Metodi genetici combinatori per scoprire combinazioni regolatorie di ordine elevato e driver genetici ingegneristici per la differenziazione neurale

Immergersi nella ricerca di fattori di differenziazione cellulare efficaci

I ricercatori stanno ancora cercando di trovare terapie migliori per invertire o rallentare la progressione di disturbi neurologici come il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer e la malattia di Huntington. Questi disturbi sono il risultato della morte delle cellule neuronali in diverse parti del cervello. I farmaci o i trattamenti utilizzati per alleviare i sintomi nei pazienti non sono stati ben definiti.

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Non recuperano i tessuti neurali danneggiati e possono causare effetti collaterali indesiderati. Pertanto, un numero crescente di studi guarda alle cellule staminali come a una terapia promettente, a causa delle loro capacità di auto-rinnovamento e flessibilità di differenziazione nei lignaggi cellulari desiderati per l'attecchimento nel paziente per recuperare i tessuti neurali persi.

Tuttavia, prima che le cellule staminali possano essere utilizzate clinicamente nel trattamento dei disturbi neurologici, ci sono ancora aree che richiedono una migliore comprensione per sbloccare il loro pieno potenziale. Le cellule staminali sono rigenerative e malleabili, con la propensione a diventare qualsiasi tipo di cellula data la giusta combinazione di fattori per guidare la differenziazione. Tuttavia, c'è una profondità di complessità nella vasta rete di fattori.

È importante determinare le combinazioni di fattori di trascrizione (TF), piccole molecole e/o fattori di crescita per ottenere il sinergismo ottimale per differenziare le cellule staminali, comprese le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte al ritmo più veloce, con conseguente nella popolazione più pura di un lignaggio neuronale. Tuttavia, potrebbe esserci un modo strategico per esaminare questi fattori in modo più efficiente in termini di costi e tempi.

Ciò contribuirebbe a ottimizzare i protocolli già stabiliti che sono ancora laboriosi o per un'ulteriore caratterizzazione di sottotipi neuronali come neuroni spinosi medi, neuroni sensoriali e neuroni serotoninergici. Rimane una sfida profilare i driver del destino neuronale in modo completo e definire come questi elementi interagiscono tra loro nella rete regolatoria.

Alcuni gruppi hanno utilizzato nuovi approcci di screening ad alto rendimento per chiarire la rete regolatoria del destino cellulare e hanno fornito approfondimenti informativi sui fattori che guidano la conversione e la sopravvivenza neuronale. Liu et al. (2018) hanno utilizzato l'attivazione CRISPR (CRISPRa) per cercare TF o fattori di legame al DNA che promuovono il destino neuronale delle ESC. Tuttavia, il lavoro si è limitato allo studio di singoli fattori o combinazioni a coppie.

Un altro screening sistematico è stato condotto da Tsunemoto et al. (2018), che ha indagato la relazione tra TF. La maggior parte dei TF singoli selezionati non ha mostrato effetti nello studio, tuttavia, hanno identificato 76 combinazioni di TF a coppie per promuovere la differenziazione dei fibroblasti di topo in neuroni indotti.

In particolare, i loro risultati mancavano di una certa coerenza con studi precedenti, come il mancato rilevamento del trasportatore attivo della dopamina Slc6a3 nei neuroni indotti, probabilmente a causa della mancanza di fattori aggiuntivi. Un altro studio ha determinato i geni essenziali per mantenere o migliorare la sopravvivenza dei neuroni conducendo uno screening basato sull'interferenza CRISPR (CRISPRi) (Tian et al., 2019). E ancora, erano limitati allo screening di singoli sgRNA.

Sono necessari ulteriori studi per uno screening imparziale per altri fattori genetici e per aumentare il numero di combinazioni di fattori, poiché è stato dimostrato che un cocktail di più di due fattori può essere richiesto in contesti diversi per guidare in modo efficiente la differenziazione e la riprogrammazione.

