Exogenous Wnt1 previene il danno renale acuto e la sua successiva progressione verso la malattia renale cronica

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Xue Hong^1†, Yanni Zhou^2†, Dedong Wang^3†, Fuping Lyu⁴, Tianjun Guan³, Youhua Liu^1,5e Liangxiang Xiao^3*

¹State Key Laboratory of Organ Failure Research, National Clinical Research Center of Kidney Disease, Divisionof Nephrology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, Cina,²Dipartimento di Nefrologia, XiamenHospital affiliato all'Università di Medicina Cinese di Pechino, Xiamen, Cina,³Dipartimento di Nefrologia, ZhongshanHospital affiliato alla Xiamen University, Xiamen, Cina,⁴Dipartimento di Endocrinologia e Diabete, Il Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Xiamen, Xiamen, Cina,⁵Dipartimento di Patologia, Università di Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, Stati Uniti

Gli studi suggeriscono che gli agonisti Wnt/ -catenina sono utili nel trattamento didanno renale acuto(AKI); tuttavia, rimane sfuggente sul suo ruolo nella prevenzione dell'AKI e sulla sua progressione verso la malattia renale cronica (CKD). In questo studio, la segnalazione renale di Wnt/-catenina è stata attivata dalla sovraespressione di Wnt1 esogeno o inibita dalla somministrazione di ICG-001, una piccola molecola inibitore della segnalazione di -catenina, i topi sono stati sottoposti a danno da ischemia/riperfusione (IRI) per indurre AKI e successiva CKD. I nostri risultati hanno mostrato che l'espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima di IRproteggeva i topi contro l'AKI e impediva la progressione dell'AKI in CKD nei topi, come evidenziato da analisi sia biochimiche del sangue che istologiche renali. Al contrario, il pretrattamento dell'ICG-001 prima dell'IR non ha avuto alcun effetto sulla segnalazione renale di Wnt/-catenina o sulla progressione dell'AKI a CKD. Meccanicamente, l'espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima dell'IR sopprimeva l'espressione delle proteine ​​​​proapoptotiche nei topi AKI e riduceva le risposte infiammatorie nei topi AKI e CKD. Inoltre, Wnt1 esogeno ha inibito l'apoptosi delle cellule tubulari indotta dal trattamento in vitro di ipossia-riossigenazione (H/R). Per concludere, il presente studio fornisce prove a sostegno dell'effetto preventivo dell'attivazione di Wnt/-catenina sull'AKI correlato a IR e sulla sua successiva progressione a CKD.

Parole chiave: danno renale acuto, malattia renale cronica, Wnt1, -catenina, danno da ischemia-riperfusione

Il trattamento didanno renale acuto(AKI): cistanche

INTRODUZIONE

Danno renale acuto (AKI)è una condizione clinica dovuta a una rapida perdita della funzione renale dovuta a varie lesioni, come farmaci, ischemia, sepsi e tossine (Chawla e Kimmel, 2012; Scholz et al., 2021). L'AKI è associata a un'elevata incidenza di morbilità e mortalità, responsabile di circa 2 milioni di decessi ogni anno in tutto il mondo (Belayev e Palevsky, 2014). In particolare, l'AKI è un predittore indipendente ben riconosciuto per lo sviluppo della malattia renale cronica (CKD) o della malattia renale allo stadio terminale (ESRD), che hanno posto un enorme onere economico sul sistema sanitario (Leung et al., 2013; Belayev e Palevsky, 2014; Kurzhagenet al., 2020). Sfortunatamente, non esistono farmaci efficaci per la prevenzione e il trattamento dell'AKI.

La segnalazione di Wnt/-catenina gioca un ruolo fondamentale nell'organogenesi, nell'omeostasi dei tessuti e nello sviluppo di varie malattie, comprese le malattie renali (Soni, 2021). -La catenina ha un duplice ruolo fungendo sia da proteina strutturale che da regolatore della trascrizione (MacDonald et al.,2009). La catenina legata alla membrana fa parte del complesso di giunzione aderente e contribuisce all'interazione cellula-cellula, mentre la catenina citosolica è fosforilata dalla glicogensintasi chinasi-3 (GSK-3) e mirata all'ubiquitinazione e alla degradazione del proteasoma. Tuttavia, tale degradazione della -catenina potrebbe essere salvata dai ligandi Wnt, una famiglia di glicoproteine ​​secrete con diverse attività biologiche. Il legame di Wnt stabilizza la -catenina, che traslocatesi nel nucleo e funge da fattore di trascrizione per la regolazione del genere. In particolare, la segnalazione di Wnt/-catenina è relativamente silenziata nei reni adulti illesi, ma viene riattivata durante il danno renale acuto e cronico (Huffstater et al., 2020). L'attivazione di Wnt/-catenina nella fase iniziale dell'AKI riduce il danno renale e favorisce il recupero della funzione renale, mentre l'attivazione prolungata di Wnt/-catenina potrebbe guidare la progressione da AKI a CKD (Xiao et al., 2016; Huffstater et al.,2020). Pertanto, la segnalazione di Wnt/ -catenina è un'arma a doppio taglio nel danno renale e merita una migliore comprensione. In particolare, rimane sfuggente sul ruolo dell'attivazione di Wnt/ -catenina nella prevenzione dell'AKI e della sua successiva progressione di AKI-CKD.

