Cistanche può proteggere il danno renale da ischemia-riperfusione

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Jan H. Lindeman1, Leonie G. Wijermars1, Sarantos Kostidis2, Oleg A. Mayboroda2, Amy C. Harms3 et al.

La funzione di innesto ritardato è lamanifestazione di danno da ischemia da riperfusionenell'ambito del trapianto di rene. Mentre centinaia di interventiridurre con successo il danno da ischemia da riperfusionenei modelli sperimentali, tutti gli interventi clinici hanno fallito. Questa valutazione clinica esplorativa ha esaminato le possibili origini metaboliche del danno da riperfusione da ischemia clinica combinando i dati di 18 biopsie tissutali pre e post-riperfusione con 36 prelievi di sangue arterovenoso sequenziale sull'innesto in tre gruppi di studio. Questi gruppi includevano innesti di donatori vivi e deceduti con e senza funzione ritardata dell'innesto. L'allocazione del gruppo si basava sui risultati clinici. L'NMR ad angolo magico è stato utilizzato per l'analisi dei tessuti e le piattaforme basate sulla spettrometria di massa sono state utilizzate per l'analisi del plasma. Tuttorenierano funzionanti per un anno. L'integrazione dei dati metabolomici ha identificato un profilo discriminatorio per riconoscere la futura funzione ritardata dell'innesto. Questo profilo era caratterizzato dal catabolismo post-riperfusione di ATP/GTP (recupero della fosfocreatina notevolmente ridotto e significativa produzione persistente (ipo)xantina) e da un significativo danno tissutale in corso. Il mancato recupero del fosfato ad alta energia si è verificato nonostante la glicolisi attivata, l'ossidazione degli acidi grassi, la glutamminolisi e l'autofagia e correlato a un difetto a livello del complesso di oxoglutarato deidrogenasi nel ciclo di Krebs. Funzionalità dell'innesto ritardata clinica a causa di un danno da riperfusione da ischemia associato a un collasso metabolico post-riperfusione. Pertanto, gli sforzi per estinguere la funzione ritardata dell'innesto a causa del danno da riperfusione ischemica dovrebbero concentrarsi sulla conservazione della competenza metabolica, preservando l'integrità del ciclo di Krebs e/o reclutando percorsi di salvataggio metabolico. Kidney International (2020) 98, 1476–1488; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.07.026

PAROLE CHIAVE: ATP; funzione di innesto ritardata; glicolisi; danno da ischemia da riperfusione; metabolismo; fosforilazione ossidativa

effetti cistance: preveniredanno da ischemia-riperfusione

danno da ischemia da riperfusione (IRI)è il fenomeno dell'aumento del danno tissutale dopo la riperfusione di tessuto precedentemente ischemico.1,2 È il principale fattore che contribuisce al danno d'organo dopo infarto miocardico o cerebrale3 e al danno del trapianto dopo il trapianto d'organo.4 Sebbene una miriade di interventi estingue l'IRI nei modelli preclinici, il successo clinico rimane da raggiungere.3,4 Pertanto, appare un divario traslazionale tra i modelli preclinici e il contesto clinico.

La funzione ritardata dell'innesto (DGF) è la manifestazione dell'IRI nel contesto direnetrapianto.5 Il DGF è definito come la necessità di dialisi nella prima settimana o settimane dopo il trapianto.6 Sebbene il DGF sia estremamente raro nel contesto delle procedure di trapianto da donatore vivente, colpisce fino al 90% dei trapianti di trapianto da donatore deceduto.6 Precedente il lavoro ha dimostrato un'associazione tra DGF incidente e glicolisi normossica post-riperfusione.7 Questa osservazione implica che il DGF si riferisca a un difetto nell'omeostasi energetica dell'innesto a causa di una disfunzione mitocondriale nella fase di riperfusione.7 Su questa base, abbiamo ipotizzato che il DGF clinico coinvolga e può essere guidato da un difetto (o difetti) metabolico. L'obiettivo di questo studio era di eseguire un'analisi approfondita delle risposte metaboliche aischemia-riperfusionecon e senza IRI (DGF). Questa valutazione metabolica esplorativa si basa su un approccio integrato e risolto nel tempo che prevedeva la valutazione sequenziale delle differenze di concentrazione arterovenosa (AV) rispetto agli innesti riperfusi e la profilazione parallela delle biopsie dell'innesto (tessuto). Sono stati inclusi tre gruppi di studio: innesti da innesti di donatori deceduti con e senza IRI successivi e innesti di donatori viventi. L'assegnazione di gruppo degli innesti di donatori deceduti (rispettivamente þDGF e –DGF) è stata effettuata retrospettivamente sulla base del loro esito clinico. Gli innesti da donatore vivente sono stati inclusi come riferimento perché questi innesti sono associati a un recupero funzionale istantaneo dopo la riperfusione. Per coprire gli aspetti primari dell'omeostasi metabolica, l'attenzione in questo studio era sui seguenti cluster metabolici grossolani: metabolismo del nucleotide trifosfato, ossidazione degli acidi grassi (b), glicolisi/glutamminolisi, autofagia, ciclo di Krebs (difetti) e danno cellulare. I dati sono presentati di conseguenza.