Un buon esempio è la combinazione di Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc, necessaria per regolare la rete di segnalazione dello sviluppo per la pluripotenza delle ESC (Takahashi e Yamanaka, 2006). In tali sistemi complessi, è necessario caratterizzare in modo completo le funzioni delle combinazioni genetiche di ordine elevato in un modo ad alto rendimento e il metodo Combinatorial Genetics En Masse (CombiGEM) potrebbe essere in grado di farlo.

Metodo CombiGEM per uno screening sistematico, di ordine elevato e ad alto rendimento delle combinazioni di fattori

CombiGEM offre non solo un modo sistematico di condurre schermi in pool su larga scala, ma ha anche la capacità di assemblaggio scalabile di librerie genetiche combinatorie di alto ordine (Wong et al., 2015, 2016; Zhou et al., 2020). Il processo one-pot consente all'utente di selezionare una moltitudine di combinazioni genetiche; 1-way, 2-way, 3-way e, in teoria, librerie a n vie.

Ciò fornisce una rapida alternativa al processo convenzionale di costruzione e verifica di singole combinazioni candidate di interesse. Mentre sono state sviluppate anche diverse altre strategie di screening CRISPR combinatorio per lo studio di combinazioni genetiche a coppie (Han et al., 2017; Shen et al., 2017; Najm et al., 2018; Truong et al., 2019; DeWeirdt et al., 2020 ), CombiGEM offre un'opportunità unica per valutare le interazioni tra tre o più combinazioni genetiche.

Ad esempio, se l'utente intende utilizzare CRISPRa o CRISPRi per sovraesprimere o reprimere, rispettivamente, un elenco di combinazioni TF candidate, è possibile eseguire lo screening di una libreria con codice a barre di combinazioni di sgRNA con targeting per TF utilizzando CombiGEM-CRISPR v2.0 ( Wong et al., 2016; Zhou et al., 2020) come illustrato nella Figura 1.

Utilizzando passaggi di ligazione one-pot, la libreria di sgRNA e i rispettivi codici a barre vengono incorporati in un vettore di destinazione lentivirale che riporta l'espressione di una proteina fluorescente all'attivazione di un promotore specifico del tipo di cellula neuronale, come la tubulina 1. La libreria di sgRNA e un vettore lentivirale separato che ospita il Cas9 enzimaticamente carente fuso con un attivatore o repressore trascrizionale può essere consegnato nelle cellule di partenza desiderate.

Nel corso del tempo, quando le cellule iniziano a differenziarsi, solo le cellule simili a neuroni indotte esprimeranno la fluorescenza e queste cellule possono essere isolate utilizzando l'ordinamento delle cellule attivato dalla fluorescenza per recuperare le combinazioni di TF che ospitano tramite il sequenziamento del codice a barre.

Per ottenere una migliore comprensione delle combinazioni che guidano specifici lignaggi cellulari, queste cellule possono anche essere sondate per noti reporter o marcatori di discendenza cellulare in base alla preferenza delle fasi di differenziazione che l'utente sceglie di studiare. L'ordinamento cellulare attivato magneticamente potrebbe essere utilizzato per separare le cellule di interesse a seconda delle espressioni del marcatore di superficie cellulare.

Il sequenziamento dell'RNA a cellula singola potrebbe essere accoppiato allo screening combinatorio CRISPR come lettura per profilare il tipo e i livelli di gene up o downregulation e la combinazione di TF mirati può essere determinata tramite le letture del codice a barre (Replogle et al., 2020). L'imaging ad alto contenuto potrebbe essere utilizzato per monitorare i cambiamenti della morfologia cellulare dalle fasi iniziali a quelle successive dello sviluppo dei neuroni.

La rilevanza fisiologica o la funzionalità delle cellule simili a neuroni indotte può essere determinata mediante etichettatura immunocitochimica specifica per la maturazione dei neuroni, come NeuN, TUJ1 e MAP2 e misure elettrofisiologiche. Come accennato in precedenza, gli studi hanno combinato TF e piccole molecole per manipolare il destino cellulare.

CombiGEM può anche essere utilizzato per identificare combinazioni di piccole molecole che possono mantenere l'auto-rinnovamento delle cellule staminali, indurre la differenziazione della linea cellulare o facilitare la riprogrammazione aumentando l'efficienza e potenzialmente sostituendo i fattori genetici. CombiGEM può anche essere applicato determinando prima i piccoli bersagli molecolari delle vie di segnalazione, i fattori di processo epigenetico o cellulare.

