Attività della xantina ossidoreduttasi nel plasma ricco e povero di piastrine come indicatore di stress ossidativo nei pazienti che necessitano di terapia sostitutiva renale

Sfondo astratto: Xantina ossidoreduttasi(XOR) è un enzima idrossilasi coinvolto nel metabolismo delle purine. L'attività dello XOR può variare: la proteina omodimerica può essere convertita in due diverse isoforme XD (antiossidante) e XO (proossidante). Stress ossidativo e infammazione che accompagnanomalattia renale cronica(CKD), dialisi e trapianto di rene hanno provocato l’attivazione piastrinica. Il presente studio mirava a determinare l'influenza della terapia sostitutiva renale applicata sulla xantina ossidoreduttasi e sulla sua attività isoforma.

Materiali e metodi: il gruppo di studio era composto da 117 pazienti, divisi in 4 gruppi: pazienti in emodialisi - 30 pazienti, pazienti in dialisi peritoneale - 30 pazienti con trapianto di rene - 27 e trattamento conservativo {{5} } pazienti. Il gruppo di controllo era composto da 30 volontari sani. Risultati: sono state riscontrate differenze significative nell'attività XOR nel plasma povero di piastrine (PPP) all'interno dei gruppi studiati (p=0.001). È stata riscontrata una relazione tra il tipo di terapia sostitutiva renale di tutte le isoforme dell'ossidoreduttasi nella PPP (p<0.001 all isoforms) and XD (p=0.008), XO (p<0.001) in platelet-rich plasma (PRP). A relationship was observed between the activity of all oxidoreductase isoforms in PPP and PRP, the type of renal replacement therapy the duration of dialysis, and the age of patients. Thecausa di malattia renale cronicasi rifletteva anche nelle differenze nell'attività XD e XO nel PPP.

Conclusioni: Il tipo di terapia sostitutiva renale utilizzata nei pazienti con insufficienza renale cronica, l'età dei pazienti, la durata della dialisi, le cause dell'insufficienza renale cronica e lo stadio di progressione influenzano significativamente l'attività dello XOR e delle sue isoforme.

Parole chiave: Xantina ossidoreduttasi, Piastrine, Terapia sostitutiva renale,Malattia renale cronica, Enzimi antiossidanti

QUANTO TEMPO IMPIEGA LE CISTANCHE A FUNZIONARE?

Sfondo

La xantina ossidoreduttasi (XOR) è un enzima idrossilasi coinvolto nel metabolismo delle purine. Catalizza l'ossidazione dell'ipoxantina in xantina e della xantina in acido urico (UA). L'attività XOR può variare: la proteina omodimerica può essere convertita in due diverse isoforme. La xantina deidrogenasi (XD) è espressa prevalentemente nei tessuti sani e la xantina ossidasi (XO) è generata dalla modificazione XD post-traduzionale, dai residui di ossidazione della cisteina e dalla proteolisi limitata, svolgendo un ruolo dominante nelle cellule e nei tessuti durante le lesioni [1–3 ]. Le attività delle isoforme menzionate si oppongono tra loro [4]. XOR agisce in presenza di NAD+ come deidrogenasi e con l'ossigeno molecolare come ossidasi. La capacità di XOR di convertirsi rapidamente da antiossidante a ossidante, in vari tipi di danno tissutale, è un elemento essenziale per una rapida risposta immunitaria innata, benefica, ad esempio, nelle infezioni batteriche o fungine [5].

Gli intermedi di reazione della xantina deidrogenasi (XDO) e dell'ossigeno possono reagire sia con NAD+ che con O2 ma presentano un'affinità maggiore per NAD+ [6]. Questa isoforma intermedia non è stata isolata, ma la determinazione della sua attività facilita il monitoraggio della trasformazione di XD in XO [7].