(Corrispondenza: Jan H. Lindeman, Department of Surgery, Leiden University Medical Center, PO Box 9600, 2300 RC Leiden, The Netherlands. E-mail: Lindeman@lumc.nl Ricevuto il 20 gennaio 2020; revisionato l'8 giugno 2020; accettato il 2 luglio 2020; pubblicato online l'8 agosto 2020)

effetti cistance: preveniredanno da ischemia-riperfusione

RISULTATI

Il campione di studio comprendeva 53 pazienti. Biopsie tissutali accoppiate sono state ottenute da 18 pazienti e il campionamento AV sequenziale è stato eseguito in 36 pazienti. Un paziente ha effettuato entrambe le biopsie ed è stato sottoposto a campionamento AV. I dettagli clinici per i 3 gruppi di studio sono mostrati nella Tabella Supplementare S1A (biopsie tissutali) e S1B (campionamento AV). Tutti i casi di DGF hanno richiesto dializzazioni multiple in un arco di tempo di almeno 7 giorni e tutti hanno mostrato un adeguato recupero funzionale. Nessuno dei donatori deceduti senza DGF ha richiesto la dialisi dopo il trapianto. La sopravvivenza del trapianto a un anno era del 100%.

Per prima cosa abbiamo esplorato le differenze presunte nelle firme metaboliche per i 3 gruppi di donatori (gli innesti di donatori viventi [di riferimento], gli innesti di donatori deceduti -DGF e gli innesti di donatori deceduti þDGF [IRI]) mappando il metaboloma plasmatico (differenze AV) per il { {1}}minuti post-riperfusione (Figura 1a) e ilmetaboloma tissutale(biopsie tissutali) per i 40-minuti post-riperfusione (Figura 1b). Questi punti temporali sono stati scelti per evitare interferenze dovute al dilavamento dei metaboliti che si sono accumulati durante l'ischemia o la conservazione a freddo, o che erano costituenti del liquido di conservazione (p. es., il lavaggio dell'istidina da innesti di donatori viventi; la figura supplementare S1 mostra l'uso selettivo di H [istidina] Fluido di conservazione TK in questi innesti).7 I risultati (punteggi z) per questi punti temporali sono riassunti nelle mappe di calore nella Figura 1a (differenze AV) e 1b (tessuto). Il raggruppamento dei dati è stato eseguito in base ai 6 cluster che coprono tutti i dati metabolici: (i) catabolismo del nucleoside trifosfato, (ii) b-ossidazione, (iii) glicolisi/glutamminolisi, (iv) autofagia, (v) difetti del ciclo di Krebs, e (vi) danno cellulare.

Le mappe di calore per le differenze AV indicano firme metaboliche parallele per il donatore vivente e gli innesti -DGF e una firma chiaramente distintiva per gli innesti þDGF (Figura 1a). Un modello simile, sebbene meno pronunciato, è stato osservato per i metaboliti tissutali (Figura 1b). La mappatura esclusiva degli innesti –DGF e þDGF (senza l'innesto del donatore vivente) ha portato a conclusioni simili (non mostrate), indicando che l'inclusione dei dati del donatore vivente (riferimento) nell'analisi non ha interferito con le conclusioni dell'analisi. Collettivamente, i dati forniscono una firma metabolica grossolana per l'IRI renale.

Per motivi di chiarezza, i dati dei singoli metaboliti sono presentati in termini di 6 cluster metabolici. Per evitare l'interferenza con l'eliminazione iniziale dei metaboliti che si sono accumulati durante la conservazione a freddo entro i primi minuti di riperfusione, le stime per il rilascio o l'assorbimento netto post-perfusione si basano sull'integrazione delle differenze AV da 10-a {{3 }}minuti intervalli di tempo post-riperfusione (area tra le curve).

Il primo gruppo di metaboliti ("catabolismo del nucleoside trifosfato") segnala apost-riperfusione persistenteincompetenza metabolica ("spegnimento dell'alimentazione") negli innesti con DGF successivo (þDGF). Questa conclusione si basa sull'alterato recupero post-riperfusione della fosfocreatina tampone fosfato ad alta energia negli innesti þDGF (P < 0.001;="" figura="" 2a)="" e="" sul="" post="" persistente="" -="" catabolismo="" di="" riperfusione="" adenosina="" trifosfato/guanosina="" trifosfato="" (atp/gtp).="" quest'ultimo="" si="" riflette="" nel="" rilascio="" continuo="" (differenze="" av)="" di="" ipoxantina="" e="" xantina="" (figure="" 2b="" e="" c,="" p=""><0,0001 e="" 0,02,="" rispettivamente),="" i="" prodotti="" di="" degradazione="" terminale="" di="" atp="" e="" gtp="" da="" questi="" innesti.="" i="" dati="" per="" le="" biopsie="" tissutali="" pre-riperfusione="" hanno="" mostrato="" gradi="" graduali="" di="" accumulo="" di="" inosina="" e="" ipoxantina="" al="" termine="" del="" periodo="" di="" conservazione="" ischemica,="" con="" il="" contenuto="" più="" basso="" trovato="" nei="" vivi="" e="" il="" più="" alto="" negli="" innesti="" di="" donatori="" deceduti="" (figura="" 2d="" ed="" e).="" dopo="" la="" riperfusione="" (t="" ¼="" 40="" min)="" il="" contenuto="" di="" tessuto="" di="" ipoxantina="" e="" inosina="" era="" simile="" e="" basso="" in="" tutti="" e="" 3="" i="" gruppi="" di="" donatori="" (figura="" 2d="" ed="">

