Il coniugato dendrimero-tesaglitazar induce uno spostamento del fenotipo della microglia e migliora la fagocitosi -amiloide† Parte 2

Saggi biologici in vitro

Coltura cellulare. La linea cellulare microgliale murina BV2 è stata ottenuta dalla struttura per colture cellulari dell'ospedale pediatrico del Michigan.

Negli ultimi anni, gli scienziati hanno scoperto che la coltura cellulare è strettamente correlata alla memoria umana. Gli studi hanno dimostrato che attraverso lo studio delle colture cellulari è possibile scoprire i meccanismi molecolari della memoria e del processo di apprendimento, migliorando così la capacità cognitiva e la memoria umana.

La coltura cellulare si riferisce al processo di posizionamento delle cellule biologiche in un mezzo di coltura contenente nutrienti essenziali per crescere e riprodursi in condizioni in vitro. Le cellule sono le unità fondamentali della vita e la coltura cellulare fornisce agli scienziati una piattaforma per studiare il comportamento cellulare e le attività vitali. Attraverso lo studio delle cellule, gli scienziati hanno scoperto molte informazioni sulla crescita dei neuroni e sulle connessioni sinaptiche. Questi risultati non solo possono aiutare gli esseri umani a comprendere meglio come funziona il cervello, ma possono anche aiutare a sviluppare nuovi trattamenti e farmaci.

La ricerca degli ultimi anni ha dimostrato che la coltura cellulare è anche strettamente correlata alla memoria umana. Gli scienziati hanno scoperto che la formazione e il mantenimento della memoria umana richiedono molta regolazione molecolare e trasmissione del segnale. Questi meccanismi di consegna e regolazione del segnale hanno molte somiglianze con i meccanismi della coltura cellulare. Studiando i meccanismi di distribuzione e regolazione del segnale nelle colture cellulari, gli scienziati possono comprendere meglio la memoria umana e i meccanismi di apprendimento.

Inoltre, alcuni studi hanno anche dimostrato che la coltura cellulare può migliorare la memoria umana e la capacità di apprendimento in certi modi. Ad esempio, utilizzando un metodo chiamato "stimolazione elettrica", è possibile stimolare l'attività delle cellule e la connessione tra i neuroni, migliorando così le capacità cognitive umane e gli effetti di apprendimento. Sebbene questo metodo sia ancora in fase di ricerca di laboratorio, si prevede che in futuro diventi un nuovo metodo di allenamento cognitivo.

In sintesi, esiste una stretta connessione tra la coltura cellulare e la memoria umana. Attraverso lo studio delle cellule, possiamo comprendere meglio il meccanismo cognitivo umano e il meccanismo della memoria e anche contribuire a sviluppare nuovi metodi di trattamento e metodi di allenamento cognitivo. Attendiamo con ansia il contributo futuro della tecnologia delle colture cellulari all'umanità! Si può vedere che dobbiamo migliorare la memoria, e Cistanche può migliorare significativamente la memoria perché Cistanche ha effetti antiossidanti, antinfiammatori e antinvecchiamento, che possono aiutare a ridurre l’ossidazione e le reazioni infiammatorie nel cervello, proteggendo così la salute del cervello. sistema nervoso. Inoltre, Cistanche può anche promuovere la crescita e la riparazione delle cellule nervose, migliorando così la connettività e la funzione delle reti neurali. Questi effetti possono aiutare a migliorare la memoria, la capacità di apprendimento e la velocità di pensiero e possono anche prevenire il verificarsi di disfunzioni cognitive e malattie neurodegenerative.

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Le cellule BV2 sono state coltivate nel terreno Dulbecco's Modified EaglesMedium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino inattivato dal calore (HI FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (P/S) a 37 gradi e il 5% di CO2.

Una volta che le cellule hanno raggiunto la confluenza nel pallone di coltura, sono state trasferite in un nuovo pallone utilizzando 0,05% di acido trypsin-etilendiamminotetraacetico (EDTA). Per gli esperimenti, le cellule BV2 sono state seminate in DMEM con HIFBS al 5% e P/S all'1%. 24-48 ore dopo, le cellule sono state stimolate con 100 ng ml−1 (300 EU ml−1) di LPS per 3 ore per consentire alle cellule di entrare in un fenotipo proinfiammatorio (M1) per simulare l'ambiente neuroinfiammatorio presente in molte malattie neurologiche.

