tasso di partecipazione è stato del 20% a Losanna, del 22% a Ginevra e del 21% a Berna. La prima ondata di SKIPOGH ha avuto luogo tra il 2009 e il 2013 (baseline: SKIPOGH 1), mentre la seconda ondata è iniziata nel 2012 e si è conclusa nel 2016 (follow-up: SKIPOGH 2). SKIP-OGH 1 comprendeva 1128 partecipanti provenienti da 273 nuclei familiari. In entrambe le ondate, i partecipanti allo studio hanno partecipato a una visita medica mattutina dopo un digiuno notturno, che includeva prelievo di sangue, imaging renale, valutazione cardiaca e biobanca. I partecipanti hanno completato un questionario dettagliato sulla loro storia medica, sull'assunzione di farmaci, sui fattori legati allo stile di vita e alle caratteristiche socioeconomiche (http://www.skipo gh.ch/index.php/Benvenuti_to_the{{ 24}}SKIPOGH_studia!).

La stima del contributo relativo delle influenze genetiche e ambientali sui parametri della funzionalità renale e sui livelli di elettroliti sierici e urinari è un prerequisito per gli studi volti a identificare i geni coinvolti nella funzionalità renale. Grazie all'applicazione di un protocollo standardizzato in diversi centri, l'ereditarietà (cioè la proporzione della varianza di un dato tratto spiegata da effetti genetici) della velocità di filtrazione glomerulare stimata (eGFR), nonché delle concentrazioni sieriche e urinarie, della clearance renale, e le escrezioni frazionarie dei principali elettroliti potrebbero essere analizzate nella coorte SKIPOGH basata sulla famiglia [37]. Sono state osservate stime di ereditarietà elevate per il GFR stimato utilizzando l’EPI Eq della CKD. (46±6%), creatinina sierica (49±6%), cistatina C CKD-EPI (58±5%) e urea sierica (49±6%). L'ereditarietà delle concentrazioni sieriche era massima per il calcio, 37%, e minima per il sodio, 13%. Tutti i valori di probabilità erano significativi. Questi risultati hanno fornito la base per ulteriori indagini sulle basi genetiche della funzione renale e dell’omeostasi degli elettroliti nella popolazione generale.

Oltre agli studi di ereditarietà, nel GWAS sono stati inclusi i dati dei partecipanti alle coorti SKIPOGH e/o CoLaus che hanno identificato nuovi loci per la funzione renale e la CKD [70], la produzione ed escrezione di uromodulina [29, 40], l'albuminuria [58, 59 ], livelli di urato sierico [61], omeostasi del magnesio e del calcio [6, 7] e osmoregolazione [3].

Varianti UMOD in GWAS per funzione renale e CKD

Gli studi di associazione sull'intero genoma sono uno strumento utile e imparziale per scoprire regioni genomiche ("loci") associate ai parametri della funzionalità renale e al rischio di insufficienza renale cronica. In genere, i GWAS richiedono campioni di grandi dimensioni, ottenendo risultati significativi a livello dell'intero genoma (valore P<5× 10−8) variants that are common and associated with a relatively small increase in disease risk [69]. The largest GWAS in the field of nephrology addressed traits like the eGFR based on serum creatinine (eGFRcrea) [13, 69, 70]. As discussed above, there is a strong genetic predisposition to CKD, as the heritability of the eGFR is close to 50% [37]. The largest and most recent GWAS for eGFR identifed>250 loci genetici e spiegava quasi il 20% di tale ereditarietà [70]. Tra questi, le varianti nel locus UMOD mostrano la dimensione dell’effetto maggiore su eGFR e CKD [70]. Questo effetto, che si ritiene sia collegato all’espressione geneticamente guidata dell’uromodulina (vedi sotto), è coerente tra diversi gruppi etnici ed è osservato anche per tratti longitudinali compreso il rapido declino dell’eGFR [23].

