Un livello di esercizio adeguato attenua la disbiosi intestinale e l'aumento dell'acido valerico per migliorare la neuroplasticità e la funzione cognitiva dopo l'intervento chirurgico nei topi Parte 3

MATERIALI E METODI

I protocolli e le procedure sperimentali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università della Virginia (Charlottesville, VA, USA; numero di protocollo: 3114).

La memoria è una delle capacità che spesso dobbiamo utilizzare nella nostra vita quotidiana. Può rendere le persone più intelligenti, più sensibili e più favorevoli alla carriera e alle relazioni interpersonali. Pertanto, molte persone vogliono migliorare la propria memoria. Esiste una relazione tra protocolli sperimentali e memoria. Esploriamo questo problema in seguito.

Innanzitutto, i protocolli sperimentali possono aiutare le persone a migliorare la propria memoria. Nell'esperimento, le persone devono seguire determinati passaggi per completare l'operazione sperimentale. Questa attività passo dopo passo può mettere il cervello umano in uno stato di elevata attenzione e concentrazione, favorendo così lo svolgimento delle funzioni cerebrali. Allo stesso tempo, è necessario ricordare alcuni dati sperimentali e passaggi sperimentali durante l'esperimento, che eserciteranno anche la funzione di memoria del cervello. Esercitandoti ripetutamente in questo modo, la tua memoria migliorerà gradualmente.

In secondo luogo, anche l'esperienza sensoriale durante il processo di memoria è strettamente correlata alla progettazione del piano sperimentale. Negli esperimenti, i progettisti spesso impostano determinati compiti specifici durante l'esperimento, in modo che i partecipanti debbano ripetere la stessa operazione più volte, come la memoria e la scrittura di numeri, la memoria e il riconoscimento dei blocchi di colore, ecc. Questa esperienza ripetitiva può rafforzare la capacità delle persone capacità di attenzione e memoria, rendendo più facile per le persone elaborare queste informazioni nella memoria a lungo termine.

Inoltre, negli esperimenti, anche l'uso di materiali di stimolo rappresentativi (come immagini, suoni, odori, ecc.) può produrre buoni risultati. Perché questi stimoli possono innescare l'eccitazione e i processi di memoria del cervello, migliorando così la capacità di memoria delle persone. Allo stesso tempo, questi stimoli possono anche essere accoppiati con l’ambiente e le situazioni della vita, riducendo così il verificarsi del disaccoppiamento e rendendo le informazioni più facili da ricordare e più coese.

Per riassumere, il piano sperimentale gioca un ruolo cruciale nel miglioramento della memoria umana. Conducendo esperimenti, le persone possono esercitare le proprie capacità cognitive, migliorare i propri livelli di memoria e allo stesso tempo promuovere la funzione cerebrale. Pertanto, dovremmo continuare ad apprendere nuovi metodi sperimentali e partecipare a più esperimenti per migliorare i nostri livelli di memoria e dare un contributo maggiore alla nostra carriera, alle relazioni e alla salute. Si può vedere che dobbiamo migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola ha effetti antiossidanti, antinfiammatori e antinvecchiamento, che possono aiutare a ridurre l’ossidazione e le reazioni infiammatorie nel cervello, proteggendo così il cervello. salute del sistema nervoso. Inoltre, Cistanche deserticola può anche promuovere la crescita e la riparazione delle cellule nervose, migliorando così la connettività e la funzione delle reti neurali. Questi effetti possono aiutare a migliorare la memoria, la capacità di apprendimento e la velocità di pensiero e possono anche prevenire lo sviluppo di disfunzioni cognitive e malattie neurodegenerative.

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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti dalla Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health (pubblicazioni NIH numero 80–23) rivista nel 2011. Le fonti dei materiali chiave sono state elencate nella tabella delle risorse chiave nei Materiali supplementari.

Animali e progettazione sperimentale

Topi maschi C57BL/6 J di otto settimane, del peso di 19-22 g, sono stati alloggiati in una stanza mantenuta in condizioni ambientali costanti (temperatura 22-24 gradi, ciclo luce/buio di 12 ore e umidità del 50 ± 10%) con libero accesso al cibo. e acqua.

