I vaccini provocano un'immunità cellulare altamente cross-reattiva alla variante SARS-CoV-2 Omicron

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Jinyan Liu1*, Abishek Chandrashekar1*, Daniel Sellers1*, Julia Barrett1, Michelle Lifton1, Katherine McMahan1, Michaela Sciacca1,

Haley VanWyk1, Cindy Wu1, Jingyou Yu1, Ai-ris Y. Collier1, Dan H. Barouch1,2*

1 Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA, USA;

2 Ragon Institute di MGH, MIT e Harvard, Cambridge, MA, USA

È stato dimostrato che la variante SARS-CoV{1}} Omicron (B.1.1.529) altamente mutata elude una frazione sostanziale delle risposte anticorpali neutralizzanti suscitate dagli attuali vaccini che codificano l'immunogeno Spike WA1/20201, con conseguente aumento delle infezioni rivoluzionarie e ridotta efficacia del vaccino. Le risposte immunitarie cellulari, in particolare le risposte dei linfociti T CD8 più, sono probabilmente fondamentali per la protezione contro una grave malattia da SARS-CoV-22-6. Qui mostriamo che l'immunità cellulare indotta dagli attuali vaccini SARS-CoV-2 è altamente cross-reattiva contro la variante SARS-CoV-2 Omicron. Gli individui che hanno ricevuto i vaccini Ad26.COV2.S o BNT162b2 hanno dimostrato risposte durevoli dei linfociti T CD8 plus e CD4 plus che hanno mostrato un'ampia reattività crociata contro entrambe le varianti Delta e Omicron, anche nelle sottopopolazioni cellulari della memoria centrale ed effettrice. Le risposte mediane delle cellule CD8 più T specifiche per Omicron erano il 82-84 percento delle risposte specifiche delle cellule T CD8 più WA1/2020-. Questi dati suggeriscono che gli attuali vaccini possono fornire una protezione considerevole contro malattie gravi con la variante SARS-CoV-2 Omicron nonostante la sostanziale riduzione delle risposte anticorpali neutralizzanti.

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Studi recenti hanno dimostrato che gli anticorpi neutralizzanti provocati dal vaccino (NAbs) sono sostanzialmente ridotti alla variante Omicron SARS-CoV-2 altamente mutata, con conseguente rapida diffusione globale, comprese infezioni rivoluzionarie in individui completamente vaccinati1. Per valutare la reattività crociata delle risposte immunitarie cellulari indotte dal vaccino contro la variante SARS-CoV-2 Omicron, abbiamo valutato le risposte dei linfociti T CD8 plus e CD4 plus in 51 individui vaccinati con l'Ad26 basato sul vettore dell'adenovirus. Vaccino COV2.S7 (Johnson & Johnson; N=20) o il vaccino a base di mRNA BNT162b28 (Pfizer; N=31).

Dopo la vaccinazione BNT162b2, abbiamo osservato risposte elevate WA1/2020-NAb specifiche al mese 1, seguite da un forte calo entro il mese 8, come previsto9,10 (Fig. 1a). Dopo la vaccinazione Ad26.COV2.S, al mese 1 si sono verificate risposte iniziali sostanzialmente inferiori WA1/{12}}NAb specifiche, ma queste risposte erano più durature e persistevano ai mesi 89,11 (Fig. 1a). Tuttavia, sono stati osservati NAb specifici per Omicron con reattività crociata minima per entrambi i vaccini (Fig. 1a), coerenti con i dati recenti in assenza di boosting aggiuntivo1. Le risposte anticorpali leganti specifiche del dominio di legame del recettore (RBD) sono state valutate mediante ELISA e hanno mostrato tendenze simili, con anticorpi leganti specifici per Omicron cross-reattivi minimi (Fig. 1b). In contrasto con le risposte anticorpali, le risposte immunitarie cellulari specifiche di Spike valutate da I saggi ELISPOT del peptide IFN-g raggruppati hanno mostrato una sostanziale reattività crociata con Omicron (dati estesi Fig. 1). Successivamente abbiamo valutato le risposte delle cellule T CD8 plus e CD4 plus specifiche per Spike mediante saggi di colorazione delle citochine intracellulari. Ad26.COV2.S ha indotto una risposta mediana di IFN-g CD8 Spike-specifico più linfociti T di 0.061 percento, 0.062 percento e {{ 72}}.051 percento contro WA1/2020, Delta e Omicron, rispettivamente, al mese 8 dopo la vaccinazione (Fig. 2a). BNT162b2 ha indotto risposte mediane di IFN-g CD8 Spike-specifico più cellule T di 0,028% e 0,023% contro WA1/2020 e Omicron, rispettivamente, al mese 8 dopo la vaccinazione (Fig. 2a). Questi dati suggeriscono che le risposte dei linfociti T CD8 più specifiche di Omicron erano del 82-84 per cento di reattività crociata con le risposte dei linfociti T CD8 più WA1/2020-specifici. Le risposte delle cellule T CD4 più IFN-g specifiche per lo spigolo suscitate da Ad26.COV2.S erano una mediana di 0,026 percento, 0,030 percento e 0,029 percento rispetto a WA1/2020, Delta e Omicron, rispettivamente, e da BNT162b2 erano una mediana di 0,033 percento e 0,027 percento rispettivamente contro WA1/2020 e Omicron, indicando una sostanziale reattività incrociata anche delle risposte dei linfociti T CD4 più (Fig. 2b). È stata osservata anche una sostanziale reattività crociata di Omicron per le risposte delle cellule T CD8 plus e CD4 plus TNF-a e IL{94}} specifiche per Spike (dati estesi Fig. 2).