Il locus UMOD include polimorfismi a singolo nucleotide (SNP; ad esempio, rs12917707 e rs4293393) che sono in completo linkage disequilibrium (LD) in un grande blocco che comprende il promotore del gene. Per questi SNP, l'allele di "rischio" è l'allele comune, con una frequenza compresa tra 0.765 e 0.955 [65]. Fondamentalmente, le varianti del promotore UMOD sono associate all'espressione di uromodulina nel rene e ai suoi livelli nelle urine e nel sangue. Infatti, i portatori omozigoti dell’allele di rischio UMOD hanno livelli due volte più alti di uromodulina nelle urine, rispetto ai portatori omozigoti dell’allele protettivo (minore) [29, 40, 64]. I GWAS più recenti per eGFR hanno identificato un segnale forte e indipendente all'interno di PDILT, il gene che fiancheggia UMOD sul cromosoma 16 [70]. È interessante notare che la variante intronica PDILT rs77924615 è associata ai livelli urinari di uromodulina, ma non all'espressione di PDILT, suggerendo che regola l'espressione di uromodulina [70]. Questa ipotesi è supportata dall'associazione indipendente di rs77924615 con i livelli di uromodulina urinaria in due meta-GWAS [29, 40]. Non sono stati esplorati i possibili collegamenti tra l'espressione dell'uromodulina, che è stata validata sperimentalmente per le varianti UMOD-PDILT, e altre trascrizioni correlate con varianti nello stesso locus [31].

Il locus UMOD è stato anche associato a ipertensione e malattie cardiovascolari incidenti [44], calcoli renali [25] e gotta/acido urico [25, 61], rafforzando la sua importanza per una serie di malattie comuni. In questi GWAS, gli alleli UMOD associati a livelli/espressione di uromodulina più elevati sono associati ad un aumento del rischio di CKD, ipertensione e iperuricemia, mentre sono protettivi contro i calcoli renali [11, 53].

La rilevanza biologica del locus UMOD per la CKD

La rilevanza del locus UMOD GWAS in relazione alla funzione renale è immediata, poiché UMOD è un gene specifico per il rene che codifica per l’uromodulina, la proteina più abbondante espressa nel rene ed escreta nelle urine normali [11, 13, 53]. L’uromodulina è prodotta principalmente dal tratto ascendente spesso (TAL) dell’ansa di Henle e, in misura minore (circa il 10%) nel segmento iniziale del tubulo contorto distale (DCT) [63]. L'uromodulina è una proteina ancorata al glicosilfosfatidilinositolo (GPI) appartenente alla famiglia delle proteine ​​del dominio della zona pellucida (ZP) (Fig. 3). La proteina è fortemente glicosilata (30% del Mw) e contiene 48 residui conservati di cisteina coinvolti in 24 legami disolfuro intramolecolari necessari per il corretto ripiegamento. L'uromodulina contiene quattro domini simili al fattore di crescita epidermico (EGF), un dominio ricco di cisteina (D8C) e un dominio ZP bipartito che consente la polimerizzazione delle proteine. Nelle cellule TAL, l'uromodulina monomerica legata alla membrana apicale viene scissa dall'epsina serina proteasi in un sito di scissione conservato situato vicino al terminale C della proteina [4, 42]. La scissione consente la polimerizzazione dell’uromodulina extracellulare in filamenti che formano una struttura a matrice nell’urina, il principale costituente dei cilindri urinari [56]. Recentemente, la struttura tridimensionale (3D) dei polimeri nativi dell'uromodulina urinaria è stata ottenuta mediante tomografia crioelettronica, mostrando una spina dorsale a forma di zigzag formata da domini ZP polimerizzati e bracci sporgenti composti dai domini EGF e D8C [68]. La mappatura della N-glicosilazione, i test biofisici e l’imaging hanno rivelato che l’uromodulina lega l’adesina del pilus di tipo 1 dell’Escherichia coli e che i filamenti dell’uromodulina si associano agli uropatogeni e mediano l’aggregazione batterica, potenzialmente prevenendo l’adesione e promuovendo l’eliminazione degli agenti patogeni [68]. Studi recenti hanno anche fatto luce sulla regolazione dell’escrezione di uromodulina nelle urine, compreso il ruolo svolto dal recettore sensibile al calcio [62] e dalla cheratina di tipo 1 KRT40 [29], e sull’attività dei processi di trasporto che operano nel TAL [50 , 54, 62].

Se la stragrande maggioranza dell'uromodulina è mirata apicalmente a formare polimeri organizzati nelle urine, va notato che l'uromodulina viene rilevata anche in forma monomerica nel siero, a livelli che sono almeno 100- volte inferiori rispetto a quelli nelle urine [11, 53]. I meccanismi che regolano il traffico basolaterale dell’uromodulina e il suo rilascio nell’interstizio e successivamente nella circolazione rimangono sostanzialmente sconosciuti. Un recente meta-GWAS dell'uromodulina circolante utilizzando diversi metodi di rilevamento ha rivelato che una variante missenso (p.Cys466Arg) nell'enzima B4GALNT2 che glicosila l'uromodulina era un allele con perdita di funzione che portava a livelli sierici di uromodulina più elevati, mentre altri loci influenzano la glicosilazione di uromodulina circolante [33]. L’opinione attuale è che l’uromodulina interstiziale possa interagire con le cellule del tubulo prossimale, contribuendo a regolare l’immunità innata, mentre l’uromodulina circolante può agire come antiossidante [53].