Il catabolismo dell'ATP post-riperfusione negli innesti þDGF si è verificato nonostante un apparente ripristino post-riperfusione dell'ossidazione b degli acidi grassi (Figura 2 supplementare), glicolisi/glutaminolisi attivata (Figura 3) e autofagia (Figura 4). Tutti e 3 i tipi di innesto hanno mostrato il ripristino uniforme del contenuto di b-idrossibutirrato tissutale (Figura supplementare S2A) e la clearance selettiva (assorbimento) degli acidi grassi a catena media (C8–C12) dalla circolazione (Figure supplementari S1 e S2B–E), indicando uniformità ripristino della b-ossidazione. Tuttavia, l'accumulo di tessuto di acetil-carnitina negli innesti di donatori deceduti –DGF e þDGF (Figura supplementare S2F) e il washout (differenze AV) di acetilcarnitina dagli innesti þDGF (Figura supplementare S2G, P < 0.03)="" implicano="" difetti="" graduali="" nello="" smaltimento="" dei="" gruppi="" acetilici="" formati="">

Cistanche alle erbe

La mappatura delle reti di glicolisi / glutamminolisi (Figura 3) ha mostrato livelli di glucosio nei tessuti uguali (Figura 4a) e ha confermato la glicolisi normossica post-riperfusione persistente come caratteristica esclusiva degli innesti di donatori þDGF (vale a dire rilascio persistente di lattato e piruvato (Figura 3b e c, P<0.0001 and=""><0.04, respectively)="" and="" release="" of="" the="" transamination="" products="" alanine="" and="" aspartate="" (figure="" 3e="" and="" f,="" p="" <="" 0.02="" and="" <="" 0.0001,="" respectively).="" serine="" (figure="" 4b)="" and="" phosphoserine="" (supplementary="" figure="" 3d)="" released="" from="" þdgf="" grafts="" may="" (partially)="" reflflect="" transamination="" of="" the="" glycolysis="" intermediate="" phosphoglycerate.="" persistent="" post-reperfusion="" glutamate="" release="" (figure="" 3k,="" p="" <="" 0.002),="" selective="" release="" of="" the="" transamination="" products="" alanine="" and="" aspartate="" (figure="" 3e="" and="" f),="" and="" exhaustion="" of="" the="" tissue="" asparagine="" pool="" (figure="" 3j,="" p="" <="" 0.03)="" in="" þdgf="" grafts="" imply="" continued="" post-reperfusion="" glutaminolysis="" (alanine)="" and="" glutamine="" shuttling="" (asparagine="" aspartate)8="" in="" the="" post-reperfusion="" phase="" of="" these="" grafts.="" moreover,="" the="" exclusive="" release="" of="" serine,="" methionine,="" and="" tyrosine="" (figure="" 4a–c,="" all="" ps="" <="" 0.0005),="" along="" with="" disposal="" of="" butyryl="" carnitine="" and="" isovaleryl="" carnitine="" (figure="" 4d="" and="" e,="" p=""><0.006 and=""><0.003, respectively),="" deamination="" products="" of="" the="" branched-chain="" amino="" acids9,10="" from="" þdgf="" grafts,="" but="" not="" from="" the="" other="" graft="" types="" (figure="" 4a–e),="" implies="">post-riperfusioneautofagia in questi innesti.11.

Figura 1|Mappe di calore raggruppate per le differenze di concentrazione del metabolita arterioso-venoso sull'innesto del donatore a 30 minuti e il contenuto del metabolita tissutale 40 minuti dopo la riperfusione. (a) Mappa termica raggruppata per le concentrazioni del metabolita arterioso-venoso a t ¼ 30 minuti dopo la riperfusione. Le colonne rappresentano i 3 gruppi di donatori (innesti di donatori viventi [gruppo di riferimento, n ¼ 10]; innesti di donatori deceduti senza successiva funzione dell'innesto ritardata [DGF {–DGF, n ¼ 10}] e innesti di donatori deceduti con DGF successiva [þDGF, n¼ 16]). I composti sono raggruppati in base ai 5 cluster metabolici e, all'interno di ciascun cluster, classificati in base allo z-score del gruppo dei donatori viventi. Il verde riflette l'assorbimento netto da parte dell'innesto e il rosso riflette il rilascio netto dall'innesto. (continua)

Figura 1 (continua) (b) Mappa termica raggruppata per metaboliti tissutali identificati nell'analisi di risonanza magnetica nucleare dell'angolo magico HR delle biopsie dell'innesto prelevate 40 minuti dopo la riperfusione. Le colonne rappresentano i 3 gruppi di donatori (gruppo di donatori viventi [gruppo di riferimento, n ¼ 6, innesti di donatori deceduti senza DGF successivo [–DGF, n ¼ 6] e innesti di donatori deceduti con DGF successivo [þDGF, n ¼ 6]). Il rosso riflette un contenuto di tessuto al di sopra e il verde riflette un contenuto di tessuto al di sotto della media geometrica dei 3 gruppi.