Il danno da ischemia-riperfusione renale (IRI) è considerato la principale causa di AKI. Pertanto, il modello animale dell'IRI renale è stato comunemente utilizzato per la ricerca della progressione di AKI e AKI-CKD (Bonventre e Yang, 2011). Entrambi gli approcci farmacologici e genetici sono stati utilizzati per chiarire il ruolo dell'attivazione di Wnt/-catenina nei modelli IRI di AKI e CKD, rispettivamente. Gli inibitori del litio e del GSK-3 sono comunemente usati per attivare farmacologicamente la segnalazione di Wnt/-catenina nei modelli preclinici di AKI, ma va notato i loro effetti indipendenti dalla catenina (Bao et al., 2014). Modificazioni genetiche di GSK{{9 }} , -catenin, o ligandi Wnt (Wnt1 e Wnt9a) sono stati usati per chiarire il ruolo dell'attivazione di Wnt/ -catenina in AKI e CKD (Bonventre and Yang, 2011; Bao et al., 2014; Zhou et al., 2013, 2018; Liuet al., 2020). Tuttavia, gli studi sul ruolo della segnalazione di Wnt/-catenin nella prevenzione dell'AKI sono piuttosto limitati. Il presente studio mirava a chiarire il ruolo della segnalazione di Wnt/-catenina nella prevenzione dell'AKI e della sua successiva progressione verso la CKD.

FIGURA 1|L'espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima dell'IR previene l'AKI e attiva la catenina renale nei topi

(A)Gruppi di trattamento del topo. I topi sono stati trattati con plasmide pcDNA3 (IRI più pcDNA3) o PHA-Wnt1 (IRI più PHA-Wnt1) tramite iniezione idrodinamica della vena della coda a 2 giorni prima del BIRI. Livelli di creatinina sierica(B)e livelli di azoto ureico (BUN).(C) sono stati misurati. (D) Micrografie rappresentative della morfologia renale a 1 giorno dopo BIRI. Le sezioni renali sono state sottoposte a colorazione con acido periodico-Schiff. Le aree inscatolate vengono ampliate. Le frecce indicano i tubuli renali. Barra della scala, 200 µm.(E, F)Analisi Western blot della catenina attiva nei topi renali. *P < 0.05="" rispetto="" ai="" controlli="" sham="" (n="5)." †p="">< 0,05="" rispetto="" a="" iri="" iniettato="" con="" plasmide="" pcdna3="" (n="">

Cistanche migliora la funzionalità renale

MATERIALI E METODI

Studio sugli animali

I topi maschi C57BL/6 del peso di circa 22–25 g sono stati acquistati da Vital River Laboratory Animal Technology (Pechino, Cina) e mantenuti nella struttura per animali (temperatura: 22 ± 2◦C, umidità: 60 ± 5 percento, ciclo buio/luce di 12 ore ) presso la Southern Medical University (Guangzhou, Cina) con acqua e cibo ad libitum. Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato per l'etica e il benessere degli animali presso la Southern Medical University. Tutti gli animali sono stati trattati secondo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

L'induzione di AKI e CKD nei topi è stata descritta nei nostri studi precedenti (Xiao et al., 2016; Zhou et al.,2018). Il danno da ischemia/riperfusione renale bilaterale (BIRI) è stato ampiamente utilizzato per indurre AKI nei topi, mentre aumenta la mortalità durante la progressione di AKI a CKD. Pertanto, l'ischemia/riperfusione renale unilaterale (UIRI) viene utilizzata per la ricerca sulla progressione dell'AKI a CKD. In breve, è stata praticata un'incisione addominale mediana nel topo in anestesia generale e i peduncoli renali bilaterali o sinistri sono stati ritagliati per 30 minuti utilizzando pinze per microaneurisma (articolo n. 18051-35; Fine ScienceTools, Cambridge, Regno Unito). Durante l'intervento, la temperatura corporea è stata mantenuta a circa 37–38°C utilizzando un sistema di riscaldamento a temperatura controllata.

