Il coniugato dendrimero-tesaglitazar induce uno spostamento del fenotipo della microglia e migliora la fagocitosi -amiloide† Parte 1

Il passaggio della microglia da uno stato "pro-infiammatorio" che aggrava la malattia a un fenotipo neuroprotettivo e "antiinfiammatorio" è una strategia promettente per affrontare molteplici malattie neurodegenerative.

Le microglia sono un tipo di cellula del sistema nervoso centrale che è principalmente responsabile del mantenimento della salute e della funzione dei neuroni. Possono secernere una varietà di fattori di crescita e fattori neurotrofici e possono mantenere la normale attività metabolica dei neuroni eliminando i materiali di scarto attorno ai neuroni. Gli studi degli ultimi anni hanno dimostrato che le microglia sono strettamente correlate alla memoria. Diamo un'occhiata insieme.

Innanzitutto, le microglia possono stimolare i neuroni e promuovere l’attivazione dei neuroni, migliorando così la memoria. Rilasciando una serie di neurotrasmettitori, come il glutammato e l'alanina, la microglia può promuovere la trasmissione del segnale tra neuroni e può migliorare la risonanza del segnale neurone gliale tra le membrane presinaptiche, promuovendo ulteriormente l'eccitabilità neuronale e la formazione della memoria.

In secondo luogo, le microglia possono anche eliminare le scorie attorno ai neuroni, mantenere la normale attività metabolica dei neuroni e ridurre la mortalità neuronale, promuovendo così il miglioramento della memoria. Quando troppa spazzatura si accumula attorno ai neuroni, ciò influenzerà la normale attività metabolica dei neuroni, portando alla morte neuronale e all’indebolimento della funzione, riducendo così le prestazioni della memoria. La microglia può mantenere il normale ambiente metabolico dei neuroni e ridurre la mortalità neuronale fagocitando e decomponendo i rifiuti circostanti, migliorando così la memoria.

In sintesi, le microglia sono strettamente correlate alla memoria. Promuovendo l’eccitazione dei neuroni e l’eliminazione dei rifiuti circostanti, le microglia possono migliorare ulteriormente la memoria e mantenere il nostro cervello sano e attivo. Dovremmo prestare attenzione alla protezione della salute delle microglia per ottenere una memoria migliore. Si può vedere che dobbiamo migliorare la memoria e la Cistanche può migliorare significativamente la memoria perché è un materiale medicinale tradizionale cinese con molti effetti unici, uno dei quali è quello di migliorare la memoria. L'efficacia di Cistanche deriva dai vari principi attivi che contiene, tra cui acido tannico, polisaccaridi, glicosidi flavonoidi, ecc. Questi ingredienti possono promuovere la salute del cervello in vari modi.

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Le microglia proinfiammatorie contribuiscono alla progressione della malattia rilasciando sostanze neurotossiche e accelerando l'accumulo di proteine ​​patogene. È stato dimostrato che sia PPAR che gli agonisti PPAR spostano la microglia da un fenotipo proinfiammatorio ("M1-like") a un fenotipo attivato in modo alternativo ("M2-like"). Tali strategie sono state esplorate in studi clinici per malattie neurologiche, come l'Alzheimer e il morbo di Parkinson, ma probabilmente hanno fallito a causa della loro scarsa penetrazione nella barriera emato-encefalica (BBB).

È stato dimostrato che i dendrimeri di poliammidoammina terminati con idrossile (senza il collegamento di alcun ligando bersaglio) attraversano la BBB danneggiata nel sito di neuroinfiammazione e si accumulano nella microglia attivata.

Pertanto, la coniugazione del dendrimero di un PPAR/doppio agonista può consentire una commutazione fenotipica mirata della microglia attivata. Qui presentiamo la sintesi e la caratterizzazione di un nuovo coniugato dendrimero-PPAR/doppio agonista (D-tesaglitazar).

In vitro, D-tesaglitazar induce uno spostamento del fenotipo da 'M1 a M2', diminuisce la secrezione di specie reattive dell'ossigeno, aumenta l'espressione dei geni per la fagocitosi e la degradazione enzimatica delle proteine ​​patogene (ad esempio α-amiloide, α-sinucleina) e aumenta la fagocitosi α-amiloide.