Accumulo di acetil-carnitina post-riperfusione (tessuto) negli innesti –DGF e þDGF (Figura 2f) e rilascio di acetilcarnitina iniziale (trapianti da donatore vivente e –DGF) e continuato (innesti þDGF) (P < 0.{{10="" }}="" 3)="" indicano="" uno="" smaltimento="" transitorio="" (innesti="" –dgf)="" o="" persistente="" (innesti="" þdgf)="" alterato="" dell'acetil-coenzima="" a="" dopo="" la="" riperfusione="" (figura="" 2g="" supplementare).="" sebbene="" questo="" accumulo="" possa="" derivare="" da="" una="" glicolisi="" esagerata="" e="" da="" una="" b-ossidazione,="" può="" anche="" indicare="" uno="" smaltimento="" ridotto="" dell'acetile="" a="" causa="" di="" difetti="" del="" ciclo="" di="" krebs.="" per="" gli="" innesti="" þdgf,="" quest'ultimo="" meccanismo="" è="" supportato="" dal="" rilascio="" selettivo="" e="" persistente="" dell'a-chetoglutarato="" intermedio="" del="" ciclo="" di="" krebs="" (figura="" 5c,="" p=""><0,0005) come="" caratteristica="" esclusiva="" di="" questi="" innesti="" e="" da="" un="" recupero="" alterato="" del="" tessuto="" succinato="" negli="" innesti="" þdgf="" (figura="">

Un ultimo gruppo di metaboliti discriminatori si riferisce al danno cellulare in corso. Questo cluster include ilpost-riperfusionerilascio di uracile, un marcatore consolidato di danno cellulare12,13 (Figura supplementare S3A, P < 0.0001)="" e="" di="" derivati="" ​​amminoacidici="" che="" si="" associano="" a="" l'idrolisi="" dei="" plasmalogeni="" (vale="" a="" dire="" fosfo-etanolamina,="" etanolamina="" e="" fosfo-serina;="" figura="" supplementare="" s3bd,="" p=""><0.001; figura="" supplementare="" s1).="" sebbene="" non="" fossero="" presenti="" differenze="" av="" per="" la="" colina="" nel="" gruppo="" þdgf="" (p="0,60)," questa="" osservazione="" è="" in="" contrasto="" con="" un="" assorbimento="" netto="" di="" colina="" nel="" donatore="" vivente="" e="" nel="" gruppo="" -dgf="" (p=""><0,0001 e="" 0,02,="" rispettivamente).="" quindi,="" negli="" innesti="" þdgf,="" l'idrolisi="" dei="" plasmalogeni="" della="" colina="" può="" essere="" mascherata="" dall'assorbimento="" della="" colina.="" tale="" meccanismo="" è="" supportato="" dal="" rilascio="" selettivo="" e="" progressivo="" di="" betaina,="" il="" prodotto="" di="" ossidazione="" della="" colina14="" nel="" gruppo="" þdgf="" (figure="" supplementari="" s3g,="" p=""><>

Le osservazioni precedenti associano l'IRI incidente a persistentepost-riperfusioneCatabolismo dell'ATP e danno cellulare in corso nel contesto dell'insufficienza mitocondriale e dell'attivazione delle vie glicolitiche e lipolitiche (Figura 6). Considerando il ruolo vitale dell'ATP nell'omeostasi cellulare e nella sopravvivenza, si è ritenuto vantaggioso il reclutamento di vie rigenerative ausiliarie dell'ATP (cioè indipendenti dalla respirazione mitocondriale). In questo contesto, abbiamo considerato l'inosina, un nucleoside che può generare ATP attraverso percorsi non tradizionali. Come mostrato nella Figura 7, né la somministrazione di inosina preventiva né quella di salvataggio (in concentrazioni fino a 10 mMol/l) hanno salvato l'esaurimento dell'ATP in seguito alla paralisi metabolica indotta chimicamente.

Figura 3|Glicolisi post-riperfusione e glutamminolisi. Curve per le differenze venose arteriose (la curva rossa è arteriosa, la curva blu è venosa). Biopsie tissutali (grafici a barre): le barre bianche rappresentano le biopsie pre-riperfusione; le barre grigie rappresentano le biopsie post-riperfusione (t ¼ 40 min dopo la riperfusione). *P < 0,05.="" (a)="" contenuto="" di="" glucosio="" nei="" tessuti.="" (b–i)="" intermedi="" della="" glicolisi:="" lattato,="" piruvato,="" alanina,="" aspartato="" e="" asparagina.="" (k,l).="" glutaminolisi="" intermedi="" glutammina="" e="" glutammato.="" risonanza="" magnetica="" nucleare="" tissutale="" (nmr;="" n="" ¼="" 6="" per="" gruppo):="" (a)="" recupero="" del="" glucosio="" tissutale="" nel="" donatore="" vivente.="" (d,="" f,="" h)="" il="" contenuto="" di="" tessuto="" stabile="" di="" lattato,="" alanina="" e="" aspartato="" riflette="" il="" dilavamento="" di="" questi="" intermedi="">