Quindi, progettando una libreria di sgRNA per attivare o inattivare i bersagli drogabili, è possibile identificare le combinazioni efficaci di piccole molecole per migliorare la differenziazione o la riprogrammazione. Questo concetto è ben riflesso dagli studi che abbiamo condotto in precedenza per scoprire combinazioni di bersagli farmacologici contro il cancro e il morbo di Parkinson (Zhou et al., 2020).

L'uso di CombiGEM non è solo limitato alle perturbazioni basate su CRISPR, ma potrebbe anche essere applicato ad altri fattori regolatori del DNA o dell'RNA per studiare gli schermi di perdita di funzione con l'interferenza dell'RNA, nonché quelli di guadagno di funzione con l'espressione di microRNA (Wong et al., 2015) e frame di lettura aperti umani verificati in sequenza come quelli riportati nella libreria TFome umana (Ng et al., 2020).

Metodo CombiSEAL per l'ingegnerizzazione ad alto rendimento dei fattori di trascrizione

Trovare la combinazione ideale di fattori genetici presenti in natura può ancora porre sfide, come essere limitati a TF caratterizzati del genoma con una conoscenza preliminare della loro espressione e ruoli nella differenziazione. Gli studi hanno dimostrato che l'ingegnerizzazione di TF o la generazione di fattori di trascrizione artificiali apre una nuova strada di opzioni per accelerare il tasso di differenziazione attraverso percorsi alternativi, superando la dipendenza dell'espressione prerequisita di altri cofattori endogeni all'interno della rete di regolazione genica o sostituendo del tutto TF naturali con altri più efficienti (Jauch, 2018).

Ciò consente ai ricercatori di adattare i fattori richiesti in base alle loro esigenze sperimentali. Proponiamo che se si mira a condurre mutagenesi ad alto rendimento su più siti in un TF che comprende diversi domini, CombiSEAL potrebbe rivelarsi una piattaforma utile (Choi et al., 2019). Il metodo CombiSEAL assembla frammenti di DNA codificanti amminoacidi che sono contrassegnati in modo combinatorio con codici a barre (Figura 1).

Figura 1 ｜ Metodi CombiGEM e CombiSEAL per lo screening di driver genetici efficaci di differenziazione. Un esempio del metodo CombiGEM è l'assemblaggio di più sgRNA espressi dallo stesso costrutto e le combinazioni di sgRNA sono rappresentate dai loro codici a barre concatenati. Il metodo CombiSEAL comprende mutazioni introdotte in varie parti di una proteina, come i fattori di trascrizione, indicati come P1, P2, P(n) e P(n più 1). E le combinazioni di mutazioni sono riflesse dai corrispondenti codici a barre concatenati. L'utente può applicare le impostazioni ad altri sistemi di consegna del DNA e in questa rappresentazione vengono utilizzati vettori lentivirali. Le strategie di screening possono essere condotte da un formato raggruppato e, in questo esempio, l'identificazione di popolazioni cellulari che si differenziano in uno specifico lignaggio di neuroni viene rilevata dall'attivazione del promotore per l'espressione della proteina fluorescente, etichettata come X-fluorescenza nel diagramma. Il sequenziamento di nuova generazione (NGS) dei codici a barre dal pool di cellule decifrerà i bersagli del DNA o le varianti trascrizionali. L'analisi rigorosa dei fattori che guidano la differenziazione di diversi tipi di neuroni potrebbe utilizzare metodi basati su array come il sondaggio delle cellule con marcatori di lignaggio cellulare seguito da selezione cellulare attivata magneticamente (MACS) in piastre multi-pozzetto, che possono essere seguite con immagini ad alto contenuto. In alternativa, il sequenziamento dell'RNA a cellula singola (RNA-Seq) consente all'utente di profilare le espressioni geniche delle cellule con i fenotipi desiderati e sarebbe in grado di recuperare i codici a barre per identificare le combinazioni di sgRNA o le combinazioni di mutazione delle varianti chiave. FACS: selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.