L’attività XOR nel siero in varie malattie è stata ampiamente studiata. Il motivo dell'interesse per questo enzima è il dualismo della sua azione: la capacità di produrre antiossidanti e, dall'altro, la creazione di specie reattive dell'ossigeno. Un aumento dell'attività XOR si verifica in condizioni patologiche come l'epatite virale, la mononucleosi infettiva, le malattie autoimmuni, la polmonite, la schizofrenia e il diabete di tipo II. L’aumento dell’attività XOR è stato osservato anche nel siero di pazienti dopo trapianto di rene o di fegato [8]. È stato dimostrato che il gene che codifica per XOR può essere responsabile della maturazione renale e dell’adipogenesi nei reni e può impedire la trasformazione delle cellule epiteliali in tessuto mesenchimale [9]. Tuttavia, a causa delle nostre migliori conoscenze, non esistono rapporti pubblicati che indaghino l’attività XOR nel plasma povero di piastrine (PPP) e nel plasma ricco di piastrine (PRP) in pazienti sottoposti a terapia sostitutiva renale. L’importanza dell’attività XOR in questo gruppo di pazienti è correlata all’aumento dell’attivazione piastrinica, causata dallo stress ossidativo e dall’infiammazione che accompagnano la malattia renale cronica (CKD), la dialisi e il trapianto di rene. Inoltre, durante la dialisi e il trapianto di organi, i tessuti e i vasi sanguigni vengono danneggiati e le piastrine sono le prime cellule a raggiungere il sito del danno tissutale, partecipando attivamente alle fasi iniziali del processo infiammatorio e di guarigione [10].

PRP e PPP sono frazioni di plasma sanguigno con diverse concentrazioni piastriniche. Il contenuto piastrinico di PRP e PPP è rispettivamente piastrine/ml e piastrine/ml. PPP e PRP si ottengono centrifugando e lavando ripetutamente il sangue intero di esseri umani a diverse velocità centrifughe [11, 12].

Il PPP, come sottoprodotto della centrifugazione del sangue anticoagulato, ha una concentrazione piastrinica inferiore rispetto al sangue normale. I componenti principali del PPP sono il fibrinogeno, la fibronectina e la trombina. Gli effetti biologici del PPP partecipano all’emostasi e alla coagulazione, agendo come vettore di attacco cellulare e promuovendo la mitosi dei fibroblasti e delle cellule epiteliali [13]. Sebbene il PPP non sia concentrato nelle piastrine come il PRP, è stato dimostrato che può anche sostenere la crescita e la sopravvivenza cellulare. Il PPP promuove le funzioni cellulari associate alla guarigione delle ferite e accelera la migrazione cellulare e la proliferazione dei fibroblasti [14, 15]. Il plasma ricco di piastrine ha piastrine più concentrate rispetto al plasma normale (circa 150–400× 103 cellule/dL). È una delle definizioni di PRP più comuni in letteratura [16]. Ad oggi, studi limitati hanno caratterizzato XOR e la sua attività isoforma nel plasma ricco o povero di piastrine in pazienti affetti da malattia renale cronica. Tan et al. hanno mostrato che le cellule danneggiate dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS) (nel caso della terapia sostitutiva renale cronica) "perdono" le isoforme XOR, portando all'aumento del livello dell'enzima nel plasma [17]. Questo meccanismo spiega la minore attività di XOR e delle sue isoforme nelle piastrine rispetto al PPP. Pertanto, l'attività delle ossidoreduttasi nel PPP e nel PRP è di grande interesse, poiché potrebbero aiutare a scoprire i processi cellulari che si verificano quotidianamente. Tali indagini potrebbero anche evidenziare indirettamente la gravità dello stress ossidativo in questo gruppo di pazienti.