Studi su topi knock-out per l’uromodulina (Umod−/−) hanno fornito informazioni chiave sui ruoli dell’uromodulina e sulla sua rilevanza per vari processi che operano nel rene. Una descrizione dettagliata di questi ruoli è fornita in revisioni recenti [11, 53]. In breve, i polimeri di uromodulina nelle urine proteggono dalla formazione di calcoli renali e dalle infezioni del tratto urinario (UTI); l'uromodulina regola i sistemi di trasporto del sodio nel TAL e nel DCT, regolando così la pressione sanguigna e la capacità di concentrazione urinaria; stabilizza i canali TRPV5, TRPV6 e TRPM6, aumentando così la loro attività nel DCT. La piccola quantità di uromodulina rilasciata dal lato basolaterale delle cellule TAL nell'interstizio può regolare i processi nelle vicine cellule del tubulo prossimale e contribuire alla risposta innata, ad esempio, regolando l'abbondanza e l'attività dei fagociti mononucleari residenti, o entrare nella circolazione e agire come una molecola antiossidante [53]. Tutti questi processi sono rilevanti se si considera l’insorgenza della malattia renale cronica, del danno tubulointerstiziale e delle complicanze derivanti dall’insufficienza renale.

Fig. 3 Sito di produzione e struttura dell'uromodulina. L'uromodulina è prodotta principalmente dalle cellule che rivestono il tratto spesso ascendente (TAL), un segmento coinvolto nel riassorbimento di NaCl e di cationi bivalenti, pur non essendo permeabile all'acqua. L'uromodulina è una proteina ancorata al glicosilfosfatidilinositolo (GPI) che transita verso la membrana apicale delle cellule, dove viene scissa dall'epsina serina proteasi e rilasciata nelle urine dove forma grandi polimeri. Questi polimeri costituiscono la matrice dei cilindri urinari. La struttura prevista dell'uromodulina contiene un peptide leader (L); quattro domini simili a EGF (da I a IV); un dominio D8C ricco di cisteina; un dominio Zona Pellucida bipartito C-terminale (ZP_N e ZP_C) collegato da un linker; e un sito di ancoraggio GPI nella posizione 614. I sette siti di N-glicosilazione sono indicati da triangoli. Figura adattata da Devuyst et al. [11, 12]

The association of uromodulin expression levels with kidney damage was substantiated in a transgenic mouse model overexpressing wild-type uromodulin, mimicking the situation observed in carriers of the risk UMOD haplotype [65]. The transgenic Umod mice displayed a dose-dependent increase in systolic blood pressure, with salt-sensitive hypertension. Although kidney function remained normal, aging kidneys from the Umod transgenic mice showed focal lesions (e.g., tubular casts, cysts) and increased expression of kidney damage markers (e.g., lipocalin-2, Kim-1) and chemokines, that were not detected in the kidneys of control littermates. Similar focal lesions were evidenced in kidney biopsies from individuals aged>65 anni omozigoti per l'aplotipo UMOD a rischio, rispetto agli individui omozigoti per le varianti protettive [65]. Insieme, questi risultati suggeriscono che, nei soggetti portatori degli alleli a rischio UMOD, una maggiore produzione geneticamente determinata di uromodulina diventa deleteria nel tempo, promuovendo l’insorgenza della malattia renale cronica. L’effetto deleterio di una maggiore produzione di uromodulina nel rene potrebbe essere dovuto ad un aumento della domanda metabolica, all’attivazione cronica dei sistemi di riassorbimento del sale o a difetti nel lume del tubulo distale o nella circolazione, spiegando perché questi loci sono associati ad un forte invecchiamento. effetto [11, 13]. Da notare che le varianti di rischio UMOD associate a livelli più elevati di uromodulina sono anche associate a NKCC2 attivato e quindi a una risposta più elevata alla furosemide [65]. È in corso uno studio clinico che testa la potenziale influenza di queste varianti UMOD sulla risposta ai diuretici dell’ansa in soggetti con ipertensione (identificatore Clinical Trials.gov: NCT03354897).

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