Figura 3 (continua) dal rene. (j) Asparagina tissutale non misurabile in þ biopsie post-riperfusione con funzione di innesto ritardato (DFG). Differenze di concentrazione arterioso-venosa (AV) (n ¼ 10, 10 e 16 nei gruppi viventi, –DGF e þDGF, rispettivamente): (b,c) lattato post-riperfusione persistente (P < 0.0001)="" e="" piruvato="" (p="">< 0,04)="" si="" liberano="" da="" questi="" innesti.="" (e)="" alanina="" (p=""><0,02), (g)="" acido="" aspartico="" (p=""><0,0001) e="" (þk)="" rilascio="" di="" glutammato="" (funzione="" dell'innesto="" ritardata="" (innesti="" dgf="" che="" indicano="" glicolisi="" normossica="" in="" p=""><0,002) da="" innesti="" þdgf="" indicano="" un'ossidazione="" della="" glutammina="" in="" corso="" in="" questi="" innesti="" non="" sono="" state="" osservate="" differenze="" av="" significative="" per="" la="" glutammina="">

effetti cistance: preveniremalattie renali

DISCUSSIONE

Da questo studio, condotto nell'ambito del trapianto clinico di rene, emerge il quadro che l'IRI (DGF) è una conseguenza di un fallimento post riperfusione quasi istantaneo e persistente della fosforilazione ossidativa e della glicolisi normossica attivata che non è in grado di sostenere l'omeostasi energetica. A loro volta, i pool di fosfati ad alta energia si esauriscono progressivamente e l'integrità cellulare non può essere preservata, con conseguente danno tissutale in corso.

Questo studio clinico si basa sull'integrazione dei dati metabolici derivati ​​da biopsie tissutali effettuate immediatamente prima e 40 minuti dopo la riperfusione e dalla valutazione sequenziale delle differenze AV sull'innesto riperfuso. Queste differenze AV non solo forniscono un'indicazione per il ritmo e la durata dei (mal)adattamenti metabolici, ma consentono anche di dirigere le tendenze osservate nelle biopsie tissutali accoppiate e di valutare la clearance del metabolita di (p. es., lattato) o l'assorbimento da (p. es., medio -acidi grassi a catena) la circolazione.15,16 La risoluzione dell'approccio AV è chiaramente illustrata dai dati sull'acilcarnitina, che non solo mostrano un assorbimento selettivo degli acidi grassi a catena media ma suggeriscono anche che le specie insature di carnitina C14 tetradecenoil e tetradecadienil carnitina si comportano in modo simile agli acidi grassi a catena media (dati supplementari S1) e potrebbero non fare affidamento su specifici trasportatori di acidi grassi.17 Infatti, nel processo di analisi dei dati, è stato osservato che il solo affidamento sulle biopsie tissutali avrebbe oscurato la maggior parte delle conclusioni in questo studio perché la maggior parte dei metaboliti formati vengono eliminati in modo efficiente nella circolazione. Concentrazioni ematiche arteriose stabili mostrano che l'omeostasi del sangue viene mantenuta e, di conseguenza, i metaboliti rilasciati o assorbiti vengono effettivamente eliminati o reintegrati altrove.15,16 Contenuto di tessuto stabile osservato, ma chiare differenze AV mettono in dubbio la validità delle valutazioni metabolomiche basate sui tessuti. Si noti che, nel contesto dei reni di donatori deceduti e del periodo di tempo dello studio, la clearance urinaria non è un fattore di interferenza perché tutti gli innesti di donatori deceduti erano anurici per l'intervallo di misurazione 40- minuto.

La mappatura dei dati identifica un'impronta metabolica completamente discriminatoria per l'IRI. In particolare, la fase di riperfusione degli innesti con futuro DGF è uniformemente e distintamente caratterizzata da fosforilazione ossidativa gravemente compromessa (ipossia istotossica)18 e glicolisi normossica compensatoria che non è in grado di sostenere la rigenerazione dell'ATP. Quest'ultima conclusione si basa sul recupero incompleto del tampone fosfato ad alta energia fosfocreatina19 e sul persistente catabolismo post-riperfusione di ATP/GTP riflesso dal rilascio continuo di (ipo)xantina. Infatti, l'approssimazione delle perdite di adenosina per gli innesti þDGF sulla base del rilascio di ipoxantina (differenze AV) nei 30 minuti dopo la riperfusione (approssimazione basata sulle velocità di flusso riportate dopo la riperfusione,20 mediatessuto renalemassa,21 e contenuto renale di ATP22) suggerisce un esaurimento prossimo all'esaurimento del pool di ATP del trapianto in 30 minutipost-riperfusione. L'esaurimento critico del pool di ATP può comportare un blocco catabolico che rende la cellula insensibile al ristabilimento delle forze protoniche motrici che guidano la generazione di ATP, rendendo la cellula insensibile alle strategie di salvataggio.