Berry et al. descrivono anche che la xantina ossidoreduttasi è distribuita nel fegato, nell'intestino tenue, nella ghiandola mammaria e nelle cellule endoteliali. I metodi di localizzazione subcellulare hanno dimostrato la presenza della xantina ossidoreduttasi sia nel citoplasma che sulle membrane cellulari. Indicano inoltre che la xantina ossidasi reduttasi plasmatica può essere dovuta all'ombreggiamento della xantina ossidoreduttasi dalle membrane cellulari o alla fuoriuscita dal citoplasma. Questo è uno dei motivi per cui testiamo l'attività di XOR in PPP e PRP per distinguere l'attività enzimatica nelle piastrine e in altre cellule del sangue contenute nel plasma [18]. Sulla base dell’attività degli enzimi antiossidanti, possiamo anche determinare quale tipo di terapia sostitutiva renale ha meno probabilità di esporre il paziente allo stress ossidativo. A causa della duplice natura dello XOR, la comprensione della relazione tra il tipo di terapia sostitutiva renale e l’attività delle isoforme XOR può essere molto interessante e utile nella scelta del tipo di terapia sostitutiva renale.

Materiali e metodi

Approvazione e consenso etico

La Commissione Bioetica dell'Università Medica della Pomerania a Stettino ha approvato la ricerca effettuata (n. KB−0012/36/11). Tutti i partecipanti, compresi i volontari sani del gruppo di controllo, sono stati informati sullo scopo e sulla portata dello studio e hanno dato il loro consenso alla donazione dei campioni e alla pubblicazione dei dati risultanti.

Gruppo di studio

C'erano 147 partecipanti: un gruppo di controllo di 30 volontari sani (NK) e 117 pazienti con malattia renale cronica (CKD) che frequentavano la clinica di nefrologia, transplanetologia e malattie interne dell'Università medica della Pomerania a Stettino. I pazienti sono stati divisi in 4 gruppi in base al trattamento ricevuto: 30 pazienti prima e dopo l'emodialisi (HD A e HD B): 30 pazienti hanno ricevuto dialisi peritoneale (PD); 27 pazienti prima e dopo il trapianto di rene (5-7 giorni dopo l'intervento chirurgico) (TE, TE A); 30 pazienti hanno ricevuto un trattamento conservativo (CT) (CKD stadio 2-5). Il sesso, l'età, la durata della dialisi, la causa e lo stadio della malattia renale cronica e la concentrazione di creatinina nei gruppi test e di controllo sono riportati nelle Tabelle 1 e 2.

Campioni

Da tutti i partecipanti allo studio sono stati prelevati campioni di sangue (K2EDTA (8 ml), citrato trisodico al 3,8% (9: 1; v / v) e siero (8 ml)). Il sangue dei pazienti emodializzati è stato prelevato dalla loro fistola artero-venosa; la venipuntura periferica è stata utilizzata per tutti gli altri partecipanti. I campioni sono stati prelevati da pazienti in emodialisi prima (HD A) e circa 10 minuti dopo l'arresto della pompa (HD B). Il sangue dei pazienti trapiantati è stato raccolto prima del trapianto (TE) e 5-7 giorni dopo l'intervento chirurgico (TE A). I pazienti reclutati per il gruppo TE non appartenevano al gruppo dei pazienti in emodialisi o dialisi peritoneale in questo studio. Erano pazienti qualificati per il trapianto provenienti da tutta la Polonia. La stragrande maggioranza dei pazienti sottoposti a trapianto di rene era stata precedentemente sottoposta ad analisi mode. I campioni di K2EDTA e di sangue coagulato sono stati centrifugati a 2600 giri al minuto per 10 minuti a 20 gradi per ottenere rispettivamente plasma e siero. Per ottenere plasma ricco di piastrine (PRP) e plasma povero di piastrine (PPP), il sangue raccolto con citrato è stato centrifugato in condizioni a 1100 giri al minuto per 10 minuti a 20 gradi. Il PRP risultante è stato trasferito in una nuova provetta e centrifugato a 6000 giri al minuto per 10 minuti a 20 gradi: il plasma povero di piastrine (PPP) è stato trasferito in una provetta separata; il pellet piastrinico è stato lavato due volte e sospeso in tampone Tyroda (pH 7,4). Plasma, siero, PPP e PRP sono stati congelati a -80 gradi fino all'esecuzione dei test. Nei pazienti in emodialisi, il sangue è stato raccolto prima della somministrazione di eparina e dopo la dialisi della durata media di 4-5 ore (emivita dell'eparina - 4 h) per eliminare ogni possibile influenza dell'eparina sull'attività XOR.