Questi risultati supportano l'ulteriore sviluppo di D-tesaglitazar verso molteplici malattie neurodegenerative, in particolare il morbo di Alzheimer e il morbo di Parkinson.

Introduzione

Nei soli Stati Uniti, attualmente ci sono oltre 5,3 milioni di persone affette dal morbo di Alzheimer (AD) e 1 milione di persone affette da morbo di Parkinson (PD).1 Poiché l’aumento dell’età è il principale fattore di rischio per molte malattie neurodegenerative, la prevalenza e il costo del trattamento per queste malattie continuerà ad aumentare man mano che la popolazione continua a invecchiare.

Inoltre, la mancanza di recenti successi nello sviluppo di nuovi farmaci per il trattamento di queste malattie ha evidenziato la necessità di sviluppare terapie innovative.2,3 Questi fallimenti clinici evidenziano le difficoltà nello sviluppo di un farmaco, inclusa la somministrazione di una concentrazione sufficientemente elevata del farmaco al cervello per ottenere efficacia senza causando effetti collaterali negativi.

Le malattie neurodegenerative come l'AD e il PD condividono tre principali componenti neuropatologiche: neuroinfiammazione, accumulo di proteine ​​patogene e morte neuronale.4-7 Nelle persone non sane, le cellule immunitarie innate del cervello (microglia) fagocitano costantemente le proteine ​​mal ripiegate (ad es. -amiloide, -sinucleina). ) che causano la morte neuronale man mano che vengono prodotti, impedendo la formazione degli aggregati caratteristici.

Tuttavia, nelle persone che eventualmente sviluppano malattie neurodegenerative, la microglia non rimuove più queste proteine ​​in modo efficace e si trasforma in un fenotipo proinfiammatorio che aggrava la malattia (tipicamente designato come M1).

Sebbene la classificazione prevalentemente pro-infiammatoria/antinfiammatoria (M1/M2) dell'attivazione microgliale sia una semplificazione eccessiva dello spettro di polarizzazione dei macrofagi, viene ancora utilizzata come nomenclatura ampia per descrivere il fenotipo dominante della microglia nella neuroinfiammazione e nella risposta alla terapia.

Le microglia simili a M1- rilasciano specie reattive dell'ossigeno e altri mediatori infiammatori che inducono la morte neuronale ed esacerbano la patologia della malattia aumentando la produzione di proteine ​​patogene (ad esempio -amiloide, -sinucleina).

Inoltre, i principali fattori di rischio genetici per lo sviluppo dell'AD (TREM2 e APOE) sono espressi ad alti livelli nella microglia, ed è stato dimostrato che la via TREM2/APOE causa uno spostamento del fenotipo amicrogliale nell'AD, nella sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e nella sclerosi multipla modelli animali.8

Questi risultati dimostrano ulteriormente il ruolo della microglia nella patologia di molteplici malattie neurodegenerative umane. Un approccio per manipolare il fenotipo delle microglia consentirebbe ai ricercatori di comprendere il loro ruolo nelle malattie neurodegenerative, oltre a costituire potenzialmente un efficace terapeutico.

Il passaggio della microglia da un fenotipo M1 a un fenotipo antinfiammatorio e neuroprotettivo (M2) è stato proposto come strategia terapeutica per il trattamento di molteplici malattie neurodegenerative.5,6 Due agonisti PPAR attualmente approvati dalla FDA, i farmaci per il diabete di tipo II rosiglitazone e pioglitazone, hanno dimostrato di indurre un Cambiamento del fenotipo da M1 a M2 nei macrofagi e nella microglia in vitro e in vivo.

9,10 È stato dimostrato che gli agonisti PPAR riducono la secrezione di specie reattive dell'ossigeno indotta da LPS riducendo l'attività di NF-κB inducendo la degradazione e l'esportazione di NF-κB dal nucleo, nonché la transrepressione dipendente dal ligando.11

Inoltre, studi epidemiologici hanno dimostrato che i pazienti diabetici che assumono rosiglitazone o pioglitazone hanno un rischio ridotto di sviluppare AD e PD.12 Successivamente, rosiglitazone e pioglitazone sono stati studiati attraverso studi clinici di fase III per l'AD, ma hanno fallito.13