Per valutare l'effetto preventivo dell'attivazione di Wnt/-catenina sull'AKI, i topi sono stati iniettati con 1 mg/kg di vettore di espressione Wnt1 marcato con emoagglutinina (HA) (PHA-Wnt1, UpstateBiotechnology) o un vettore vuoto (pcDNA3) 2 giorni prima BIRI utilizzando l'idrodinamico- tecnica di trasferimento genico basata come riportato in precedenza (Xiao et al., 2016). I tessuti del sangue e dei reni sono stati raccolti 1 giorno dopo il BIRI renale.

Per valutare l'effetto dell'attivazione precoce di Wnt/-catenina sulla progressione da AKI a CKD, i topi sono stati sottoposti a iniezione idrodinamica giornaliera nella vena della coda di plasmidi di espressione Wnt1 a 1 mg/kg o a iniezione intraperitoneale giornaliera di ICG-001({{4 }}, Chembest, Shanghai, Cina) a 5 mg/kg per 3 giorni prima dell'UIRI. I tessuti sanguigni e renali sono stati raccolti 11 giorni dopo l'UIRI. Nel nostro studio preliminare, 2 giorni di iniezione di Wnt1 potrebbero indurre l'espressione di Wnt1 nei topi AKI (dati non mostrati). Va notato che sono stati scelti 3 giorni di iniezione di Wnt1 per garantire e allungare l'espressione di Wnt1 durante la progressione di AKI a CKD.

Il danno renale acuto (AKI) è una condizione clinica dovuta a una rapida perdita della funzione renale

Coltura cellulare e trattamento

La linea cellulare epiteliale tubulare prossimale umana (HKC-8) è stata fornita dal Dr. L. Racusen presso la Johns Hopkins University (Baltimora, MD, Stati Uniti). Le colture cellulari sono state eseguite come precedentemente descritto (Zhou et al., 2013). Le cellule HKC-8 sono state trattate con Wnt1 ricombinante umano (SRP4754; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, Stati Uniti) a 100 ng/mL o ICG-001 (847591-62-2, Chembest, Shanghai , Cina) a 10 µM per 4 h. Le cellule sono state quindi incubate in una workstation per l'ipossia (X3-CK, Biospherix) all'1% di pO2 per 48 ore. Successivamente, le cellule sono state riossigenate per 2 ore prima della raccolta per varie analisi.

FIGURA 2|L'espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima dell'IR riduce l'apoptosi delle cellule tubulari e l'attivazione di NF-κB nei topi AKI

(A) Le micrografie rappresentative mostrano cellule TUNEL-positive in diversi gruppi come indicato. Le frecce indicano una colorazione positiva. Barra della scala, 100 µm.(B)La presentazione grafica mostra le cellule TUNEL-positive per campo ad alta potenza (HPF) in diversi gruppi come indicato.(C–F)Le analisi rappresentative di Western blot mostrano l'espressione renale di FasL, p53 e Bax in diversi gruppi come indicato. *P < 0.05="" contro="" i="" controlli="" sham;="" †p=""><0,05 rispetto="" a="" iri="" iniettato="" con="" plasmidi="" pcdna="" (n="">(G) Macchia occidentale rappresentativa delle proteine ​​p65 ep-p65 in diversi gruppi come indicato.

Saggio di apoptosi

Le cellule sono state tripsinizzate, raccolte e lavate con PBS.PE La colorazione con annessina V è stata eseguita secondo il protocollo del produttore. L'analisi citometrica è stata eseguita con un citometro a flusso (BD FACSCanto II, San Jose, CA, Stati Uniti) per misurare i tassi di apoptosi rilevando la quantità relativa di cellule PE annessina V positiva e 7- AAD negative. Ciascun test è stato eseguito in triplicato.

Test di creatinina e azoto ureico nel sangue

I livelli di creatinina nel siero e nelle urine, nonché i livelli di ureanitrogeno nel sangue (BUN) sono stati misurati utilizzando un analizzatore biochimico automatico (AU480, Beckman-Coulter Inc., Brea, CA, Stati Uniti).