A tutti è stato permesso di acclimatarsi per una settimana prima degli esperimenti. Nel primo esperimento sono stati assegnati in modo casuale ai seguenti gruppi: (1) gruppo di controllo (non esposto ad anestesia e intervento chirurgico), (2) gruppo di esercizi (esercitato al 35-40% della capacità massima, ma non esposto ad anestesia e intervento chirurgico) , (3) gruppo chirurgico (esposizione dell'arteria carotide sinistra per 15 minuti in anestesia con isoflurano per 2 ore), e da (4) a (6) gruppi Exe-l+Sur, Exe-m+Sur ed Exe-h+Sur: esercitato a 35 -40%, 55-60% e 75-80% della capacità massima, rispettivamente, e sono stati sottoposti ad anestesia e intervento chirurgico.

Gli animali sono stati utilizzati per test di apprendimento e memoria a partire da 4 giorni dopo l'intervento (n=20) oppure i loro cervelli sono stati raccolti per analisi biochimiche a 6 ore, 24 ore, 48 ore, 72 ore, 96 ore e 7 giorni dopo l'intervento (n=9 o 14), per la colorazione immunofluorescente a 48 ore e 19 giorni dopo l'intervento (n=6) e per la colorazione di Golgi a 19 giorni dopo l'intervento (n=8).

Sangue e feci dai topi dei primi 4 gruppi sono stati raccolti per la misurazione degli SCFA 7 giorni dopo l'intervento (n=7) e per le analisi di 16 S a 3 e 7 giorni dopo l'intervento (n=8) o a alla fine del protocollo di esercizi della 4-settimana (n=8) ​​o all'ora corrispondente nei primi 2 gruppi (n=16). I topi per la raccolta dei tessuti erano diverse coorti di topi utilizzati per test di apprendimento e di memoria. Nel secondo esperimento, i topi sono stati assegnati in modo casuale a (1) il gruppo Transcontrol+Sur e (2) il gruppo Trans-exe+Sur.

I topi del primo gruppo hanno ricevuto 500 ul di soluzione fecale dal gruppo di controllo mediante sonda gastrica e 600 ul mediante clistere una volta al giorno per 7 giorni consecutivi dopo il trattamento antibiotico per eliminare il microbiota intestinale nativo nei riceventi. I topi del secondo gruppo hanno ricevuto 500 ul di soluzione fecale da topi sottoposti a attività fisica tramite sonda gastrica e 600 ul tramite clistere una volta al giorno per 7 giorni consecutivi dopo il trattamento antibiotico. Le feci dei riceventi sono state raccolte 14 giorni dopo il trapianto fecale per l'analisi 16 S. I topi sono stati poi sottoposti a intervento chirurgico.

L'apprendimento e la memoria sono stati valutati 4 giorni dopo l'intervento chirurgico (n=15). Il cervello è stato raccolto per studi biochimici come nel primo esperimento (n=10). Nel terzo esperimento, i topi sono stati assegnati in modo casuale a (1) il gruppo Transcontrol e (2) il gruppo Trans-control+Sur. I topi di entrambi i gruppi hanno ricevuto il trapianto di feci da topi di controllo. Il secondo gruppo è stato sottoposto ad un intervento chirurgico 14 giorni dopo il trapianto fecale. L'ippocampo è stato raccolto 2 giorni dopo l'intervento chirurgico per misurare il GDNF (n=10). Nel quarto esperimento, i topi sono stati assegnati in modo casuale a (1) il gruppo di controllo (topi naïve che non erano stati esposti ad alcuna delle condizioni sperimentali descritte in questo studio), (2) il gruppo antibiotico che ha ricevuto antibiotici per 7 giorni e (3) il gruppo trans-controllo che ha ricevuto il trapianto di feci da topi di controllo.

L'apprendimento e la memoria sono stati valutati 19 giorni dopo il completamento del trapianto fecale (26 giorni dopo il completamento del trattamento antibiotico nel gruppo antibiotico) (n=12). Nel quinto esperimento, i topi sono stati assegnati in modo casuale a (1) il gruppo di controllo, (2) il gruppo Trans-controllo che ha ricevuto il trapianto di feci da topi di controllo e (3) il gruppo Trans-chirurgico che ha ricevuto feci da trapianto da topi chirurgici. 