L'analisi di regressione lineare ha mostrato che le risposte delle cellule T CD8 più specifiche di Omicron erano correlate con le risposte delle cellule T CD8 più specifiche WA1/2020- per il vaccino Ad26.COV2.S per entrambi i punti temporali (R=0.78, P<0.0001, slope="" 0.75)="" and="" the="" bnt162b2="" vaccine="" (r="0.56,"><0.0001, slope="" 0.81),="" although="" two="" individuals="" had="" undetectable="" omicron-specific="" cd8+="" t="" cell="" responses="" following="" bnt162b2="" vaccination="" (fig.="" 3a).="" similarly,="" omicron-specific="" cd4+="" t="" cell="" responses="" correlated="" with="" wa1/2020-specific="" cd4+="" t="" cell="" responses="" for="" both="" the="" ad26.cov2.s="" vaccine="" (r="0.79,"><0.0001, slope="" 0.83)="" and="" the="" bnt162b2="" vaccine="" (r="0.90,"><0.0001, slope="" 0.88)="" (fig.3b).="" spike-specific="" ifn-g="" cd8+="" and="" cd4+="" t="" cell="" central="" memory="" and="" effector="" memory="" subpopulations="" elicited="" by="" ad26.cov2.s="" also="" showed="" extensive="" cross-reactivity="" to="" delta="" and="" omicron.="" at="" month="" 8,="" cd8+="" central="" memory="" responses="" were="" 0.076%,="" 0.054%,="" and="" 0.075%,="" cd8+="" effector="" memory="" responses="" were="" 0.168%,="" 0.143%,="" and="" 0.146%,="" cd4+="" central="" memory="" responses="" were="" 0.030%,="" 0.035%,="" and="" 0.038%,="" and="" cd4+="" effector="" memory="" responses="" were="" 0.102%,="" 0.094%,="" and="" 0.083%,="" against="" wa1/202,="" delta,="" and="" omicron,="" respectively="" (fig.="">

I nostri dati dimostrano che Ad26.COV2.S e BNT162b2 suscitano un'immunità cellulare ampiamente cross-reattiva contro le varianti SARS-CoV-2, incluso Omicron. La coerenza di queste osservazioni attraverso due diverse tecnologie di piattaforma vaccinale (vettore virale e mRNA) suggerisce la generalizzabilità di questi risultati. L'ampia reattività crociata delle risposte delle cellule T CD8 plus e CD4 plus specifiche per Omicron contrasta nettamente con le risposte anticorpali neutralizzanti e leganti marcatamente ridotte specifiche per Omicron. Questi dati sono coerenti con studi precedenti che mostrano una maggiore reattività crociata delle risposte immunitarie cellulari indotte dal vaccino rispetto alle risposte immunitarie umorali contro le varianti SARS-CoV-2 Alpha, Beta e Gamma12. La reattività crociata percentuale del 82-84 delle risposte dei linfociti T CD8 più a Omicron è coerente con le previsioni teoriche basate sulle mutazioni di Omicron6.

Studi preclinici hanno dimostrato che le cellule T CD8 più contribuiscono alla protezione contro SARS-CoV-2 nei macachi rhesus, in particolare quando le risposte anticorpali non sono ottimali5. Sono state riportate anche risposte durevoli dei linfociti T CD8 plus e CD4 plus a seguito di infezione e vaccinazione2- 4,6,9,11,13,14. Dato il ruolo dei linfociti T CD8 più nell'eliminazione delle infezioni virali, è probabile che l'immunità cellulare contribuisca sostanzialmente alla protezione del vaccino contro la grave malattia SARS-CoV-2. Ciò può essere particolarmente rilevante per Omicron, che elude una parte sostanziale delle risposte anticorpali. I nostri dati suggeriscono che gli attuali vaccini possono fornire una protezione sostanziale contro malattie gravi dovute alla variante SARS-CoV-2 Omicron nonostante la riduzione delle risposte anticorpali neutralizzanti e l'aumento delle infezioni rivoluzionarie.