Istologia e colorazione immunoistochimica

Le sezioni renali e la colorazione immunoistochimica sono state eseguite come descritto in precedenza (Liu et al., 2020). Gli anticorpi primari includevano anti-Wnt1 policlonale di coniglio (ab15251; Abcam, Inc.), anti{3}} catenina policlonale di coniglio (ab15180; Abcam, Inc. .) e antifibronectina policlonale di coniglio (F3648; Sigma-Aldrich).

Analisi Western Blot

L'analisi Western blot è stata eseguita come descritto in precedenza (Zhou et al., 2019). Gli anticorpi primari includevano l'antifibronectina policlonale di coniglio (F3648; Sigma-Aldrich), l'anticorpo monoclonale di topo anti- -catenina (610154; BD TransductionLaboratories), l'anticorpo monoclonale di topo anti- -SMA (A2547;Sigma-Aldrich), il coniglio anticorpo policlonale anti-Wnt1 (ab15251; Abcam), anticorpo murino- -tubulina (T9026; Sigma-Aldrich), anticorpo murino anti PAI-1 (AF3828;Sistemi R&D), anti-catenina anti-attiva(#05 –665; EMD Millipore), ligando anti-Fas (FasL) (SC -6237; Santa Cruz, CA, Stati Uniti), p53 (#2524S; CST), Bax (SC 20067; Santa Cruz), p65 ( #8242S; CST), p-p65 (#3033S; CST),PCNA (#2586S; CST).

Estrazione dell'RNA e analisi qPCR

L'isolamento totale dell'RNA e la qPCR sono stati eseguiti come descritto in precedenza. I livelli di mRNA di vari geni sono stati normalizzati con -actina. Le sequenze di primer dei geni sono elencate nella Tabella Supplementare 1.

FIGURA 3|L'espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima dell'IR impedisce la progressione dell'AKI in CKD nei topi

(A)Gruppi di trattamento del topo. I topi sono stati sottoposti a un'iniezione idrodinamica nella vena della coda di 1 mg/kg di plasmide pcDNA3 (IRI più pcDNA3) o PHA-Wnt1 (IRI più PHA-Wnt1), o a un'iniezione intraperitoneale di 5 mg/kg di ICG-001 a 3 giorni prima dell'UIRI . Sangue e tessuti sono stati raccolti 11 giorni dopo l'UIRI. Livelli di creatinina sierica(B) e livelli di azoto ureico (BUN).(C) sono stati misurati.(D) Micrografie rappresentative della morfologia renale a 11 giorni dopo l'UIRI. Le sezioni renali sono state sottoposte a colorazione periodica con acido-Schiff. Le aree inscatolate vengono ampliate. Le frecce indicano i tubuli renali. Barra della scala, 100 µm. *P < 0,05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

Analisi statistica

Tutti i dati sono stati espressi come media ± SEM. I dati sono stati analizzati statisticamente utilizzando il software Sigma Stat (Jandel ScientificSoftware, San Rafael, CA, Stati Uniti). Il confronto tra i gruppi è stato effettuato utilizzando l'ANOVA unidirezionale, seguito dal test Student-Newman-Keuls. P < 0.05="" è="" stato="" considerato="">

ERBA CISTANCHE BENEFICIO RENALE

RISULTATI

Espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima che l'IR prevenga il danno renale acuto e attivi la catenina renale nei topi

Per determinare il ruolo dell'attivazione di Wnt/-catenina nella prevenzione dell'AKI, i topi sono stati somministrati con un vettore di espressione Wnt1 marcato con HA (PHA-Wnt1) o con un vettore vuoto (pcDNA3) tramite iniezione idrodinamica della vena della coda 2 giorni prima del BIRI(Figura 1A). I livelli sierici di creatinina e BUN, due biomarcatori di danno renale, erano significativamente aumentati nei topi 1 giorno dopo il BIRI, suggerendo l'esistenza di AKI (Figure 1B, C). osservato in topi AKI(Figura 1D). In particolare, queste alterazioni nei biomarcatori del danno renale sierico e nelle lesioni morfologiche nei topi AKI sono state notevolmente attenuate dal Wnt1 esogeno. Western blotanalyses ha rivelato che il Wnt1 esogeno ha promosso l'espressione della catenina renale nei topi AKI(Figure 1E, F). Presi insieme, questi risultati suggeriscono che il pretrattamento del Wnt1 esogeno attiva la catenina renale e previene l'AKI nei topi.