Il trapianto fecale è stato eseguito come descritto nel secondo esperimento. Le feci dei riceventi sono state raccolte 14 giorni dopo il trapianto fecale per l'analisi 16 S (n=10). L'apprendimento e la memoria sono stati valutati 4 giorni dopo la raccolta del campione fecale (n=17). Nel sesto esperimento, i topi sono stati assegnati in modo casuale a (1) gruppo chirurgico più soluzione salina normale che ha ricevuto 200 µl di soluzione salina normale (NS) mediante iniezione intraperitoneale una volta una settimana per 4 settimane e poi intervento chirurgico, (2) esercizio fisico più soluzione fisiologica più gruppo chirurgico che ha ricevuto 200 µl di NS mediante iniezione intraperitoneale una volta alla settimana durante la 4- settimana di esercizio al 35–40% della capacità massima e poi intervento chirurgico, (3 ) gruppo di esercizio più acido valerico più intervento chirurgico che ha ricevuto acido valerico (200 mg/kg in 200 µl) mediante iniezione intraperitoneale una volta alla settimana durante la 4- settimana di esercizio al 35–40% della capacità massima e poi intervento chirurgico.

L'iniezione è stata somministrata la mattina del primo giorno di attività fisica della settimana. Un'ulteriore iniezione è stata eseguita il giorno dell'intervento. I risultati comportamentali (n=13) e biochimici (n=10) sono stati valutati come nel secondo esperimento. Nel settimo esperimento, maschio C57BL/ Topi 6 J sono stati assegnati in modo casuale a (1) il gruppo di controllo, (2) il gruppo NS che ha ricevuto 4 µl di NS mediante iniezioni intracerebroventricolari una volta al giorno per 4 giorni consecutivi e (3) il gruppo di acido valerico che ha ricevuto 4 mg/kg in 4 µl mediante intracerebroventricolare iniezione una volta al giorno per 4 giorni consecutivi. I cerebroventricoli sinistro e destro sono stati iniettati secondo uno schema alternato. L'apprendimento e la memoria sono stati valutati 4 giorni dopo l'iniezione (n=15).

Nell'ottavo esperimento, i topi sono stati assegnati in modo casuale a (1) gruppo intervento chirurgico più dimetilsolfossido (DMSO) che ha ricevuto DMSO mediante iniezione intracerebroventricolare una volta al giorno per 4 giorni consecutivi a partire dal giorno dell'intervento, (2) gruppo intervento chirurgico più antagonista C3ar che ha ricevuto antagonista C3ar (SB290157 ) mediante iniezione intracerebroventricolare una volta al giorno per 4 giorni a partire dal giorno dell'intervento, (3) esercizio più DMSO più gruppo chirurgico che ha ricevuto DMSO mediante iniezione intracerebroventricolare una volta al giorno per 4 giorni consecutivi a partire dal giorno dell'intervento dopo la 4- settimana di esercizio a 35 –40% della capacità massima e (4) gruppo di esercizio più agonista C3ar più intervento chirurgico che ha ricevuto un C3aragonista mediante iniezione intracerebroventricolare una volta al giorno per 4 giorni consecutivi a partire dal giorno dell'intervento dopo l'esercizio della 4- settimana al 35–40% della capacità massima . I test comportamentali sono stati avviati 4 giorni dopo l'intervento chirurgico come indicato sopra (n=15).

Nel nono esperimento, i topi sono stati assegnati in modo casuale a (1) il gruppo di controllo, (2) il gruppo chirurgico, (3) il gruppo chirurgico più GDNF che ha ricevuto GDNF mediante iniezione intracerebroventricolare quando hanno subito un intervento chirurgico e (4) il gruppo chirurgico più GDNF inattivato dal calore. gruppo che ha ricevuto GDNF inattivato dal calore mediante iniezione intracerebroventricolare quando hanno subito un intervento chirurgico. Gli ippocampi sono stati raccolti 48 ore dopo l'intervento chirurgico per lo studio ELISA (n=12). Dopo una settimana di acclimatazione, topi vecchi (topi maschi C57BL/6 J di 18- mesi) del peso di 30–36 g sono stati utilizzati in tre studi. Nel primo esperimento, i topi anziani sono stati assegnati in modo casuale a (1) il gruppo di controllo, (2) il gruppo di esercizi in cui i topi hanno svolto un esercizio per 4- settimane al 35-40% della capacità massima, (3) il gruppo chirurgico e (4) il gruppo Exe+Sur in cui i topi hanno svolto un esercizio di 4-settimana al 35-40% della capacità massima prima dell'intervento chirurgico. Gli animali sono stati utilizzati per test di apprendimento e memoria a partire da 4 giorni dopo l'intervento (n=12) oppure i loro cervelli sono stati raccolti per analisi biochimiche a 48 ore dopo l'intervento (n=10 o 12), per la colorazione immunofluorescente a 48 ore e 19 giorni dopo l'intervento (n=6) e per la Golgicolorazione a 19 giorni dopo l'intervento (n=8).

