Uno studio non randomizzato che indaga l'impatto del consumo di riso integrale sul microbiota intestinale, sull'attenzione e sulla memoria di lavoro a breve termine nei bambini tailandesi in età scolare Parte 2

2.4. Analisi quantitativa del microbiota fecale

I campioni fecali sono stati raccolti dai bambini al basale, alle settimane 4, 15, 56 e 61 e alla settimana 71 in contenitori sterilizzati e sono stati immediatamente congelati a -80 ◦C. L’estrazione del DNA microbico e la misurazione quantitativa dell’abbondanza assoluta del microbiota fecale sono state effettuate come precedentemente descritto [29].

Il rapporto tra misure quantitative e memoria è un argomento degno di studio. Per molti problemi della vita, i problemi di memoria sono spesso quelli che disturbano le persone, come l'incapacità di ricordare cose importanti, dimenticare gli orari degli appuntamenti, ecc. In questo momento, i metodi di misurazione quantitativa possono aiutarci a comprendere la situazione della memoria e apportare miglioramenti mirati .

I metodi di misurazione quantitativa possono quantificare la memoria delle persone attraverso mezzi scientifici. Su questa base vengono proposti alcuni metodi specifici ed efficaci per allenare la memoria. Nella vita quotidiana possiamo anche usare metodi semplici per allenare la memoria, come memorizzare parole, poesie, ecc. Sono tutti modi efficaci per sviluppare una buona memoria.

Allo stesso tempo, possiamo anche migliorare la memoria in tutti gli aspetti della vita. Se, ad esempio, vogliamo ricordare una nuova parola del vocabolario, possiamo leggerla più volte, scriverla più volte o associarla al suo significato, così il ricordo sarà più profondo.

Nell’era dell’esplosione informatica, spesso ci sentiamo sopraffatti dalle informazioni. Molte volte abbiamo bisogno di ricordare molte cose, ma non sappiamo come gestire queste informazioni. In questo momento, possiamo utilizzare metodi di misurazione quantitativa per determinare lo stato della nostra memoria, quindi allenarci e migliorare in base a situazioni specifiche. Attraverso metodi di memoria ragionevoli, possiamo migliorare efficacemente la nostra memoria e offrire maggiore comodità alla nostra vita e al nostro lavoro.

In breve, il rapporto tra misurazione quantitativa e memoria è inscindibile. Dobbiamo utilizzare metodi scientifici per scoprire le nostre condizioni di memoria e quindi condurre un allenamento efficace basato su situazioni specifiche. Credo che finché ci alleniamo incessantemente, saremo in grado di rafforzare la nostra memoria e migliorare la nostra qualità di vita. Si può vedere che abbiamo bisogno di migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come ad esempio aumentare i livelli di acetilcolina e i fattori di crescita. Queste sostanze sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, la carne può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l’apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello riceva nutrienti ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello.

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In breve, il DNA genomico microbico è stato estratto da campioni fecali utilizzando il kit innuPREP Stool DNA (Analytik Jena Biometra, Jena, Germania) e la concentrazione e la purezza del DNA sono state determinate utilizzando la piastra Take 3Micro-Volume (Biotek, Winooski, VT, USA).

L'abbondanza assoluta dei geni rRNA del microbiota16 è stata quindi quantificata tramite qPCR utilizzando Real-Time Thermal CyclersCFX96 TouchTM (Bio-Rad, Singapore) sulla base dei primer specifici mostrati nella Tabella S1.

Le condizioni qPCR e le stime del numero di copie del microbiota sono state eseguite seguendo il protocollo precedente [37]. Il numero di copie Log10 dell'rRNA 16S per grammo di feci a peso umido è presentato nei nostri dati supplementari.

2.5. Analisi statistica

La distribuzione dei dati è stata esaminata attraverso il test di Shapiro–Wilk e il test di Levene (pacchetto statistiche versione 4.0.3). Il pacchetto R ggplot2 è stato utilizzato per la visualizzazione dei dati [38]. La correzione del valore p di Benjamin-Hochberg (BH) è stata applicata per la correzione di test multipli (valore q). La significatività è stata determinata a q < 0.05. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite nella versione del software R 4.0.3 [39].