CombiSEAL inizia con le prime parti di sezionamento della proteina in cui si desidera la mutagenesi. L'utente può generare un numero qualsiasi di varianti per ciascuna sezione, quindi contrassegnarle con codici a barre per identificare la posizione e la combinazione delle mutazioni. Ogni pool di sezioni viene quindi assemblato in sequenza inserendole in un vettore di destinazione che ospita la sequenza proteica di tipo selvaggio modificata con enzimi IIS di tipo fiancheggiante nella regione della mutagenesi prevista.

Questo schema di fusione senza cicatrici che collega più parti di una proteina è importante per evitare l'aggiunta di amminoacidi indesiderati alla proteina. Il metodo CombiSEAL consente di determinare le sequenze di aminoacidi del pool selezionato di varianti di interesse in modo più efficiente ed economico, evitando la necessità di sequenziamento a lunga lettura sull'intera proteina per identificare i tipi di mutazioni e dove si trovano attraverso il proteina.

Questa configurazione metodica consente un'analisi più semplice conducendo un sequenziamento ad alto rendimento del pool di codici a barre concatenati corti che deduce la combinazione di tipi e posizioni delle mutazioni degli amminoacidi o altre modifiche desiderate come lo scambio di domini, l'inserimento e la cancellazione, che erano stati inizialmente progettato e installato sul TF

Conclusione

Rispetto ai metodi per tentativi ed errori, sono stati compiuti progressi nell'impiego di approcci più sistematici per determinare i fattori essenziali o le combinazioni necessarie per guidare la conversione di un tipo cellulare in un lignaggio neuronale. Tuttavia, è mancata la capacità di identificare combinazioni di ordine superiore e qui proponiamo che il metodo CombiGEM possa essere in grado di affrontare tali limitazioni.

CombiGEM utilizza un sistema di legatura one-pot con codice a barre per mettere insieme combinazioni di ordine superiore di fattori di legame del DNA per mirare al DNA in una volta sola, eludendo il processo di più cicli di screening per restringere il numero di risultati a una dimensione gestibile per le convalide a valle . Inoltre, i TF naturali meno efficienti possono essere sostituiti con TF artificiali o ingegnerizzati per regolare meglio l'espressione genica. Descriviamo un metodo di mutagenesi proteica, CombiSEAL, che consentirà agli utenti di creare grandi pool di varianti di fattori di trascrizione semplicemente assemblando più mutazioni del sito contrassegnate con codici a barre all'interno della proteina e dei loro diversi domini.

Ciò accelererà e ridurrà il costo delle procedure di screening per recuperare le informazioni sui tipi di mutazioni delle varianti di interesse. Ci auguriamo che i metodi proposti possano aiutare a comprendere ulteriormente e ampliare le possibilità di promuovere la rigenerazione neurale e possano essere ampiamente applicabili ad altre aree di ricerca.

Il meccanismo dell'effetto neuroprotettivo di Cistanche

Cistanche ha dimostrato di avere effetti neuroprotettivi attraverso diversi meccanismi:

1. Effetti anti-infiammatori: Cistanche contiene composti che hanno dimostrato di inibire l'infiammazione in varie parti del cervello, che possono aiutare a proteggere i neuroni dai danni.

2. Effetti antiossidanti: Cistanche contiene composti che hanno forti proprietà antiossidanti. Gli antiossidanti aiutano a proteggere i neuroni dai danni causati dai radicali liberi e dallo stress ossidativo.

3. Regolazione dei neurotrasmettitori: Cistanche ha dimostrato di regolare alcuni neurotrasmettitori, come la serotonina e la dopamina, che possono aiutare a proteggere i neuroni e migliorare la funzione cognitiva.

4. Stimolazione del fattore neurotrofico: Cistanche ha dimostrato di stimolare la produzione di fattori neurotrofici, come il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), che può promuovere la crescita e la sopravvivenza dei neuroni.

Nel complesso, questi meccanismi lavorano insieme per proteggere i neuroni dai danni, promuoverne la crescita e la sopravvivenza e migliorare la funzione cognitiva.

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Dawn GL Thean, Alan SL Wong*