L'espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima che l'IR riduca l'apoptosi delle cellule tubolari e inibisca l'attivazione del fattore nucleare-Kappa B

Per esplorare se la regolazione dell'apoptosi sia il meccanismo alla base dell'effetto protettivo del Wnt1 esogeno sull'AKI, è stata eseguita la colorazione TUNEL per identificare l'apoptosi nel tessuto renale dei topi AKI. Rispetto ai topi Sham, IRI ha notevolmente aumentato il tasso di apoptosi e i livelli di proteine ​​​​correlate all'apoptosi, come FasL, p53 e Bax, nei reni dei topi(Figure 2A–F). Tali alterazioni nei reni di topi AKI sono state notevolmente ridotte dall'espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima di IR. Il fattore nucleare-kappa B (NF κB), in particolare la sua forma eterodimerica p65/p50, svolge un ruolo fondamentale nella regolazione della risposta infiammatoria nei reni dei topi AKI. L'analisi Western blot ha mostrato che sia p65 che la sua forma fosforilata (p-p65) erano notevolmente aumentati nei reni dei topi dopo l'IRI, mentre tali alterazioni erano prevenute dal Wnt1 esogeno(Figura 2G). Questi risultati suggeriscono che l'espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima dell'IR previene l'apoptosi e inibisce i reni di attivazione di NF-κB dei topi AKI.

FIGURA 4|L'espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima dell'IR down-regola il Wnt1 e la -catenina endogeni nei reni dei topi dopo la progressione di AKI-CKD

(A)Le micrografie rappresentative mostrano l'espressione della proteina Wnt e -catenina in diversi gruppi come indicato. Barra della scala, 50 µm.(B–E)Analisi rappresentative occidentali dei livelli di proteina Wnt1, -catenina e attiva -catenina in diversi gruppi come indicato.(F) espressione di mRNA di TGF- in diversi gruppi come indicato.*P < 0.05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

Espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima che IR prevenga la progressione del danno renale acuto alla malattia renale cronica

Successivamente abbiamo esaminato se l'attivazione di Wnt/ -catenin prima dell'IR può prevenire la progressione dell'AKI in CKD. Come mostrato inFigura 3A, i topi sono stati sottoposti a iniezione nella vena della coda idrodinamica del plasmide di espressione Wnt1 (PHA-Wnt1) o all'iniezione intraperitoneale di ICG-001 a 3 giorni prima dell'UIRI. Sia la creatinina sierica che i livelli di BUN sono aumentati nei topi a 11 giorni dopo l'UIRI(Figure 3B, C). Inoltre, la colorazione tricromica di Masson ha rivelato una prominente deposizione di collagene renale e lesioni fibrotiche nei topi 11 giorni dopo l'UIRI(Figura 3D). Queste osservazioni indicano la progressione dell'AKI in CKD nei topi dopo l'UIRI. In particolare, le alterazioni osservate dei biomarcatori sierici della lesione renale e della fibrosi renale nei topi con insufficienza renale cronica sono state quasi completamente prevenute dal pretrattamento di Wnt1 esogeno, ma non dall'ICG-001. Pertanto, l'espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima di IR impedisce la progressione di AKI a CKD nei topi.

Espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima che IR down-regola la Wnt1 endogena e la -catenina nei reni

Abbiamo ulteriormente studiato l'effetto della segnalazione esogena Wnt1 endogena Wnt/ -catenina nei reni dei topi CKD. Come mostrato nella Figura 4A, la colorazione immunoistochimica ha rivelato che sia il Wnt1 endogeno che la -catenina erano notevolmente sovraregolati nei reni dei topi a 11 giorni dopo l'IRI. I loro livelli proteici sono stati notevolmente ridotti dal pretrattamento di Wnt1 esogeno, ma non di ICG-001. Le analisi Western blot hanno confermato l'effetto inibitorio del Wnt1 esogeno, ma non dell'ICG-001, l'espressione endogena di Wnt1, -catenina e reni di cateninina attiva di topi con insufficienza renale cronica (Figure 4B-E). Le vie di segnalazione Wnt/-catenina e TGF- diafonia nella fibrosi renale. L'espressione dell'mRNA di TGF- è stata indotta nei reni di topi CKD e tale induzione è stata ridotta dall'esogenoWnt1, ma non dall'ICG-001 (Figura 4F). Pertanto, il pre-trattamento di Wnt1 esogeno inibisce la segnalazione renale endogena di Wnt/-catenin nei topi con insufficienza renale cronica.