Le differenze nelle abbondanze medie assolute del microbiota intestinale tra i gruppi di intervento per ciascun punto temporale sono state determinate mediante t-test o test della somma dei ranghi di Wilcoxon in base alla normalità della distribuzione dei dati.

I cambiamenti nel microbiota intestinale tra i punti temporali di ciascuna fase (all'interno dei soggetti) sono stati valutati utilizzando test t a coppie o test dei ranghi con segno di Wilcoxon a seguito di risultati significativi dalle misure ripetute unidirezionali ANOVA o dal test di Friedman (p < 0.05 ). I cambiamenti nell’abbondanza assoluta del microbiota intestinale tra le settimane sono stati espressi come cambiamenti di piega trasformati log2 (Log2FC).

Le relazioni tra l’abbondanza assoluta del microbiota intestinale e l’età dei bambini in età scolare sono state determinate utilizzando il coefficiente di correlazione dei ranghi di Pearson o Spearman.

L'associazione tra microbiota intestinale e intervento in ogni momento, aggiustando per variabili demografiche (età, sesso, punteggio z BMI, modalità di parto, record di nascita ed etnia), è stata valutata attraverso l'analisi multivariata permutazionale della varianza (PERMANOVA) utilizzando la funzione Adonis . Per studiare l'effetto dell'intervento nelle settimane di ciascuna fase, PERMANOVA è stato condotto utilizzando i partecipanti come strati e aggiustando per le covariate. La condizione di omogeneità basata sulla distanza euclidea è stata misurata utilizzando la funzione betadine.

La permutazione è stata eseguita a 999 nel pacchetto R vegan(2.6-2) [40]. Abbiamo ulteriormente determinato l’impatto dell’intervento sul microbiota intestinale utilizzando l’analisi di ridondanza (RDA) aggiustando per le covariate.

I trattamenti sono stati utilizzati come variabili esplicative vincolate e le abbondanze assolute del microbiota intestinale sono state utilizzate come variabili di risposta. La significatività dei vincoli è stata valutata utilizzando un test di permutazione simile ad ANOVA (permutazione=999). Una selezione graduale delle variabili esplicative è stata eseguita utilizzando la funzione step basata sui criteri AIC.

I risultati cognitivi tra i gruppi di intervento per ogni settimana sono stati confrontati utilizzando il test t a due campioni di Welch o il test della somma dei ranghi di Wilcoxon. Una differenza nelle prestazioni cognitive nelle settimane di ciascuna fase (all'interno dei soggetti) è stata determinata utilizzando il test dei ranghi con segno di Wilcoxon in seguito a risultati significativi del test di Friedman (p < 0.05).

Abbiamo utilizzato la RDA per determinare l'effetto dell'intervento sulle prestazioni cognitive dei bambini in età scolare, adattandoli per età e sesso. L’effetto dei punti temporali sull’abbondanza del microbiota intestinale è stato valutato anche attraverso la RDA utilizzando i partecipanti come strati.

La condizione RDA si è svolta come descritto sopra. Per determinare la relazione tra prestazioni cognitive e microbiota intestinale, abbiamo utilizzato il coefficiente di correlazione dei ranghi di Spearman.

È stata eseguita l'analisi a fattori multipli (MFA) per esplorare le variazioni nel microbiota intestinale che potrebbero essere spiegate dall'intervento e dalle variabili dell'ospite (età e sesso) utilizzando FactoMine R versione 2.4 [41] e visualizzando con Factoextra versione 1.0. 7[42].

3. Risultati

3.1. Caratteristiche dei bambini in età scolare

Dopo il controllo della qualità dei dati (Figura 1), abbiamo analizzato i restanti 85 e 57 bambini rispettivamente nelle fasi I e II. I bambini al basale avevano in media 7,02 e 10,52 anni rispettivamente per i gruppi WR e SLR.