Una probabile spiegazione del fallimento dei suddetti studi clinici è lo scarso trasporto di questi farmaci attraverso la barriera emato-encefalica (BBB), limitando così il numero di farmaci che raggiungono il cervello dei pazienti arruolati in questi studi clinici.14

Infatti, si stima che la BBB impedisca a circa il 98% di tutti i farmaci a piccole molecole di raggiungere il cervello, e solo una frazione del farmaco che entra nel cervello raggiunge la microglia.15

Inoltre, PPAR è un altro recettore nucleare della famiglia PPAR.16 Presenta un ruolo nell'omeostasi dei lipidi e nella regolazione dell'infiammazione, ed è stato dimostrato che gli agonisti PPAR mostrano anche effetti antinfiammatori nella microglia.

Studi clinici che utilizzano neuroimaging, analisi tissutale post-mortem e biomarcatori del liquido cerebrospinale hanno fornito prove che la BEE è compromessa nell'AD e nel PD, così come in altre malattie neurodegenerative.

È stato dimostrato che i dendrimeri di poliammidoammina con terminazione idrossilica (G4-PAMAM-OH) di 17 generazione-4 bypassano intrinsecamente la BBB compromessa e si accumulano nella microglia attivata senza la necessità di prendere di mira i ligandi, dopo la somministrazione sistemica in diversi modelli di malattie neuroinfiammatorie , anche in roditori, conigli, cani e primati non umani.18-28 Significativamente, G4-PAMAM-OH può essere somministrato per via sistemica e attraversare la BBB in modelli patologici con lieve interruzione della BBB come la sindrome di Rett.29

Inoltre, l'entità dell'assorbimento di G4-PAMAM-OH nel cervello è direttamente proporzionale alla gravità della malattia in un modello di coniglio di paralisi cerebrale.30 I dendrimeri idrossil-terminati hanno il vantaggio di essere somministrati in modo non invasivo rispetto alla somministrazione locale altamente invasiva attraverso il cranio richiesto in studi precedenti con altre nanoparticelle come poli-εcaprolattone e PEG, dendrimeri PAMAM caricati negativamente, punti quantici e nanoformulazioni composte da polietilenimmina (PEI) e destrano solfato.31–35

Inoltre, questi dendrimeri idrossilici PAMAM sono idealmente posizionati per la traslazione grazie alla loro scalabilità e al profilo di sicurezza in vivo ben tollerato.36–38 Grazie ai dati positivi sull'efficacia preclinica, un (G4-PAMAM-OH)-N- Il coniugato di acetil-cisteina è attualmente in fase di valutazione nei primi studi clinici sull'adrenoleucodistrofia cerebrale infantile (NCT03500627) e sull'infiammazione grave associata alla malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) (NCT04458298).

Abbiamo studiato un coniugato dendrimero-farmaco di tesaglitazar (Tesa) attaccato al PAMAMdendrimero di generazione -4 con terminazione idrossilica. Tesaglitazar è un potente PPAR/doppio agonista che combina gli effetti benefici dei PPAR e degli agonisti PPAR. Contiene un gruppo funzionale acido carbossilico per la coniugazione covalente al dendrimero e per il successivo rilascio.

Sono state sviluppate e testate clinicamente altre chitarre, ma Tesa è stata scelta per il suo rapporto di attività PPAR/PPAR più elevato, per la struttura chimica relativamente semplice e per il profilo di sicurezza.39–43

Tesa ha già raggiunto studi clinici di fase III per il diabete di tipo 2 negli Stati Uniti d'America, ma ha fallito a causa della tossicità dose-dipendente, che può essere prevenuta diminuendo la dose di somministrazione necessaria mediante la somministrazione controllata di dendrimeri.39,40,44 Poiché Tesa è un farmaco PPAR/doppio agonista, la sua somministrazione mirata alle microglia attivate nel sito di neuroinfiammazione potrebbe essere estremamente vantaggiosa.

Qui, dimostriamo la sintesi e la caratterizzazione di un coniugato dendrimero-tesaglitazar (D-Tesa) e dimostriamo la capacità di questo composto di indurre uno spostamento del fenotipo da "M1 a M2" nella microglia e migliorare la fagocitosi dell'amiloide marcato in modo fluorescente.