Sangue e feci dai topi dei 4 gruppi sono stati raccolti per la misurazione degli SCFA 7 giorni dopo l'intervento (n=7) e per le analisi di 16 S a 3 e 7 giorni dopo l'intervento (n=8) o alla fine di 4-protocollo di esercizi della settimana o all'orario corrispondente nei primi 2 gruppi (n=16). I topi per la raccolta dei tessuti erano gruppi diversi utilizzati per test di apprendimento e di memoria. Nel secondo esperimento, i topi anziani sono stati assegnati in modo casuale a (1) il gruppo Trans-Old Control+Sur e (2) al gruppo Trans-Old Exe+Sur. Questi topi sono stati sottoposti a intervento chirurgico 14 giorni dopo il trapianto fecale come descritto nella tabella secondo esperimento su topi giovani adulti. L'apprendimento e la memoria sono stati valutati a partire da 4 giorni dopo l'intervento chirurgico (n =10).

Nel terzo esperimento, i topi anziani sono stati assegnati in modo casuale al gruppo (1) chirurgia più NS; (2) gruppo di esercizi più NS più intervento chirurgico; e (3) gruppo di esercizio fisico più acido valerico più intervento chirurgico. Questi topi hanno ricevuto esercizio fisico e acido valerico come descritto nel sesto esperimento su topi giovani adulti. I risultati comportamentali sono stati testati a partire da 4 giorni dopo l'intervento chirurgico (n=11). Le dimensioni del campione (n) descritte sopra rappresentavano il numero di animali randomizzati in ciascun gruppo/condizione. Questo numero di animali era la somma di almeno 3 repliche di ciascun esperimento. Gli animali sono stati distribuiti casualmente in gruppi in base a tabelle di randomizzazione generate dal computer in ciascun esperimento.

Determinazione della capacità massima di esercizio e allenamento all'esercizio

Prima dell'intervento chirurgico, i topi di {{0}}settimana e 18-mese sono stati esposti a un esercizio aerobico su tapis roulant per 4-settimana dopo aver determinato la massima capacità di esercizio dei singoli topi. Questa determinazione è stata eseguita in modo simile a quelli descritti prima [47, 48]. In breve, i topi sono stati acclimatati al tapis roulant il primo giorno con le impostazioni iniziali della griglia d'urto a 25 V, 0,3 mA e 2 Hz e velocità e inclinazione a zero per 10 minuti. La velocità del tapis roulant è stata quindi aumentata a 10 cm/s con l'inclinazione impostata su 50 per 10 minuti. Successivamente, la velocità e l'inclinazione del tapis roulant sono state aumentate a 15 cm/sabbia 100 per 5 minuti.

The speed was then increased by 5 cm/s every 5 min to an average maximal speed of 70 cm/s in young mice and 60 cm/s in old mice (around 65–75 cm/s and 55–65 cm/s, respectively), as they reached the criteria for exercise-induced exhaustion. These criteria were: (1) 10 consecutive seconds on the electric grid; (2) spending >50% del tempo in rete; e/o (3) mancanza di motivazione all'incitamento manuale. Il mouse veniva immediatamente rimosso dalla rispettiva corsia una volta soddisfatti uno o più di questi criteri. Il giorno successivo, i topi correvano sullo stesso tapis roulant a metà della velocità massima media (35 cm/s nei topi giovani o 30 cm/s nei topi anziani) e con un'inclinazione di 100 fino a raggiungere nuovamente uno dei criteri di esaurimento, e la durata della corsa. l'esercizio continuo è stato registrato come capacità di esercizio massima di ciascun topo. Dopo questi due protocolli, i topi sono stati alloggiati separatamente per 30 minuti per evitare comportamenti aggressivi evidenti in seguito all'esercizio.

After resting for 2 days, mice assigned to exercise training groups were subjected to a 4-week protocol of forced treadmill running at 35–40%, 55–60%, or 75–80% of the maximal capacity, respectively, for 5 days a week. Mice that were shocked for >5% of the total daily exercise time in 2 consecutive days or >Verrebbe escluso il 3% del tempo totale in 3 giorni consecutivi.