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Metodi

Popolazione di studio

I campioni di individui che hanno ricevuto il vaccino BNT162b2 sono stati ottenuti dal biorepository dei campioni del Beth Israel Deaconess Medical Center (BIDMC). I campioni di individui che hanno ricevuto Ad26.COV2.S sono stati ottenuti dallo studio COV1001 (NCT04436276). Entrambi gli studi sono stati approvati dal comitato di revisione istituzionale del BIDMC. Tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato. Gli individui sono stati esclusi da questo studio se avevano una storia di infezioni da SARS-CoV- 2, hanno ricevuto altri vaccini COVID-19 o hanno ricevuto farmaci immunosoppressori. Saggio di anticorpi neutralizzanti lo pseudovirus

Gli pseudovirus SARS-CoV-2 che esprimono un gene reporter della luciferasi sono stati utilizzati per misurare gli anticorpi neutralizzanti gli pseudovirus. In breve, il packaging costruisce psPAX2 (AIDS Resource and Reagent Program), plasmide reporter della luciferasi pLentiCMV Puro-Luc (Addgene) e pcDNA3 che esprime la proteina spike.1-SARS-CoV-2 SΔCT erano co- trasfettato in cellule HEK293T (ATCC CRL_3216) con lipofectamina 2000 (ThermoFisher Scientific). Gli pseudovirus delle varianti SARS-CoV-2 sono stati generati utilizzando il ceppo WA1/2020 (Wuhan/WIV04/2019, ID accesso GISAID: EPI_ISL_402124), variante B.1.1.7 (Alpha, ID accesso GISAID: EPI_ISL_601443), variante B.1.351 (Beta, ID accesso GISAID: EPI_ISL_712096), B.1.617. 2 (Delta, ID accesso GISAID: EPI_ISL_2020950) o B.1.1.529 (Omicron, ID GISAID: EPI_ISL_7358094.2). I supernatanti contenenti i virus dello pseudotipo sono stati raccolti 48 ore dopo la trasfezione; i virus pseudotipo sono stati purificati mediante filtrazione con un filtro da 0,45-μm. Per determinare l'attività di neutralizzazione del siero umano, le cellule HEK293T-hACE2 sono state seminate in 96-piastre di coltura tissutale a una densità di 1,75 × 104 cellule per pozzetto durante la notte. Sono state preparate tre diluizioni seriali di campioni di siero inattivati ​​termicamente e mescolate con 50 ul di pseudovirus. La miscela è stata incubata a 37 gradi per 1 ora prima di essere aggiunta alle cellule HEK293T-hACE2. Dopo 48 ore, le cellule sono state lisate in Steady-Glo Luciferase Assay (Promega) secondo le istruzioni del produttore. I titoli di neutralizzazione SARS-CoV-2 sono stati definiti come la diluizione del campione alla quale è stata osservata una riduzione del 50% (NT50) in unità di luce relativa rispetto alla media dei pozzetti di controllo del virus.

Saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA)

Gli anticorpi leganti specifici del dominio di legame del recettore della punta (RBD) per SARS-CoV-2 nel siero sono stati valutati mediante ELISA. 96-piastre a pozzetti sono state rivestite con 2 ug/mL di SARS-CoV-2 WA1/2020, B.1.617.2 (Delta), B.1.351 (Beta) o B.1.1.529 (Omicron) proteina RBD in 1 × soluzione salina tamponata con fosfato Dulbecco (DPBS) e incubata a 4 gradi durante la notte. Dopo l'incubazione, le piastre sono state lavate una volta con tampone di lavaggio (0,05 percento di Tween 20 in 1 × DPBS) e bloccate con 350 μL di soluzione di blocco di caseina per pozzetto per 2-3 ore a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, la soluzione in blocco è stata scartata e le piastre sono state asciugate con un asciugamano. Diluizioni seriali di siero inattivato al calore diluito in blocco di caseina sono state aggiunte ai pozzetti e le piastre sono state incubate per 1 ora a temperatura ambiente, prima di altri 3 lavaggi e un'{31}}ora di incubazione con una diluizione 1:4000 di anti- perossidasi di rafano IgG umana (HRP) (Invitrogen, ThermoFisher Scientific) a temperatura ambiente al buio. Le piastre sono state lavate 3 volte e a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 100 μl di soluzione SeraCare KPL TMB SureBlue Start; lo sviluppo della piastra è stato interrotto aggiungendo 100 μl di soluzione SeraCare KPL TMB Stop per pozzetto. L'assorbanza a 450 nm, con un riferimento a 650 nm, è stata registrata con un lettore di micropiastre VersaMax (Molecular Devices). Per ciascun campione, il titolo dell'endpoint ELISA è stato calcolato utilizzando una curva logistica del parametro 4- adatta per calcolare la diluizione reciproca del siero che produce un valore di assorbanza corretto (450 nm-650 nm) di 0,2. Sono stati riportati i titoli degli endpoint interpolati.