Materiali e metodi

Materiali

1-[3-(Dimetilammino)propil]-3-etil carbodiimmide metiodide (EDC), 4(dimetilammino)piridina (DMAP), CuSO4·5H2O, ascorbato di sodio, acido esinoico e albumina di siero bovino (BSA) sono stati acquistati da Sigma Aldrich US e utilizzati come ricevuti (St Louis, MO).

Tesaglitazar è stato ottenuto da AstaTech Inc. (Bristol, PA). Il dendrimero PAMAM con nucleo di etilendiammina (generazione 4 con 64 gruppi terminali idrossilici) è stato ricevuto da Dendritech Inc. (Midland, MI) come soluzione in metanolo.

Il dendrimero è stato conservato in metanolo a 4 gradi e il metanolo è stato evaporato prima dell'uso. Una membrana per dialisi con un limite di peso molecolare (MWCO) di 1 kDa è stata acquistata da Spectrum Laboratories Inc. (New Brunswick, NJ).

Tutti gli altri solventi sono stati utilizzati così come ricevuti nella loro forma anidra. Tutte le reazioni, ad eccezione delle reazioni click di rame (I), cicloaddizione alchino-azide catalizzata (CuAAC), sono state condotte in condizioni anidri in un mezzo organico con vetreria essiccata in forno sotto azoto inerte atmosfera.

Per la coltura cellulare: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), siero bovino fetale (FBS), penicillina-streptomicina (P/S), 0,05% trypsin-EDTA e il reagente MTT sono stati ottenuti da Invitrogen (Carlsbad, CA , Stati Uniti).

Il reagente di Griess è stato ottenuto da Promega (Madison, WI) e TNF-ELISA è stato ottenuto da R&D Systems (Minneapolis, MN). Il metanolo di grado analitico è stato acquistato da Sigma-Aldrich. Il blu trypan è stato ottenuto da Corning (Manassas, VA, USA).

Procedure di sintesi per coniugati D-Tesa
Il tetraetilenglicole monoazide (2) è stato sintetizzato utilizzando il protocollo precedentemente pubblicato.45

Sintesi e purificazione di Tesa-TEG-azide (3).
Tesa (950 mg, 2,32 mmol) è stata sciolta in 10 ml di dimetilformammide (DMF). A questa soluzione agitata è stato aggiunto goccia a goccia tetrametilenglicole mono-azide (2.662,1 mg, 3,02 mmoli) in DMF (1 ml). Alla miscela di reazione sono stati poi aggiunti DMAP (255,4 mg, 2,09 mmol) e EDC (577,5 mg, 3,02 mmol) e la reazione è stata agitata sotto spurgo di azoto a temperatura ambiente per 24 ore.

La reazione è stata monitorata utilizzando la cromatografia su strato sottile e la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). La miscela di reazione è stata diluita con 100 ml di diclorometano (DCM) e la miscela di reazione grezza è stata trasferita in un imbuto separatore, e lo strato organico è stato successivamente lavato tre volte con una soluzione satura di bicarbonato di sodio, seguita da una soluzione satura di cloruro di ammonio e infine con salamoia.

Lo strato organico è stato poi essiccato con solfato di sodio anidro. Il solvente nello strato organico è stato quindi rimosso utilizzando un evaporatore rotante e la soluzione è stata ridisciolta in 3 ml di DCM e assorbita su gel di silice per essere purificata con un sistema cromatografico CombiFlash® utilizzando un metodo a gradiente con acetato di etile/esano come solventi per produrre 3as limpidi -olio giallo.

Il prodotto puro desiderato viene eluito a circa il 30–40% di acetato di etile. (Resa: 70%.) 1H NMR (500 MHz, CDCl3) δ 7,27 (d, J=8,6 Hz, 2H), 7,15(d, J=1,9 Hz, 2H), 7,08 (d, J=8,6 Hz, 2H), 6,73 (d, J=8,6 Hz,2H), 4,25–4,14 (m, 2H), 4,07 (t, J {{ 33}},8 Hz, 2H), 3,94 (gg, J =7,8, 5,2 Hz, 1H), 3,67–3,47 (m, 14H), 3,30 (gg, J=8,7 , 3,8 Hz,2H), 3,06 (s, 3H), 3,02 (t, J=6,7 Hz, 2H), 2,91–2,84 (m, 2H),1,08 (t, J=7 .0 Hz, 3H).ESI-MS: teorico C28H39N3O10S: 609,24, ottenuto (M + 1):610,13.