Le cellule sono state quindi co-trattate con LPS e Tesa libero o D-Tesa a concentrazioni variabili per 48 mani, quindi il surnatante e le cellule sono state raccolte per l'elaborazione. Le cellule mai trattate con LPS (No LPS) e le cellule trattate sempre solo con LPS (solo LPS) sono servite come gruppi di controllo. Le soluzioni madre Tesa e D-Tesa libere sono state sterilizzate utilizzando filtri di poli(etere solfoni) 0,2 µm.

D-Tesa era solubile nei mezzi cellulari. Tesa è stato solubilizzato utilizzando dimetilsolfossido (DMSO) a una concentrazione finale inferiore allo 0,1% (v/v). Citotossicità, test dell'ossido nitrico e TNF-ELISA. Per il test di citotossicità, le cellule sono state trattate come descritto sopra in una piastra a pozzetti96-, quindi la citotossicità di Tesa e D-Tesa liberi è stata valutata mediante test MTT seguendo le istruzioni del produttore.

Per il test dell'ossido nitrico, le cellule sono state trattate come descritto sopra in piastre a pozzetti 12-, quindi sono stati raccolti i surnatanti delle cellule trattate e i livelli di ossido nitrico sono stati immediatamente quantificati seguendo il protocollo del produttore per il reagente Griess.

Per il TNF-ELISA, le cellule sono state trattate come descritto sopra in piastre a pozzetti 12-, quindi i surnatanti delle cellule trattate sono stati raccolti e conservati a -80 gradi fino al momento dell'ulteriore elaborazione.

Quindi i campioni sono stati scongelati su ghiaccio ed è stato eseguito il TNF-ELISA seguendo il protocollo del produttore. Per questi studi, sia D-Tesa che Tesa libero sono stati sonicati e vortexati finché non sono stati entrambi completamente solubili. Per solubilizzare il Tesa libero, è stato prima solubilizzato in DMSO prima di essere diluito, dove la concentrazione finale di DMSO era inferiore a 0,1% (v/v) per tutti i campioni di Tesa libero.

Poiché D-Tesa era solubile nei terreni di coltura cellulare, a tali campioni non è stato aggiunto DMSO. Per tutti gli studi in vitro, una quantità equivalente di farmaco libero o coniugato è stata applicata alle cellule di entrambi i gruppi Tesa libero e D-Tesa.

PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR). Le cellule sono state trattate come descritto sopra in piastre a 12-pozzetti e, dopo aver raccolto il surnatante, le cellule sono state raccolte nel reagente Invitrogen™ TRIzol™ (di Fisher Scientific) e l'RNA è stato estratto seguendo il protocollo del produttore. La concentrazione e la purezza dell'RNA risultante sono state analizzate utilizzando Nanodrop.

Quantità equivalenti di RNA da ciascun campione sono state convertite in cDNA seguendo il protocollo del produttore per il kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità (da Applied Biosystems di Thermo Fisher Scientific).

Il cDNA risultante è stato utilizzato per l'analisi qRT-PCR utilizzando il reagente verde FAST-SYBR e seguendo il protocollo del produttore. I valori Ct sono stati calcolati dalla macchina e i dati sono stati analizzati utilizzando il metodo 2−ΔΔCt.

Per ciascun marcatore diverso, il valore ΔΔCt è stato calcolato sottraendo il ΔCt per il gruppo No LPS dal ΔCt per ciascun campione. Il valore ΔCt era il valore Ct per il gene di interesse meno il Ct per GAPDH per ciascun campione fornito.

Una volta calcolato 2−ΔΔCt per tutti i gruppi, sono stati quindi tutti normalizzati al gruppo No LPS, fornendo così al gruppo No LPS un livello di espressione relativo di 1.0 per tutti i marcatori. Le sequenze di primer avanti e indietro utilizzate per qRT -PCR sono mostrati nella tabella seguente. Tutte le sequenze vengono scritte da 5′→3′.