Le caratteristiche di base dei gruppi di controllo e di intervento erano significativamente diverse per età (p < {{0}}.0001), peso (p < 0,0001), altezza (p < 0,0001), BMI z- punteggio (p=0.03) e tipo di alimentazione (p=0.02) (Tabella S2).
Un modello simile è stato osservato anche in tutti i punti temporali dello studio, ad eccezione del BMI, che non era significativamente diverso tra i gruppi alla settimana 71 (Tabelle S3-S7).

3.2. Effetto dell’intervento con riso Sinlek sul microbiota intestinale dei bambini in età scolare

Considerando ciascuno dei punti temporali, non sono state riscontrate differenze significative nell'abbondanza assoluta di microbiota intestinale tra i gruppi di controllo (WR) e di intervento Sinlek (SLR) nella prima fase di intervento (Fase I; basale, Settimana 4 e Settimana 15 ).

I confronti multivariati utilizzando PERMANOVA (per margine) hanno anche mostrato che l’intervento nella Fase I non ha avuto effetti significativi sui cambiamenti nel microbiota intestinale dopo l’aggiustamento per le variabili demografiche (File Supplementare S1).

Abbiamo inoltre determinato un'associazione tra l'abbondanza del microbiota intestinale e l'età e scoperto che il Lactobacillus era correlato negativamente con l'età al basale (correlazione di Pearson; R {{0}} −0.24, p {{ 3}}.026) e Settimana 4 (correlazione di Pearson; R=−0,3, p=0.002) (Figura 2b,d). Per la seconda fase dell'intervento (Fase II), tuttavia, i cambiamenti nelle abbondanze microbiche sono stati marcati alle settimane 61 e 71. Le abbondanze di batteri totali (q=0.032) e Firmicutes (q=0.032 ) erano significativamente aumentati, mentre il livello di gammaproteobatteri (q <0,0001) era significativamente diminuito dopo l'intervento SLR alla settimana 61 (Figura 2e-g).

Questi batteri erano anche significativamente associati all'età, dove l'abbondanza di batteri totali (correlazione di Pearson; R {{0}} −0.32, p=0.0 15) e Firmicutes (correlazione di Pearson; R=−0,32, p=0.014, Figura 2h) diminuivano con l'aumentare dell'età, mentre l'abbondanza assoluta di Gammaproteobatteri era positivamente correlata con l'età (correlazione di Pearson; R { {11}}.62, p < 0,0001, Figura 2i).

Alla settimana 71, il livello di Bacteroidetes era significativamente ridotto nel gruppo SLR (q < 0.0001) (Figura 2j) e la sua abbondanza era correlata positivamente con l'età (correlazione dei ranghi di Spearman; R { {4}}.57, p < 0,0001, Figura 2l).

Considerando i cambiamenti nell’abbondanza del microbiota intestinale nel corso delle settimane (all’interno dei soggetti) dei gruppi di controllo e di intervento, abbiamo osservato modelli simili nei due gruppi di partecipanti. I gammaproteobatteri sembravano fluttuare notevolmente dopo l'intervento: la sua abbondanza era significativamente diminuita alla settimana 4 e alla settimana 61 (Figure 3a,b, S1c e S2c, File supplementare S2).

Tuttavia, i livelli di questi batteri sembravano riprendersi al termine di ciascuna fase (Settimana 15 e Settimana 71). Inoltre, l'abbondanza di Bacteroidetes per il gruppo SLR era inferiore alla settimana 71 rispetto alle settimane 56 e 61 (Figure 3a e S2e). Durante la Fase II è stata osservata anche una diminuzione graduale delle abbondanze di due taxa microbici, vale a dire Ruminococcus e Bacteroides, con le loro abbondanze più basse all'endpoint dello studio (Settimana 71) (Figure 3b e S2f,g), indipendentemente dall'intervento.

Inoltre, abbiamo valutato se vi fossero differenze nell'abbondanza del microbiota intestinale tra i trattamenti e nel corso delle settimane utilizzando i partecipanti come strati. PERMANOVA ha indicato che la presenza del trattamento e/o il punto temporale dello studio (settimana) durante entrambe le fasi aveva effetti marginali significativi sul abbondanza di microbiota intestinale (p <0.05).