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Saggio immuno-spot enzimatico (ELISPOT).

Le piastre ELISPOT sono state rivestite con anticorpo monoclonale IFN antiumano di topo di MabTech a 1 µg/pozzetto e incubate per una notte a 4 gradi. Le piastre sono state lavate con DPBS e bloccate con mezzi R10 (RPMI con FBS inattivato al 10% con 1% di penicillina-streptomicina 100x, HEPES 1M, piruvato di sodio 100mM, L-glutammina 200mM e 0,1% di 55mM 2-Mercaptoetanolo) per 2-4 ha 37 gradi . SARS-CoV-2 peptidi S raggruppati da SARS-CoV-2 WA1/2020, B.1.617.2 (Delta) o B.1.1.529 (Omicron) (biochimici del 21° secolo) sono stati preparati e piastrato a una concentrazione di 2 µg/pozzetto e 100,000 cellule/pozzetto sono state aggiunte alla piastra. I peptidi e le cellule sono stati incubati per 15-20 ha a 37 gradi. Tutti i passaggi successivi a questa incubazione sono stati eseguiti a temperatura ambiente. Le piastre sono state lavate con tampone di lavaggio ELISPOT e incubate per 2-4 h con un anticorpo monoclonale di topo biotinilato anti-IFN-umano di MabTech (1 µg/mL). Le piastre sono state lavate una seconda volta e incubate per 2-3 h con anti-biotina di capra coniugata AP di Rockland, Inc. (1,33 µg/mL). Il lavaggio finale è stato seguito dall'aggiunta di soluzione di substrato di cloruro di tetrazolio/5-bromo-4- cloro 3'indolilfosfato di p-toluidina (NBT/BCIP chromagen) per 7 min. Il cromogeno è stato scartato e le piastre sono state lavate con acqua e asciugate in un luogo buio per 24 h. Le piastre sono state scansionate e contate su un analizzatore di immunospot Cellular Technologies Limited.

Saggio di colorazione delle citochine intracellulari (ICS).

Le risposte delle cellule T CD4 plus e CD8 plus sono state quantificate mediante saggi di colorazione intracellulare di citochine (ICS) stimolati da peptidi in pool. I pool di peptidi contenevano 15 peptidi di aminoacidi sovrapposti da 11 aminoacidi che abbracciavano il SARS-CoV-2 WA1/2020, B.1.617.2 (Delta) o B.1.1 .529 (Omicron) Proteine ​​​​spike (biochimici del 21° secolo). 106 pozzetti di cellule mononucleate del sangue periferico sono stati risospesi in 100 µL di terreno R10 integrato con l'anticorpo monoclonale CD49d (1 µg/mL) e l'anticorpo monoclonale CD28 (1 µg/mL). Ciascun campione è stato valutato con mock (100 µL di R10 più 0,5 percento di DMSO; controllo di fondo), peptidi (2 µg/mL) e/o 10 pg/mL di forbol miristato acetato (PMA) e 1 µg/ml di ionomicina (Sigma- Aldrich) (100µL; controllo positivo) e incubato a 37 gradi per 1 h. Dopo l'incubazione, 0,25 µL di GolgiStop e 0,25 µL di GolgiPlug in 50 µL di R10 sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e incubati a 37 gradi per 8 ore e poi tenuti a 4 gradi durante la notte. Il giorno successivo, le cellule sono state lavate due volte con DPBS, colorate con colorante aqua live/dead per 10 minuti e quindi colorate con titoli predeterminati di anticorpi monoclonali contro CD279 (clone EH12.1, BB700), CD4 (clone L200, BV711), CD27 (clone M-T271, BUV563), CD8 (clone SK1, BUV805), CD45RA (clone 5H9, APC H7) per 30 min. Le cellule sono state quindi lavate due volte con tampone FBS/DPBS al 2% e incubate per 15 minuti con 200 µl di soluzione di fissazione/permeabilizzazione BD CytoFix/CytoPerm. Le cellule sono state lavate due volte con tampone Perm Wash 1X (BD Perm/WashTM Buffer 10X nel kit di fissazione/permeabilizzazione CytoFix/CytoPerm diluito con acqua MilliQ e passato attraverso un filtro da 0,22 µm) e colorate con intracellulare con anticorpi monoclonali contro IFN- (clone B27; BUV395) e CD3 (clone SP34.2, Alexa 700), per 30 min. Le cellule sono state lavate due volte con tampone Perm Wash 1X e fissate con 250 µl di formaldeide all'1,5% appena preparata. Le cellule fisse sono state trasferite su una 96-piastra a fondo tondo e analizzate dal sistema BD FACSymphony™. I dati sono stati analizzati utilizzando FlowJo v9.9.

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Riferimenti

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