Il deficit di ATP post-riperfusione e l'ipossia istotossica negli innesti þDGF possono essere alla base del rilascio selettivo di aminoacidi associati all'idrolisi dei fosfolipidi (plasmalogeni) negli innesti þDGF. Studi sperimentali hanno identificato l'idrolisi dei plasmalogeni e dei fosfolipidi come una caratteristica precoce dell'ipossia tissutale,23 e l'idrolisi dei plasmalogeni è stata descritta nel contesto del danno renale ischemico.24 Meccanicamente, questo fenomeno è stato collegato alla traslocazione della membrana e all'attivazione di un calcio citosolico fosfolipasi A2 indipendente risultante dalla formazione di un complesso guidato dall'ipossia tra la fosfolipasi e un elemento regolatore della fosfofruttochinasi.25,26 L'inversione dell'ipossia o del trattamento con ATP dissocia il complesso fosfolipasi-fosfofruttochinasi e abolisce l'attività della fosfolipasi. Si noti che la dinamica della cessazione post-riperfusione del rilascio di (fosfo-) etanolamina dal donatore vivente e dagli innesti -DGF, nonché il rilascio persistente negli innesti þDGF, possono riflettere diversi gradi e tassi di recupero metabolico. Tuttavia, mentre i rapporti precedenti implicano un ruolo di una fosfolipasi citosolica indipendente dal calcio A2,25,26, le differenze AV osservate per la betaina e la (fosfo-)etanolamina implicano un'attivazione più completa delle fosfolipasi che coinvolge anche le fosfolipasi di tipo C (fosfo-etanolamina) e D-fosfolipasi (etanolammina/colina). Allo stesso modo, l'esaurimento dell'asparagina tissutale (Figura 4j) e il rilascio di aspartato (Figura 4g) dagli innesti þDGF possono riflettere l'attività ridotta dell'asparagina sintasi a causa dell'esaurimento dell'ATP.

Figura 4|Autofagia post-riperfusione attivata negli innesti D con funzione di trapianto ritardato (DGF).. Curve per le differenze arteriose-venose (la curva rossa è arteriosa, la curva blu è venosa). Biopsie tissutali (grafici a barre): le barre bianche rappresentano le biopsie pre-riperfusione; le barre grigie rappresentano le biopsie post riperfusione (t ¼ 40 min dopo la riperfusione). *P < 0,05.="" (a–c)="" rilascio="" post-riperfusione="" di="" metionina,="" serina="" e="" tirosina="">

Figura 5|Difetto del ciclo di Krebs post-riperfusione negli innesti con futura funzione dell'innesto ritardato (DGF). Curve per le differenze di concentrazione arteriosa-venosa (AV) (la curva rossa è arteriosa, la curva blu è venosa). Biopsie tissutali (grafici a barre): le barre bianche rappresentano le biopsie pre-riperfusione; le barre grigie rappresentano le biopsie post-riperfusione (t ¼ 40 min dopo la riperfusione). *P < {{10}}.05.="" (a–h)="" differenze="" av="" per="" gli="" intermedi="" del="" ciclo="" di="" krebs="" (n="" ¼="" 10,="" 10="" e="" 16="" nei="" gruppi="" viventi,="" –dgf="" e="" þdgf,="" rispettivamente):="" rilascio="" persistente="" di="" a-chetoglutarato="" (da="" innesti="" þdgf;="" p=""><0,001) .="" (e,="" g)="" recupero="" succinato="" di="" tessuto="" post-riperfusione="" assente="" negli="" innesti="" þdgf="" (p=""><>

Il catabolismo dell'ATP post-riperfusione negli innesti þDGF si è verificato nonostante l'attivazione completa delle vie cataboliche: glicolisi, b-ossidazione degli acidi grassi a catena media (attivati ​​uniformemente in tutti i tipi di innesto), glutamminolisi (attivata anche transitoriamente dopo la riperfusione in donatore vivente e innesti -DGF ), e l'autofagia attivata. Infatti, il rilascio post-riperfusione di isovaleril- e butirril carnitina, prodotti di deaminazione degli aminoacidi a catena ramificata isoleucina e leucina,11 sono stati identificati come biomarcatori discriminatori per il futuro DGF.

Il rilascio persistente di acetilcarnitina e piruvato dagli innesti þDGF mostra che i flussi creati dalle vie cataboliche attivate hanno superato la capacità ossidativa. Il rilascio di chetoglutarato post-riperfusione, l'assorbimento netto del citrato e dell'isocitrato del suo precursore dalla circolazione e il mancato recupero del succinato tissutale implicano che la ridotta fosforilazione ossidativa comporta un difetto a livello del complesso dell'ossoglutarato deidrogenasi. In particolare, l'impronta metabolica osservata e la tempistica dei disturbi metabolici non indicano un ruolo per l'inversione di direzione del ciclo di Krebs27,28 nella disregolazione metabolica persistente, fornendo ulteriori prove che il meccanismo osservato per l'IRI nei roditori28 non si traduce completamente nell'uomo contesto.29.

La ridotta attività dell'ossoglutarato deidrogenasi può essere causata da un danno al complesso correlato all'ischemia30 ma può anche comportare, o essere esagerata, alteratapost-riperfusioneLa ridotta attività dell'ossoglutarato deidrogenasi può essere causata da un danno al complesso correlato all'ischemia30 ma può anche comportare, o essere esagerata, una ridotta disponibilità post-riperfusione dei suoi cofattori acetil-coenzima A, FADþ e NADþ. 31 Per gli innesti þDGF, tali carenze potrebbero verificarsi a causa del washout post-riperfusione dell'acetil-coenzima A e di uno stato redox cellulare compromesso (stress riduttivo con ridotta disponibilità di NADþ), una nozione supportata dal basso rapporto lattato-piruvato negli innesti þDGF. 32.