Le dispersioni (varianze) tra i gruppi e un modello che tiene conto delle variabili demografiche con significatività statistica sono riassunti nel File Supplementare S3. Abbiamo esplorato ulteriormente la forza dell'associazione e la variazione del microbiota intestinale spiegata dall'intervento utilizzando la RDA. Differenze significative sono state riscontrate solo nella Fase II.

L'abbondanza di gammaproteobatteri era più arricchita nel gruppo di controllo (WR) rispetto al gruppo SLR, mentre un numero maggiore di batteri totali, Firmicutes e Bacteroidetes era associato all'intervento SLR alla settimana 61 (RDA1 spiegava il 30,58% della varianza totale, R2adj {{5} }.29,p=0.001, Figura 3c). Per la settimana 71, l'abbondanza di Bacteroidetes era maggiore nel gruppo di controllo rispetto al gruppo SLR (RDA1 spiegava l'8,18% della varianza totale, R2adj=0.06,p=0.005, Figura 3d) .

Abbiamo poi proceduto con una selezione graduale delle variabili esplicative (variabili di intervento e demografiche) basate sull'AIC. Il modello ha rivelato che solo l’intervento spiegava in modo significativo le variazioni nei profili del microbiota intestinale dei bambini in età scolare (q=0.035).

3.3. Prestazioni cognitive tra i gruppi di controllo e di intervento

Nella Fase I, abbiamo riscontrato differenze significative tra i gruppi di controllo e di intervento nei risultati cognitivi. Il gruppo SLR ha mostrato punteggi significativamente più alti nel test Corsi di block-tapping (denominato MMG, gioco di abbinamento della memoria) e prestazioni complessive (OVP) nel test di vigilanza psicomotoria (PVT-B), mentre i tempi di reazione (RT) e gli intervalli erano inferiori rispetto al gruppo di controllo. gruppo (Figura 4).

Nella Fase II, i modelli di prestazione cognitiva sono rimasti invariati. Abbiamo anche confrontato le prestazioni cognitive (all'interno dei soggetti) nelle settimane di ciascuna fase e abbiamo scoperto che il gruppo di controllo (Fase I) ha ottenuto risultati migliori riguardo agli errori alla Settimana 15 rispetto al basale e alla Settimana 4 (q=0.02) (Figura S3). L'RT è stato più alto alla Settimana 15 rispetto alla Settimana 4 (q=0.008), mentre non sono state rilevate differenze significative in MMG o OVP. La MMG è stata l'unico risultato cognitivo significativamente più elevato per il gruppo SLR (Fase I) alla settimana 15 rispetto al basale (q=0.003) e alla settimana 4 (q=0.03) (Figura S4) .

Nella Fase II, non sono state riscontrate differenze significative tra le settimane in nessuna delle misurazioni delle prestazioni cognitive né nel gruppo di controllo né in quello SLR. Inoltre, anche l'età e il sesso sono stati inclusi nella RDA e i risultati non hanno mostrato alcun effetto di intervento sulle prestazioni cognitive dei bambini. in entrambi i gruppi in qualsiasi momento nel corso delle 71 settimane dello studio.

Tuttavia, è stato riscontrato che l'età descrive in modo significativo la variazione dei risultati cognitivi al basale (p=0,008), alla settimana 4 (p=0,005) e alla settimana 15 (p=0 .028) (Figura 5), ​​per il quale l'età era correlata positivamente con MMG e OVP. Non sono stati riscontrati effetti significativi causati dall’intervento, dall’età o dal sesso sulle prestazioni cognitive alla Settimana 56, Settimana 61 o Settimana 71.

Quando si considerano i profili cognitivi nelle settimane di ciascun trattamento in ciascuna fase, sia la settimana (p=0.001) che il sesso (p=0.001) descrivono in modo significativo le variazioni nelle prestazioni cognitive del gruppo di controllo (Fase I) , per il quale il sesso femminile e la settimana 15 erano correlati positivamente con MMG e OVP (Figura S5a).