FIGURA 5 | L'espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima dell'IR sottoregola i geni bersaglio Wnt/-catenina renali nei topi dopo la progressione di AKI-CKD

(A, B) Espressione mRNA di PAI-1 e MMP-7 in diversi gruppi come indicato.(C–E)Analisi rappresentative di Western blot dei livelli di proteine ​​PAI-1 e Klotho.(F)mRNAespressione di Klotho. *P < {{0}}.05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

Espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima che IR sottoregola i geni bersaglio di RenalWnt/-catenina nei topi

Rispetto ai topi Sham, l'espressione dell'mRNA di PAI-1e MMP-7, due bersagli diretti a valle della segnalazione di Wnt/-catenin, era significativamente sovraregolata nei reni dei topi 11 giorni dopo l'UIRI(Figure 5A, B). Il pretrattamento di Wnt1 esogeno, ma non ICG-001, ha inibito l'espressione di mRNA di PAI-1 e MMP-7 nei topi con insufficienza renale cronica. L'analisi Western blot ha mostrato che i livelli di proteina PAI-1 erano aumentati nei reni di topi con insufficienza renale cronica, dove sono stati aboliti dal pretrattamento di Wnt1 esogeno, ma non di ICG-001(Figure 5C, D). Klotho è un antagonista Wnt anendogeno legandosi e sequestrando ligandi Wnt. Rispetto ai topi Sham, sia i livelli di mRNA che di proteine ​​di Klotho erano diminuiti nei reni dei topi a 11 giorni dopo l'UIR(Figure 5E, F). Il pre-trattamento di Wnt1 esogeno, ma non ICG-001, ha ripristinato quasi completamente l'mRNA di Klotho e l'espressione proteica nei reni di topi CKD. Questi risultati suggeriscono inoltre l'effetto inibitorio del Wnt1 esogeno sui reni di segnalazione di Wnt/-catenina endogeni di topi CKD.

Espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima che IR riduca la fibrosi renale nei topi dopo una lesione renale acuta: progressione della malattia renale cronica

Successivamente abbiamo studiato l'effetto dell'attivazione di Wnt/-catenina prima dell'IR sui geni della matrice renale e sulle lesioni fibrotiche nei topi con insufficienza renale cronica. Rispetto ai topi Sham, l'espressione dell'mRNA di fibronectina (FN), collagene I, collagene III e -SMA è stata notevolmente indotta nel reni di topi a 11 giorni dopo UIR(Figure 6A–D).Tali alterazioni sono state ridotte dal pretrattamento di esogenoWnt1, ma non ICG-001. L'analisi Western blot ha mostrato che i livelli proteici di FN e -SMA erano significativamente aumentati nei reni dei topi CKD e tali alterazioni sono state abolite dal pretrattamento del Wnt1 esogeno, ma non dell'ICG-001(Figure 6E–G). Gli effetti di Wnt1 e ICG esogeni-001 sull'espressione della proteina FN nei topi con insufficienza renale cronica sono stati convalidati mediante immunocolorazione renale con un anticorpo FN(Figura 6H). Questi risultati suggeriscono che il pre-trattamento del Wnt1 esogeno previene la fibrogenesi renale nei topi con insufficienza renale cronica indotta da IR.

FIGURA 6|L'espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima dell'IR riduce la fibrosi renale nei topi dopo la progressione di AKI-CKD

(A–D)Espressione di mRNA di fibronectina, collagene I, collagene III e -SMA.(E–G)Analisi rappresentative Western blot di fibronectina e livelli di proteine ​​-SMA-SMA.(H)Immunocolorazione delle sezioni renali di fibronectina. *P < {{0}}.05;="" **p="">< 0,01;="" †p="">< 0,05.="" n="5." barra="" della="" scala,="" 50="">

Espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima che l'IR attenui l'infiammazione renale Dopo un danno renale acuto - Progressione della malattia renale cronica

Rispetto ai topi Sham, l'espressione dell'mRNA di geni infiammatori, come IL-1, IL-6 e TNF-, era significativamente sovraregolata nei reni dei topi 11 giorni dopo l'UIR(Figure 7A–C). Tali alterazioni sono state quasi completamente abolite dal pretrattamento del Wnt1 esogeno, ma non dall'ICG-001. L'analisi Western blot ha mostrato che i livelli proteici sia di P65 che della sua forma fosforilata (p-p65) erano notevolmente aumentati nei reni dei topi a 11 giorni dopo UIRI, indicando l'attivazione della segnalazione NF-κB nei topi CKD(Figure 7D–F). In particolare, il pretrattamento di Wnt1 esogeno, ma non ICG-001, ha ridotto significativamente i livelli di proteine ​​p65 e p-p65 nel rene di topi con insufficienza renale cronica. Questi risultati indicano che il pretrattamento di Wnt1 esogeno previene le risposte infiammatorie renali nei topi con insufficienza renale cronica.