I gruppi che non facevano esercizio fisico nella stessa serie di esperimenti dei gruppi che facevano esercizio fisico venivano posti quotidianamente su un tapis roulant fermo per circa 30-40 minuti. Hanno ricevuto 10 scariche per un totale di 5 secondi, la quantità media di scosse che i topi di un gruppo di esercizi ricevevano ogni giorno, durante la loro permanenza su un tapis roulant fermo. Se una serie di esperimenti non prevedeva un gruppo di esercizi, nessun topo nella serie di esperimenti riceveva shock.

Trattamento antibiotico

Per facilitare la colonizzazione del microbiota trapiantato, ai topi riceventi è stato somministrato un trattamento antibiotico una volta al giorno per 7 giorni consecutivi per eliminare il loro microbiota intestinale originale, come descritto da noi e da altri [11, 36]. In breve, dopo la purga con solfato di magnesio al 10% (200 ul/10 g, due volte a intervalli di 3 ore) mediante sonda gastrica il primo giorno, i topi C57BL/6 J hanno ricevuto amoxicillina/acido clavulanico (200 mg/kg), metronidazolo ( 200 mg/kg) e cefazolina (2 g/kg) mediante sonda gastrica e clistere (in 300 ul per sonda gastrica e 400 ul NS per clistere) al mattino una volta al giorno per 7 giorni consecutivi, e amoxicillina/acido clavulanico (20 mg/kg ), metronidazolo (20 mg/kg) e cefazolina (300 mg/kg) in 200 ul di NS al giorno mediante iniezione intraperitoneale per gli stessi 7 giorni (dalle 16:00 alle 17:00). Per prevenire la contaminazione batterica incrociata, la manipolazione dei topi e il cambio quotidiano della gabbia e delle bottiglie d'acqua sono stati eseguiti da tecnici che indossavano un camice pulito e guanti in un cappuccio ventilato. Le feci di questi topi sono state raccolte 24 ore dopo l'ultimo trattamento per analisi 16 S per determinare l'effetto.

Trapianto fecale

Pellet fecali freschi raccolti entro 30 minuti dopo il movimento intestinale da topi di controllo, topi immediatamente dopo il completamento dell'esercizio di 4-settimana, o topi da 2 a 8 giorni dopo l'intervento chirurgico sono stati diluiti con 100 mg/ml di soluzione salina sterile. Tutti i pellet fecali di 7 –10 donatori con ciascuna condizione sperimentale sono stati mescolati e risospesi insieme in soluzione salina. In breve, la materia fecale è stata miscelata in vortex per 5 minuti e quindi fatta passare attraverso un filtro cellulare in nylon da 70 μm per rimuovere il cibo non digerito e i materiali particolati. I topi riceventi hanno ricevuto 500 ul della soluzione fecale corrispondente mediante sonda gastrica al mattino e 600 ul mediante clistere nel pomeriggio a partire da 24 ore dopo l'ultima dose di antibiotici per 7 giorni consecutivi. I topi trapiantati sono stati mantenuti per 2 settimane dopo il trapianto fecale prima di essere sottoposti a raccolta fecale per analisi 16 S e intervento chirurgico.

Anestesia e chirurgia

L'intervento chirurgico prevedeva l'esposizione dell'arteria carotide sinistra come descritto in precedenza [6]. Brevemente, i topi sono stati anestetizzati con isoflurano al 2% e hanno mantenuto la respirazione spontanea con una maschera facciale fornita con l'100% di ossigeno durante la procedura. La temperatura rettale è stata monitorata e mantenuta a 37 gradi con l'ausilio di una coperta riscaldante. Sono state eseguite un'incisione sulla linea mediana del collo di 2- cm e una dissezione dei tessuti molli con esposizione dell'arteria comune lunga 1- cm senza alcun danno al nervo vago dopo che il topo era stato anestetizzato con isoflurano per almeno 20 minuti. La ferita è stata quindi irrigata e chiusa utilizzando una sutura chirurgica 4-0. La procedura chirurgica è stata eseguita in condizioni sterili ed è durata circa 15 minuti nei topi giovani e 12 minuti nei topi vecchi. La durata totale dell'anestesia generale è stata di 2 ore. Dopo l'intervento, tutti gli animali hanno ricevuto un'iniezione sottocutanea di 3 mg/kg di bupivacaina. Durante l'anestesia non è stata osservata alcuna risposta al pizzicamento delle dita dei piedi.