Attività della xantina ossidoreduttasi nel plasma e nelle piastrine poveri di piastrine

Le determinazioni sono state effettuate con uno spettrofotometro Perkin Elmer UV/VIS Lambda 40P. I cambiamenti di estinzione sono stati registrati a 340 nm (XD) e 302 nm (XDO, XO) per 5 minuti a 30 gradi. L'attività enzimatica è stata misurata come formazione di acido urico e NADH (aumenta in A340 e A302) ed espressa in mU× mL−1 (milliunità per millilitro). L'attività enzimatica è stata calcolata tenendo conto delle velocità iniziali di reazione. La formazione di acido urico è stata misurata a 302 nm (isoforme XDO e XO) perché lì il suo assorbimento è ancora elevato, mentre i cambiamenti nella concentrazione di NAD+ non contribuiscono. Il coefficiente di estinzione per NADH+ H+ ε340=6.22× 103 [L∙mol−1 cm−1 ] è stato utilizzato per calcolare l'attività delle isoforme della xantina ossidoriduttasi NADH+ H+: ε302=2.30× 103 [ L∙mol−1 cm−1] [7, 19–22].

Tabella 1 Caratteristiche generali dei pazienti in emodialisi (HD), dialisi peritoneale (PD) trattati in modo conservativo (CKD), trapianto di rene (TE) e gruppo di controllo (C) partecipanti allo studio (media±SD)

P* - significatività statistica per le differenze tra i gruppi HD, PD e CKD, test Fisher esatto TE e C per variabili qualitative; per variabili quantitative - ANOVA unidirezionale e; P** - significatività statistica per le differenze tra i gruppi HD, PD e CKD e test esatto di Fisher TE per variabili qualitative per variabili quantitative ANOVA a una via o; DM - nefropatia diabetica; HA - ipertensione; GIK - rene con infiammazione glomerulare; ADPKD - malattia del rene policistico ereditaria con trasmissione autosomica dominante; NS - nessuna differenza statisticamente significativa.

Tabella 2 Caratteristiche generali dei pazienti in emodialisi (B - prima dell'HD, A - dopo), in dialisi peritoneale (PD) trattati in modo conservativo (CKD) prima e dopo il trapianto di rene (TE B e TE A) e nel gruppo di controllo (NK) che hanno preso parte al studio (media±DS)

P * - significatività statistica per differenze tra gruppi HD A, HD B, PD e CKD, TE e C per variabili quantitative - Kruskal Wallis ANOVA, ANOVA a una via o test t di Student P ** - significatività statistica per differenze tra HD A , HD B, gruppi PD e CKD e TE per variabili quantitative ANOVA di Kruskal Wallis o analisi ANOVA unidirezionale Kt / V - indice di dialisi (frazione di volume V purificata dalla clearance K al tempo t) NS non è stata trovata alcuna relazione statisticamente significativa

Analisi statistica Per valutare le distribuzioni è stato utilizzato il test KS (Kolmogorov-Smirnov), che nel caso di alcune variabili (l'attività delle isoforme XD e XDO nel PRP) ha mostrato una distribuzione dei parametri non normale. Per analizzare i dati quantitativi sono stati utilizzati i test esatti di Fisher e Chi-quadrato. Utilizzando il test t di Student e l'analisi ANOVA per sistemi univariati, le differenze tra variabili associate (accoppiate) e non correlate (spaiate) sono state valutate nel caso di variabili con una distribuzione normale. Nel caso di variabili con distribuzioni non normali, è stata eseguita l'analisi Kruskal-Wallis ANOVA per valutare le differenze tra i parametri, nonché il test non parametrico Mann-Whitney U per dati non appaiati o Wilcoxon per dati appaiati. Per determinare la valutazione multifattoriale delle relazioni tra i parametri studiati è stato utilizzato un modello di regressione multipla lineare. L'analisi statistica dei risultati è stata eseguita utilizzando Statistica 12 (StatSoft).