Questo approccio metabolico non consente la valutazione del coinvolgimento della catena respiratoria. Tuttavia, abbiamo identificato in precedenza difetti correlati alla riperfusione dell'ischemia in entrambi i complessi respiratori I e II.7,29 Sulla base dei dati di questo studio e del precedente lavoro mitocondriale, emerge un quadro di IRI renale clinica come conseguenza di un primario (o provocando) insulti alla navetta mitocondriale del ciclo redox di Krebs che si verifica prima o entro i primi minuti di riperfusione. Il mancato ripristino dei livelli di ATP provoca un'attivazione prolungata e completa delle vie cataboliche, che perpetua la crisi energetica esaurendo progressivamente il pool cellulare di NADþ e FADþ (stress riduttivo).33 In questo specifico contesto di mancata respirazione mitocondriale, l'inosina purinica può essere benefica . A differenza dell'adenosina,34 l'inosina è stabile nel plasma; è stato identificato come una fonte alternativa di ATP nelle cellule glicolitiche obbligatorie (cioè, cellule prive di mitocondri) come gli eritrociti35 e nelle cellule renali ipossiche36 e si esaurisce in seguito alla riperfusione. Sfortunatamente, la supplementazione di inosina non ha salvato la deplezione di ATP cellulare dopo un arresto metabolico forzato, lasciando poco spazio alle strategie di salvataggio metabolico volte a spegnere l'IRI, sottolineando la dipendenza da strategie preventive per limitare l'IRI.

Tonificare il cistano renale

Ci sono dei limiti a questo studio. A causa di un gran numero di confronti, il potenziale per risultati significativi dovuti al caso casuale nell'impostazione di confronti multipli è elevato. Sebbene le nostre conclusioni siano supportate da solide relazioni biologiche, i risultati possono essere confusi da problemi relativi a confronti multipli.

Un'ulteriore limitazione è che lo studio è basato su campioni clinici; in quanto tale, il congelamento del morsetto richiesto per la valutazione diretta dell'ATP e dello stato redox non era possibile. Poiché il metaboloma osservato è chiaramente distinto da quello riportato nei modelli animali e riflette un guasto del sistema, non siamo stati in grado di eseguire valutazioni più dettagliate in modelli animali o sistemi ex vivo come il sistema respirometrico. I risultati di questo studio sono per ilrene; quindi, le conclusioni per altri organi possono essere diverse. L'età relativamente alta del donatore in questo studio è un riflesso della popolazione dei donatori nei Paesi Bassi. È importante sottolineare che i risultati del trapianto di 10-anno per i Paesi Bassi sono almeno uguali a quelli dei paesi con donatori più giovani, come gli Stati Uniti.37 Come previsto, la maggior parte dei casi di þDGF erano innesti di DCD. Abbiamo notato similiprofili metaboliciper innesti DBD e DCD; tuttavia, il potere di questo studio esplorativo è ovviamente troppo basso per rilevare sottili differenze tra questi 2 tipi di donatori.

Figura 7|Sia il trattamento preventivo che quello di salvataggio non riescono a recuperare i livelli di adenosina trifosfato (ATP).. La linea cellulare renale PK-1 è stata trasfettata stabilmente con il biosensore fluorescente PercevalHR del rapporto ATP-adenosina difosfato (ADP).

La paralisi metabolica indotta chimicamente è stata indotta dall'aggiunta di rotenone/actinomicina/2-deossiglucosio ed è stato monitorato il rapporto ATP-ADP (fluorescenza relativa). Marrone, controllo; nero, controllo della paralisi metabolica; trattamento con inosina verde e preventivo (10 mMol/l); rosso, inosina rescue a t ¼ 15 minuti dopo l'induzione di una paralisi metabolica.

In conclusione, questo studio mostra che l'IRI renale clinica è preceduta da un collasso metabolico quasi istantaneo e da una conseguente crisi di fosfato ad alta energia. Questo deficit metabolico profondo e persistente e la sua natura istantanea (e la conseguente finestra minima di opportunità terapeutiche) interferiranno con qualsiasi intervento farmaceutico che si basi sulla disponibilità di ATP. Ciò potrebbe spiegare la scarsa traducibilità dei risultati preclinici nel contesto clinico.2-4 Il metaboloma osservato del DGF clinico contrasta nettamente con le risposte metaboliche riportate per ratti,28 topi,38 e maiali,39,40 che indicano tutti il ​​ripristino della fosforilazione ossidativa all'interno minuti di riperfusione. Ciò può essere correlato a differenze fondamentali nella fisiologia mitocondriale o metabolica tra roditori e mammiferi più grandi (p. es., l'accumulo di succinato indotto dall'ischemia non si verifica nei reni di donatori umani).29 In questo contesto, è importante sottolineare che tutti i reni trapiantati sono esposti aischemia riperfusionee che solo un sottogruppo di innesti sviluppa l'IRI (DGF). L'allocazione di gruppo (þDGF o –DGF) in questo studio è stata eseguita retrospettivamente e quindi discrimina tra ischemia riperfusione e IRI. Non si può escludere che la riperfusione ischemica nei modelli sperimentali28,38-40 sia insufficiente per innescare l'IRI.