I bambini hanno ottenuto risultati migliori alla MMG alla settimana 15 nel gruppo SLR (Fase I), mentre il sesso femminile era correlato positivamente con errori e RT (Figura S5b). È stato valutato anche l'effetto dell'aggiustamento del trattamento per età e sesso per ciascuna fase, controllando per la settimana (punti temporali). La RDA ha mostrato che l'età aveva una forte relazione con OVP e MMG nella Fase I (Figura S6a), mentre, nella Fase II, le prestazioni relative a RT e ricadute erano peggiori nel gruppo SLR rispetto al gruppo di controllo (Figura S6b).
Nel complesso, l'età e i punti temporali erano più associati alle prestazioni cognitive dei bambini in età scolare rispetto all'intervento, e l'effetto dell'intervento è stato osservato solo vincolando i campioni entro ciascuna settimana della Fase II dopo aver aggiustato per età e sesso.

3.4. Associazione tra microbiota intestinale e prestazioni cognitive dei bambini in età scolare

Abbiamo trovato deboli correlazioni tra microbiota intestinale e risultati cognitivi in ​​tutti i momenti dell’intervento sulla base dei coefficienti di correlazione di Spearman. Diverse associazioni erano significative (p < {{0}},05), ma solo un'associazione, rilevata alla settimana 4 per il gruppo SLR (Roseburia vs. Lapses, rho=−0,40, q {{6 }}.04), è rimasto significativo dopo l'aggiustamento per confronti multipli (Figura S7).

Alcune associazioni che si avvicinavano alla significatività sono state trovate alla settimana 56 e alla settimana 71. Le associazioni identificate nel gruppo SLR alla settimana 56 includevano Faecalibacterium–RT (rho=0.62, q=0.07 ), Prevotella–OVP(rho=−0.55, q {{10}}.08), Gammaproteobatteri–OVP (rho=−0.58, q=0.07) e Faecalibacterium–OVP (rho=−0,64, q=0.05). Alla settimana 71, Faecalibacterium era correlato positivamente con la RT nel gruppo di controllo (rho=0.62, q=0.07).

Tenendo conto di età e sesso, è stata eseguita un'ulteriore analisi dell'associazione tra microbiota intestinale e prestazioni cognitive in ciascun momento utilizzando un MFA per rivelare variazioni tra i profili individuali dei gruppi di trattamento (file supplementare S4).

Sebbene la variazione individuale fosse spiegata dall'abbondanza di microbiota intestinale nel Dim 1 di entrambe le fasi (p < 0.0001), è stata notata una forte separazione tra i gruppi di controllo e SLR nel Dim 2 (figure 6 e 7). Il profilo di contrasto tra questi due gruppi era influenzato dall'età e dall'OVP, che erano correlati positivamente con Dim 2 (p < 0,0001), mentre sia RT che intervalli erano correlati negativamente (p < 0,0001).

Tuttavia, i gammaproteobatteri sono stati quelli più influenti nel descrivere la variazione individuale in questa dimensione alla settimana 61 (p < 0.0001). Il livello di questo batterio era più basso nel gruppo SLR (coordinata=−1,35, p < 0,0001).

Nonostante le dimensioni disuguali del campione, l’MFA ha indicato che la differenza nei profili dei bambini in età scolare in questo studio clinico non randomizzato era più influenzata dall’età e dalle prestazioni cognitive che dal microbiota intestinale, suggerendo un minor contributo dell’intervento alla variazione individuale in questo studio.

4. Discussione

Il nostro studio non ha osservato cambiamenti significativi nell’abbondanza assoluta del microbiota intestinale dopo la prima fase dell’intervento sul riso Sinlek nei bambini in età scolare. Differenze significative tra i gruppi, tuttavia, sono state notate nella Fase II (settimane 61 e 71) per batteri totali, Firmicutes, Bacteroidetes e Gammaproteobacteria.

Abbiamo anche osservato differenze significative nelle prestazioni cognitive tra il gruppo di controllo e quello di intervento in entrambe le fasi. Non abbiamo trovato una forte correlazione tra microbiota intestinale e prestazioni cognitive in nessun momento.

Ulteriori analisi hanno suggerito che, in questo gruppo, l’intervento con riso Sinlek non ha contribuito alle variazioni del microbiota intestinale e dei profili cognitivi dei bambini in età scolare, poiché i risultati erano influenzati principalmente dall’età.

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