Inoltre, i primer disponibili in commercio sono stati acquistati da BIORAD per iNOS/Nos2 (qmmuCID0023087), TLR4 (qmmuCID0023548), CD206/Mrc1 (qmmuCID0012670),TGF- 1 (qmmuCID0017320), IL-10 (qmmuCID0015452),SOCS1 (qmmucid0024846), CD36 (qmmucid0014852), Ide(qmmuced0049796), MMP9 (qmmucid0021296), CCL1(qmmucid0038249), TLR8 (qmmuced0039837), CD86(qmmucid0006086), STAT6 (qmmucid000 6404) e PPAR (qmmucid0018821). Test di fagocitosi.

L'impatto della Tesa libera e della D-Tesa sulla fagocitosi dell'-amiloide è stato determinato utilizzando un metodo riportato in precedenza.47 In breve, la farina HiLyte™ 488-etichettata con -amiloide1–42 (da Anaspec Inc.) è stata sciolta in DMSO (concentrazione finale di DMSO sotto 0,5% (v/v)) e diluito a 5 µg ml−1 in PBS.

Dopo aver trattato le cellule con Tesa e D-Tesa con lo schema di trattamento sopra delineato, la soluzione di amiloide è stata applicata alle cellule per 2 ore. Quindi, le cellule sono state lavate tre volte con la soluzione salina bilanciata di Hank con cationi bivalenti (calcio e magnesio), rimosse dai pozzetti utilizzando trypsin e risospese nel tampone FACS (da Invitrogen).

I campioni sono stati conservati su ghiaccio e immediatamente analizzati su una macchina per citometria a flusso Sony Cell Sorter SH800 e i dati sono stati analizzati con il software associato.

Il cancello è stato impostato utilizzando cellule non trattate con amiloide fluorescente e i risultati mostrati rappresentano la percentuale di cellule di ciascun gruppo che presentava una fluorescenza superiore alla fluorescenza di fondo.

Per ciascun gruppo è stata riportata anche l'intensità media di fluorescenza (MFA) dell'HiLyte™ 488--amiloide marcato. Questo test è stato eseguito in duplicato. Statistiche. Tutti i dati mostrati sono il risultato di tre esperimenti separati, ciascuno eseguito in triplicato se non diversamente specificato. Per eseguire le statistiche sono stati utilizzati GraphPad Prism 5 e Microsoft Excel.

Sono stati eseguiti test t di Student a due code e accoppiati con BonferroniCorrection. Il test di Grubbs è stato utilizzato per determinare i valori anomali. GraphPad Prism 5 per Windows è stato utilizzato per tracciare i dati (San Diego, CA). I dati mostrati sono la media + SEM.

Risultati e discussione

Sintesi e caratterizzazione di D-Tesa

Per consentire il rilascio intracellulare mirato alle cellule microgliali attivate nel cervello, Tesa è stata coniugata covalentemente sulla superficie di G4-PAMAM-OH con legami estere scindibili tra il farmaco e il legante dendrimero (Fig. 1).

Nella prima fase, Tesa (1) è stata fatta reagire con tetrametilene glicole azide (TEG-azide) (2) per produrre Tesa-TEG-azide (3), che ha un legame estere tra il farmaco e il linker (Fig. 1A).

L'HPLC del composto(3) ha mostrato un tempo di ritenzione di 13,4 minuti con una purezza superiore al 99% (Fig. S1B†). Lo spettro di massa di (3) ha mostrato un picco a 610,13 [M + 1]+ corrispondente al peso molecolare di Tesa-TEG-azide confermando ulteriormente la formazione del prodotto (Fig. S2†). Separatamente, il dendrimero G4-PAMAM-OH (4) è stato fatto reagire con acido 5-esinoico utilizzando una reazione di esterificazione per produrre D-YNE (5) (Fig. 1B).

Infine, Tesa-TEG-azide (3) e D-YNE (5) sono stati fatti reagire mediante la reazione a clic altamente efficiente della cicloaddizione rame-catalizzatazide-alchino (CuAAC) per produrre D-Tesa (6) (Fig. 1B).48 L'1H NMR confermato il successo della sintesi di tutti gli intermedi e del prodotto finale; D-Tesa (6) conteneva i picchi caratteristici dei protoni dendrimerici e leganti farmaci che dimostrano la riuscita sintesi di D-Tesa (Fig. 2A).

L'NMR del coniugato D-Tesa finale ha rivelato che a ciascun dendrimero erano attaccate in media dieci molecole di Tesa. L'HPLC ha confermato il successo della coniugazione covalente, poiché D-Tesa ha mostrato uno spostamento sia da D-YNE che da TesaTEG-azide (Fig. 2B e S1†).