FIGURA 7|L'espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima dell'IR attenua l'infiammazione renale nei topi dopo la progressione di AKI-CKD

(A–C) Espressione di mRNA di IL-1, IL-6 e TNF- nei reni dei topi. (D–F)Analisi rappresentative di Western blot dei livelli di proteine ​​p65 e p-p65. *P < 0.05;="" **p="">< 0,01.="" n="">

Wnt1 esogeno protegge le cellule tubolari dall'apoptosi indotta da ipossia-riossigenazione in vitro

Per individuare ulteriormente il ruolo di Wnt1 nell'AKI, abbiamo stabilito modelli di cellule tubulari HKC-8 di AKI utilizzando il trattamento di riossigenazione dell'ipossia (H/R). La citometria a flusso è stata impiegata per rilevare l'apoptosi e ha rivelato l'aumento del tasso di apoptosi nelle cellule HCK 8 dopo il trattamento H/R(Figure 8A, B). L'apoptosi esogena Wnt1 ha notevolmente ridotto l'apoptosi nelle cellule HCK-8 dopo il trattamento con H/R. Le analisi con Western blot hanno mostrato che il trattamento con H/R ha aumentato significativamente i livelli di proteine ​​​​correlate all'apoptosi, come FasL, p54, Bax e Parp{{4} } nelle celle HCK-8(Figure 8C–G). Tali alterazioni sono state diminuite da Wnt1 esogeno. Questi dati suggeriscono che il Wnt1 esogeno protegge dall'apoptosi indotta da H/R nelle cellule tubulari.

FIGURA 8|Il Wnt1 esogeno protegge le cellule tubulari dall'apoptosi indotta dal danno da ipossia-riossigenazione (H/R) in vitro

(A)Le analisi FACS rappresentative mostrano che Wnt1 ha inibito l'apoptosi cellulare indotta dall'ipossia/riossigenazione (H/R). Le cellule HKC-8 sono state pre-espresse con Wnt1 esogeno, seguite da condizioni di incubazione inipossica per 48 ore e quindi riossigenazione per 2 ore.(B) Il graficola presentazione mostra la percentuale di cellule apoptotiche in diversi gruppi come indicato. Le cellule positive all'Annessina V marcate con PE sono state contate mediante citometria a flusso. *P < 0.05="" rispetto="" ai="" controlli;="" †p="">< 0,05="" rispetto="" a="" h/r="" (n="">(C) Le blotanalyses occidentali rappresentative mostrano l'espressione proteica di FasL, p53, Bax e Parp-1 nelle cellule HKC-8.(D–G)Le presentazioni grafiche mostrano le abbondanze relative di FasL, p53, Bax e Parp-1 nelle celle HKC-8. *P < 0.05="" rispetto="" ai="" controlli;="" †p="">< 0,05="" rispetto="" a="" h/r="" (n="">

DISCUSSIONE

Sebbene l'incidenza dell'AKI sia in aumento e sia il principale fattore di rischio per la progressione verso l'insufficienza renale cronica, non esistono terapie efficaci per la prevenzione e il trattamento dell'AKI. Un certo numero di situazioni, come la cardiochirurgia, i depositi intratubulari e la somministrazione di farmaci nefrotossici, potrebbero portare allo sviluppo di AKI (Mas-Font et al., 2017). Ciò evidenzia la necessità di misure preventive dell'AKI.

Sebbene numerosi studi sostengano gli effetti benefici dell'attivazione di Wnt/ -catenina nella patogenesi dell'AKI, rimane sfuggente l'effetto preventivo degli agonisti di Wnt/ -catenina sull'AKI. Una nuova scoperta nel presente studio è che l'espressione in vivo di Wnt1 esogeno prima dell'IR potrebbe proteggere i topi dall'AKI e prevenire la progressione dell'AKI in CKD. L'espressione in vivo di Wnt1 esogeno a 2 giorni prima dell'IR bilaterale renale è stata in grado di attivare la catenina renale, portando a una riduzione dell'apoptosi renale e dell'infiammazione nei topi AKI (1 giorno dopo l'IR). Inoltre, l'espressione in vivo di Wnt1 esogena a 3 giorni prima dell'inibizione dell'IR unilaterale renale Wnt/-cateninsignaling endogeno e ha impedito lo sviluppo di fibrosi renale nei topi CKD (11 giorni dopo IR). Al contrario, è stato dimostrato che l'espressione in vivo di Wnt1 esogeno a 5 giorni dopo l'IR renale induce l'attivazione della catenina e accelera la progressione dell'AKI alla CKD (Xiao et al., 2016). Questi studi suggeriscono che la tempistica degli agonisti Wnt/ -catenina è un fattore importante quando vengono utilizzati per la prevenzione e il trattamento dell'AKI.