Iniezioni intracerebroventricolari

Come descritto sopra, alcuni gruppi di topi hanno ricevuto un'iniezione intracerebroventricolare. In breve, questi topi sono stati posizionati in una struttura stereotassica per la testa in posizione prona. Il sito di iniezione era situato a: 1,00 mm mediolaterale, −0 0,3 mm anteroposteriore da Bregma e −2,5 mm di profondità dorsoventrale. I topi in chirurgia più il gruppo GDNF hanno ricevuto un'iniezione intracerebroventricolare di 1{{ 20}} ug/kg di GDNF di topo ricombinante in 3 ul di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) come descritto in studi precedenti [6, 26], e i topi sottoposti a intervento chirurgico più il gruppo GDNF inattivato con il calore hanno ricevuto un'iniezione di soluzione denaturata al calore (5 minuti a 1000 °C ) Soluzione GDNF. I topi sottoposti a intervento chirurgico più il gruppo antagonista C3ar hanno ricevuto 10 ug/kg di SB290157 in 3 ul di PBS contenente il 5% di DMSO a 0 ore, 24 ore, 48 ore e 72 ore dopo l'intervento. I topi del gruppo esercizio più agonista C3ar e gruppo intervento chirurgico hanno ricevuto 1 ug/kg di agonista C3ar in 3 ul di PBS contenente il 5% di DMSO contemporaneamente a SB290157. I topi del gruppo acido valerico del sesto esperimento hanno ricevuto 4 mg/kg di acido valerico in 4 µl per 4 giorni consecutivi.

Test comportamentali

L'apprendimento e la memoria sono stati valutati mediante il riconoscimento di nuovi oggetti e il test del labirinto di Barnes. Tutti i test comportamentali sono stati condotti dalle 10:00 alle 17:00 in una stanza insonorizzata. I topi utilizzati nei test di apprendimento e memoria non sono stati utilizzati per studi biochimici per evitare gli effetti di questi test.

Test di riconoscimento di oggetti nuovi

Come noi e altri abbiamo descritto in precedenza [20, 49, 50], i topi sono stati messi in una camera a campo aperto per 5 minuti per abituarsi 4 giorni dopo l'intervento. Il test è stato eseguito nel modo seguente. Due degli stessi oggetti sono stati posizionati agli angoli adiacenti della camera il giorno dell'apprendimento. I topi sono stati messi nella camera con la schiena rivolta verso gli oggetti e lasciati esplorare liberamente la camera per 5 minuti. L'animale veniva eliminato se il tempo totale di esplorazione su due oggetti era pari<5 s. One of the objects was replaced by a novel object 30 seconds or 24 hours later. The mouse was put into the chamber with their backs turned toward the objects and allowed to explore for 5 min. Animal behavior was recorded by ANY-maze behavioral tracking software (Stoelting Co., IL). Exploratory time of new (T2) and old (T1) objects within 5 min was recorded and the memorization ability of the mouse was quantified by discrimination index: DI = T2 / (T1 + T2). The DIs at 30 s and 24 hours after the training reflected the instant and long-term memory, respectively. The field was always provided with even light, and the objects and fields were cleaned with 70% ethanol after each test.

Labirinto di Barnes

Sette giorni dopo l'intervento chirurgico, gli animali sono stati sottoposti al labirinto di Barnes per testare il loro apprendimento spaziale e la memoria come descritto in precedenza [6, 49]. Il labirinto di Barnes è una piattaforma circolare con 20 fori equidistanti (SDInstruments, San Diego, CA). Uno dei buchi era collegato a una camera oscura chiamata scatola bersaglio. Il test è iniziato posizionando gli animali al centro del labirinto di Barnes. Sono stati utilizzati rumore avverso (85 dB) e luce intensa (200 W) diffusi sulla piattaforma per incoraggiare i topi a trovare questa scatola. Dopo un allenamento di 4 giorni, la loro memoria di riferimento è stata testata il giorno 5 e il giorno 12. Durante il periodo non è stato eseguito alcun test. dal giorno 5 al giorno 12. La latenza per entrare nella casella target durante ciascuna prova è stata registrata da un sistema di tracciamento video ANYMaze (SD Instruments).

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