Tesa ha una scarsa solubilità in acqua, stimata in 0,0035 mg mL−1,49. La coniugazione del dendrimero idrossilico di Tesa ha migliorato la sua solubilità in acqua di diversi ordini di grandezza rispetto a questa stima. D-Tesa aveva una solubilità in acqua a 22 mg ml−1 e poiché Tesa comprende circa il 19% della massa di D-Tesa, sono stati solubilizzati 4,2 mg ml−1 equivalenti di Tesa (Fig. 3A).

La maggiore solubilità offerta dal dendrimero aumenta la facilità di formulazione ed elimina la necessità di eccipienti potenzialmente tossici.50 Questi benefici si aggiungono alla capacità superiore del dendrimero di fornire farmaci liberi attraverso la BBB alla microglia in vivo e potenzialmente di ridurre la dose necessaria per ottenere l'effetto terapeutico.18–28 Infine, D-Tesa aveva una dimensione media di 7,75 ± 0,29 nm (Fig. S3†) e un potenziale zeta di 2,86 ± 0,38 mV (Misura N=5 e N=3 rispettivamente).

Rilascio di farmaci

Abbiamo progettato D-Tesa per rilasciare Tesa a livello intracellulare all'interno dell'ambiente a basso pH e ad alta concentrazione di esterasi negli endosomi/lisosomi delle microglia attivate. Abbiamo precedentemente riportato che i dendrimeri PAMAM entrano nelle cellule principalmente attraverso l'endocitosi in fase fluida e le vescicole che contengono i coniugati si trasformano in lisosomi.51

Abbiamo incubato D-Tesa a 37 gradi in tampone citrato di sodio (pH 5,5) in presenza di esterasi per imitare le condizioni dei lisosomi, come eseguito in precedenza.52–54 Abbiamo anche studiato il rilascio in condizioni che imitano le condizioni del plasma (soluzione salina tamponata con fosfato [PBS ] tampone, pH 7,4).

In condizioni plasmatiche, solo circa l'1,5% di Tesa viene rilasciato dopo 48 ore e meno del 20% di Tesa viene rilasciato entro il giorno 25, suggerendo la stabilità plasmatica del coniugato (Fig. 3B).

In condizioni lisosomiali, circa il 60% di Tesa viene rilasciato da D-Tesa entro le prime 48 ore ed entro 19 giorni viene rilasciato quasi il 100% di Tesa. Questi risultati dimostrano che D-Tesa fornisce un rilascio prolungato e attivato del farmaco libero per le prime due settimane incubato in condizioni lisosomiali fisiologicamente rilevanti.

Inoltre, il rilascio minimo di Tesa nelle condizioni plasmatiche simulate (gruppo a pH 7,4) nel corso delle prime 48 ore è significativo, poiché questo è il tempo tipico di circolazione di G4-PAMAM-OH prima della clearance renale, è probabile che una quantità minima di Tesa venga rilasciata dal coniugatiprima che raggiungano la microglia.24

D-Tesa ha ridotto l'espressione dei marcatori M1 e aumentato i marcatori M2

Per valutare la capacità di D-Tesa di indurre uno spostamento del fenotipo da M1 a M2, abbiamo valutato la capacità di D-Tesa di alterare l'espressione dei marcatori M1 e M2 in vitro utilizzando una linea cellulare microgliale murina (BV2).

Le cellule BV2 sono state create immortalando le cellule microgliali murine e hanno dimostrato di essere un'alternativa adeguata alle cellule microgliali primarie per studiare la risposta infiammatoria microgliale.55,56 Nei nostri esperimenti, per imitare l'ambiente neuroinfiammatorio presente in molteplici malattie neurologiche, abbiamo pretrattato la microglia con 100 ng ml−1 (300 unità endotossine (UE) per ml) LPS per 3 ore.

Quindi, abbiamo co-trattato le cellule con LPS e Tesa o D-Tesa liberi per 48 ore, quindi abbiamo raccolto i campioni. Abbiamo trattato le cellule a concentrazioni di 1,5, 15 e 150 µM di Tesa o D-Tesa liberi, su una base di farmaco equivalente.