Sintesi e purificazione del D-YNE (5).

(480 mg, 4,22 mmoli) sono stati aggiunti ad una soluzione agitata di G4-PAMAM-OH (2,5 g, 0,176 mmoli) in 20 ml di DMF anidro. A questa miscela sono stati aggiunti DMAP (430 mg, 3,52 mmol) e EDC (1 g, 5,28 mmol).

La miscela di reazione è stata agitata sotto spurgo di azoto per 24 ore a temperatura ambiente. Al completamento della reazione, la miscela di reazione è stata trasferita in una provetta per dialisi da 1000 MWCO. La dialisi DMF è stata eseguita per 24 ore e il DMF è stato cambiato circa ogni sei ore.

Successivamente è stata eseguita la dialisi con acqua deionizzata (DI) per 24 ore, cambiando l'acqua circa ogni sei ore. Infine, il contenuto risultante della provetta per dialisi è stato liofilizzato per 48 ore, producendo una polvere bianca e soffice. (Resa: 61%). 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8,10–7,67 (m, ammide interna dendrimerica H), 4,72 (s, superficie del dendrimero OH), 4,01 (t,estere –CH2), 3,32 (m, dendrimero –CH2), 3,06 (m, dendrimero e linker –CH2), 2,85–2,58 (m, dendrimero –CH2), 2,56–1,89(m, dendrimero e linker –CH2), 1,78–1,61 (m, linker –CH2).Sintesi e purificazione di D-Tesa (6).

Tesa-TEG-azide (3.177,8 mg, 0,3{{10}}3 mmol) è stato aggiunto a una miscela agitata di D-YNE(5, 35{{2{{27} }}} mg, 0,023 mmol) in 5 ml di una miscela 1:1 di tetraidrofurano (THF) e acqua con 0,5 ml di DMF in una fiala da 20 ml adatta al reattore a microonde. Per la reazione clic CuAAC, alla miscela di reazione sono stati aggiunti solfato di rame pentaidrato (11,6 mg, 0,0467 mmol) e (+)-sodio-lascorbato (9,3 mg, 0,0467 mmol).

La fiala è stata sigillata e il recipiente di reazione è stato quindi collocato in un reattore a microonde Biotage® Initiator e fatto reagire sotto una radiazione a microonde da 20 W agitando per 8 ore a 50 gradi. La miscela di reazione è stata trasferita in un tubo per dialisi da 1000 MWCO e la dialisi del DMF è stata eseguita per 24 ore, con il DMF sostituito con solvente fresco circa ogni 4 ore.

Quindi, il contenuto della provetta di dialisi è stato trasferito nella provetta Afalcon ed è stata aggiunta una quantità equivalente di acqua deionizzata. Inoltre, 200 µl di soluzione salina disodica dell'acido etilendiamminotetraacetico sono stati aggiunti al contenuto della provetta Falcon.

Questa miscela è stata quindi inserita in una nuova provetta di dialisi da 1000 MWCO e la dialisi è stata eseguita per 12 ore in 1000 ml di acqua DI con aggiunta di soluzione EDTA seguita dalla dialisi in acqua per 12 ore.

La miscela è stata poi liofilizzata per 48 ore e il risultato è stata una polvere bianca e soffice. (Resa: 64%.) 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 8,2–7,6 (m, dendrimero internalammide H), 7,36 (d, Tesa ArH), 7,21 (d, Tesa ArH), 7,03 (d, TesaArH), 6,76 (d, Tesa ArH), 4,37 (s, Tesa H), 4,18–4,04 (m, linkerH), 3,96 (dd, Tesa e linker H), 3,70 (m, Tesa e linker H) ,3,58–3,14 (m, dendrimero –CH2), 3,14–2.86 (m, dendrimero–CH2), 2,87–2,49 (m, dendrimero e linker –CH2), 2,25 (m, dendrimero –CH2) , 1,82–1,67 (m, linker –CH2), 0,97 (t, Tesa –CH3).