Gli studi suggeriscono che l'attivazione prolungata della segnalazione di Wnt/-catenina potrebbe guidare la progressione dell'AKI a CKD. ICG 001 inibisce selettivamente la segnalazione della proteina legante Wnt/-catenina/CREB (CBP) ed è attualmente in uno studio clinico per vari tumori. In precedenza abbiamo dimostrato che la somministrazione di ICG-011a 5 giorni dopo l'IR ripristinava la funzione renale e impediva la progressione dell'AKI a CKD, come evidenziato dalla ridotta fibrosi renale (Xiao et al., 2016). Inoltre, la somministrazione di ICG-001 iniziata 3 giorni dopo l'ostruzione ureterale unilaterale (UUO) è stata in grado di attenuare le lesioni fibrotiche renali nei modelli UUO di topi CKD (Hao et al., 2011). Tuttavia, il presente studio ha dimostrato che il pretrattamento dell'ICG-001 a 3 giorni prima dell'IR non aveva alcun effetto sulla segnalazione renale di Wnt/-catenina o sulla progressione dell'AKI verso CKD. Ciò non sorprende perché la segnalazione di Wnt/-catenina è espressa a livelli molto bassi nei reni adulti illesi (Tanet al., 2014). Tuttavia, i nostri risultati suggeriscono che i tempi e la durata della somministrazione dell'ICG-001 sono fondamentali per determinarne l'esito terapeutico.

I meccanismi alla base dell'effetto protettivo di Wnt/-catenina possono coinvolgere la modulazione dell'apoptosi e delle vie di sopravvivenza. L'ablazione genetica del tubulo-catenina promuove l'apoptosi tubulare dopo il trattamento con IRI o acido folico, mentre l'attivazione di Wnt/-catenina sopprime le proteine ​​pro-apoptotiche (Wang et al. ,2009; Zhou et al., 2012). Nel presente studio, ExogenousWnt1 ha inibito marcatamente l'apoptosi delle cellule tubulari in entrambi i modelli IRImouse di AKI e modelli cellulari di AKI indotti da H/R. Ciò suggerisce che l'apoptosi potrebbe essere un potenziale meccanismo alla base dell'effetto preventivo di Wnt1 esogeno su AKI e AKI alla progressione di CKD. Il presente studio ha anche dimostrato un effetto inibitorio del Wnt1 esogeno sull'attivazione di NF-KB sia in AKI che in CKD, indicando la soppressione della risposta infiammatoria. Tuttavia, va notato che resta da stabilire se la ridotta infiammazione sia un effetto secondario alla protezione oi meccanismi di protezione mediati da Wnt1 esogeno. Sono necessari ulteriori studi per chiarire l'esatto meccanismo per la protezione esogena mediata da Wnt1-contro l'AKI e la prevenzione della progressione dell'AKI alla CKD.

Utilizzare i modulatori Wnt/-catenina per prevenire e trattare AKI e CKD

CONCLUSIONE

In conclusione, il presente studio fornisce le prove per supportare l'effetto preventivo dell'attivazione di Wnt/-catenina su AKI e CKD correlati a IR, sebbene sia necessario ulteriore lavoro per chiarire l'esatto meccanismo mediante il quale il Wnt1 esogeno protegge da AKI e CKD. Dato il duplice ruolo della segnalazione di Wnt/-catenina nell'AKI e CKD, il presente studio sottolinea l'importanza del timing quando si utilizzano modulatori Wnt/-catenina per la prevenzione e il trattamento dell'AKI. Sono necessari studi futuri che utilizzino più approcci farmacologici e genetici, nonché i tempi e la durata del trattamento ottimali per studiare l'effetto dei Wnt/ -cateninagonisti nella prevenzione e nel trattamento dell'AKI.

DA: Exogenous Wnt1 previene il danno renale acuto e la sua successiva progressione verso la malattia renale cronica, Xue Hong^1†, Yanni Zhou^2†, Dedong Wang^3†, Fuping Lyu⁴, Tianjun Guan³, Youhua Liu^1,5e Liangxiang Xiao^{3 *}

Davanti. Physiol., 08 novembre 2021|https://doi.org/10.3389/fphys.2021.745816