Nonostante il grave danno subito, tutti gli innesti þDGF alla fine si sono ripresi, il che implica un notevole potenziale di guarigione a condizione che siano disponibili interventi ponte (p. es., dialisi). Da notare, sebbene metabolomi simili per DGF negli innesti derivati ​​da donatori deceduti dopo morte cerebrale o morte cardiaca implichino un meccanismo uniforme, esiste un impatto contrastante del DGF sulla sopravvivenza a lungo termine dell'innesto per i 2 tipi di donatori.41 In effetti, sebbene il DGF influenza chiaramente la sopravvivenza degli innesti da donatori deceduti dopo la morte cerebrale, non in tali innesti da donatori cardiaci. Questo contrasto sembra riflettere un potenziale di recupero superiore degli innesti da donatori di morte cardiaca.41

METODI

Il comitato etico medico del Leiden University Medical Center ha approvato il protocollo di studio. Consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni paziente. Questo studio monocentrico ha incluso 53 pazienti che sono stati sottopostirenetrapianto: 37 sono stati sottoposti a procedure di trapianto di donatore deceduto e 16 a procedura di donatore vivente. Sulla base dell'esito clinico (DGF), i riceventi di innesti di donatori deceduti sono stati assegnati a un gruppo þDGF (n=16) o –DGF (n=10). La DGF è stata definita dalla necessità di dialisi nella prima settimana dopo il trapianto.6

Lo studio si basa su un'integrazione dei dati metabolomici ottenuti dal prelievo di sangue artero-venoso (AV) sequenziale durante la prima mezz'ora di riperfusione e da biopsie tissutali accoppiate raccolte immediatamente prima e 40 minuti dopo

riperfusione.

Il prelievo di sangue AV sequenziale sull'innesto è stato eseguito in 36 pazienti (Tabella Supplementare S1A). I campioni di sangue della vena renale sono stati raccolti a 30 se 3, 5, 10, 20 e 30 minuti e campioni arteriosi a 0, 10 e 30 minuti dopo la riperfusione.42 Rene pre e post-riperfusione accoppiato le biopsie sono state ottenute immediatamente prima e 40 minuti dopo la riperfusione da 6 innesti di donatori vivi e 12 deceduti (Tabella Supplementare S1B; 1 paziente aveva sia biopsie che campioni AV).

Le analisi metabolomiche mirate sono state eseguite utilizzando procedure operative standard utilizzando piattaforme consolidate basate sulla spettrometria di massa o risonanza magnetica nucleare ad angolo magico (biopsie tissutali).43 I metaboliti coperti dalle piattaforme sono riassunti nella tabella supplementare S1.

Il potenziale dell'inosina per salvare il deficit metabolico durante un collasso metabolico è stato testato nella linea cellulare del tubulo prossimale (LLC PK1) trasfettata stabilmente con il biosensore di adenosina difosfato ATP fluorescente PercevalHR.44.

Per quanto riguarda le statistiche, le mappe di calore sono state costruite sulla base di z-score per ciascunametabolita. Le variazioni all'interno del gruppo nel contenuto di metaboliti tissutali sono state testate con il test di Mann-Whitney e le differenze tra i gruppi con il test di Wilcoxon. Le differenze AV sono state stimate utilizzando un modello misto lineare. La correzione per test multipli non è stata eseguita perché tutte le osservazioni facevano parte di reti teoriche. I dettagli relativi ai pazienti e ai metodi sono forniti nei metodi supplementari.

estratto di cistanche

CHIARIMENTI

Tutti gli autori non hanno dichiarato interessi concorrenti.

RINGRAZIAMENTI

La struttura principale della risonanza magnetica è finanziata dalla Facoltà di Medicina dell'NTNU Trondheim, in Norvegia. Questo studio è stato finanziato in parte dalla Dutch Kidney Foundation (Metabolic Salvage Strategies to Improve Transplant Outcome, project17O/11).

MATERIALE SUPPLEMENTARE

File supplementare (PDF)

Pazienti e metodi supplementari.

Tabella S1. Caratteristiche del paziente e del trapianto delle procedure in cui sono state raccolte biopsie tissutali accoppiate (A) e in cui è stato eseguito il campionamento AV (B).

Tabella S2. Le piattaforme e i loro metaboliti vengono utilizzati per i campioni AV.

Figura S1. Dati metabolomici completi.

Figura S2. Ripristino della b-ossidazione (acidi grassi a catena media) dopo la riperfusione.

Figura S3. Washout post-riperfusione selettivo e persistente di aminoacidi associati a uracile e fosfolipidi (plasmalogeno) da innesti con futuro DGF.

Supplemento ai dati 1. Dati AV grezzi per le piattaforme di acetilcarnitina, acidi organici e aminoacidi.

Supplemento ai dati 2. Dati AV grezzi per la piattaforma di purine e pirimidine.

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