Tecniche di caratterizzazione

Risonanza magnetica nucleare (NMR). Gli spettri NMR sono stati registrati su uno spettrometro Bruker da 500 MHz a temperatura ambiente. Gli spostamenti chimici dei protoni (δ) sono riportati in ppm.

1H NMR è stato utilizzato per determinare il numero di molecole di Tesa attaccate a ciascuna molecola di D-Tesa mediante il metodo di integrazione protonica, confrontando i picchi dei protoni ammidici interni del dendrimero a δ 7,6–8,2 ppm con i protoni aromatici di Tesa a δ 7,36–6,76 ppm e i protoni metilici di Tesa nella regione alifatica. Cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC).

È stato utilizzato un HPLC (Waters Corporation, Milford, Massachusetts) dotato di una pompa binaria 1525, un degasatore in linea AF, un autocampionatore 717 plus, un rilevatore a serie di fotodiodi 2998 e un rilevatore multi-λfluorescenza 2475 interfacciato con il software Waters Empower.

È stata utilizzata una colonna a fase inversa Symmetry C18 (Tosoh, Giappone) con dimensioni delle particelle di 5 μm, lunghezza di 25 cm e diametro interno di 4,6 mm. I composti sono stati monitorati a 210 nm e 254 nm utilizzando i rilevatori PDA.

Il solvente A era acqua di grado HPLC con 0,1% di acido trifluoroacetico (TFA), mentre il solvente B era acetonitrile (ACN) con il 5% di acqua e 0,1% di TFA. Il metodo utilizzato è iniziato alle 1{ {7}}0 : 0 (ACN: acqua), è sceso a 10: 90 (acqua: ACN) in 5 minuti, è rimasto a quella polarità per 15 minuti ed è tornato a 100: 0 (ACN: acqua) in 5 minuti. La portata è stata mantenuta a 1 ml min−1. Spettroscopia di massa.

ESI-MS è stato eseguito sullo spettrometro di massa BrukermicroTOF-II utilizzando acetonitrile/acqua (9: 1) come sistema solvente. Gli ioni molecolari come picchi protonati[M + nH]n+ o addotti [M + nX]n+ (X=Na, K o NH4) sono stati utilizzati per confermare la formula empirica.

Diffusione dinamica della luce e potenziale ζ. Uno Zetasizer NanoZS (Malvern Instrument Ltd, Worchester, Regno Unito) dotato di un laser He-Ne da 50 mW (633 nm) è stato utilizzato per determinare la dimensione delle particelle e la distribuzione del potenziale ζ. D-Tesa è stato sciolto in acqua DI a una concentrazione di 0,2 mg ml−1 per DLS e in cloruro di sodio 10 mM a una concentrazione di 0,1 mg ml−1 per ζ-potenziale.

Le misurazioni sono state effettuate a 25 gradi, utilizzando un angolo di diffusione di 173 gradi come descritto in precedenza.27,46Studio sul rilascio di farmaci. D-Tesa è stato sciolto a una concentrazione di 1 mg ml−1 in una soluzione tampone fosfato (pH 7,4) per simulare condizioni plasmatiche o in una soluzione di citrato di sodio (pH 5,5) per simulare condizioni lisosomiali.

Le esterasi di fegato suino (della Sigma Aldrich) sono state aggiunte alla soluzione di citrato di sodio all'inizio dello studio sul rilascio e sono state reintegrate approssimativamente ogni 3 giorni durante lo studio.

Ciascuna fiala conteneva 15 ml di campione ed è stata agitata continuamente a 37 gradi per tutta la durata dell'esperimento. In momenti diversi, sono stati raccolti campioni duplicati da 200 µl per ciascun pH e l'attività esterasica è stata successivamente disattivata aggiungendo 200 µl di metanolo. I campioni di punto temporale a zero ore sono serviti come controllo.

I campioni sono stati conservati a -80 gradi per evitare ulteriormente qualsiasi idrolisi. I campioni sono stati ulteriormente analizzati mediante HPLC ed è stata calcolata l'area sotto la curva (a 210 nm) per il picco del farmaco libero. L'area sotto la curva è stata correlata alla quantità di farmaco rilasciato utilizzando una curva di calibrazione in cui concentrazioni note di Tesa libero sono state analizzate sull'HPLC a 210 nm.

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