Il test MTT ha dimostrato che il Tesaor D-Tesa libero a queste concentrazioni non causa citotossicità (Fig. S4†). È stato condotto uno studio iniziale per la determinazione della dose con Tesa e D-Tesa per determinare la dose più efficace di Tesa e D-Tesa.

Il trattamento con Tesa e D-Tesa liberi da 1,5 e 15 µM non ha alterato la secrezione di ossido nitrico o TNF-, come determinato rispettivamente dal reagente di Griess e da un TNF-ELISA (Fig. S5†). Sulla base di questi risultati, non abbiamo analizzato queste concentrazioni inferiori nei nostri test qRT-PCR.

In molte malattie neurodegenerative, una delle principali funzioni neurotossiche delle microglia proinfiammatorie M1 è la loro secrezione di specie reattive dell'ossigeno (ad esempio l'ossido nitrico) che uccidono direttamente i neuroni.57,58 Successivamente, è stato postulato che una potenziale strategia terapeutica sarebbe quella di diminuire la secrezione di queste molecole.

Abbiamo valutato la capacità di D-Tesa di ottenere questo effetto. Dopo la stimolazione con LPS, D-Tesa ha ridotto i livelli di mRNA dell'ossido nitrico secreto e dell'ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS) di 3,7-volte (p < 0,0001) e 2-volte (p {{ 7}}.011), rispettivamente, rispetto alle cellule trattate solo con LPS (solo LPS) (Fig. 4A e B).

D'altra parte, Tesa libero ha ridotto l'ossido nitrico secreto in modo più moderato (1.4- volte, p=0.004) e non ha portato a una diminuzione significativa dell'espressione dell'mRNA di iNOS (Fig. 4A e B ).

D-Tesa si è rivelato molto più efficace della Tesaina libera nel sopprimere la secrezione di ossido nitrico. Successivamente, a seconda che le microglia si trovino in un fenotipo M1 o M2, le microglia aumentano iNOS o l'arginasi 1 (Arg1) per metabolizzare la L-arginina per produrre ossido nitrico per la loro risposta di uccisione dei patogeni M1, orornitina e urea per la risposta di guarigione della ferita M2, rispettivamente. 59

Coerentemente con la sua downregulation di iNOS, D-Tesa ha aumentato i livelli di mRNA di Arg1 2-volte (p=0.011) rispetto al controllo solo LPS, mentre Tesa libero non ha aumentato l'espressione in modo significativo (p=0 .40) (Fig. 4C).

D-Tesa, e in misura minore Tesa libera, ha commutato la microglia dal rilascio di monossido di azoto citotossico alla metabolizzazione della L-arginina per la guarigione delle ferite, il che ha implicazioni nel ridurre e potenzialmente invertire la neurotossicità causata dalle microglia nella neurodegenerazione.5–7,10

La downregulation dei livelli di iNOS e di ossido nitrico secreto con il trattamento con D-Tesa deriva da un lavoro precedente che ha dimostrato che il ligando naturale di PPAR (15-deossi-Δ12,14-prostaglandina J2) ha ridotto l'espressione e la secrezione di iNOS e di ossido nitrico nei trattati con LPS microglia primaria.60

IL-10, IL-4 e TGF- 1 sono tutte citochine secrete dalla microglia M2 attivata alternativamente che può indurre un ambiente neuroprotettivo e antinfiammatorio nel cervello.58,61,62Verso a tal fine, D-Tesa ha aumentato l'espressione di IL-105.5-fold (p=0.011) e IL-4 8.2-fold (p { {15}}.013) rispetto al controllo solo LPS (Fig. 4D ed E).

Tesa gratuito non ha aumentato in modo significativo né i livelli di IL-10 né quelli di IL-4, sebbene le medie fossero 1,7-volte (p=0,066) e 2,{{7} } volte (p=0.11) più alto, rispettivamente, per la microglia trattata con Tesa rispetto ai controlli solo con LPS (Fig. 4D ed E). Inoltre, D-Tesa ha aumentato l'espressione di TGF- 1 2.3-fold (p=0.015) e Tesa libera non ha modificato in modo significativo l'espressione (Fig. 4F).

Pertanto, D-Tesa induce la secrezione di citochine antinfiammatorie dopo il trattamento con LPS della microglia, che può mitigare l'ambiente neurotossico e proinfiammatorio presente nelle malattie neurodegenerative.5–7,10

Espressione indotta da D-Tesa dei marcatori del sottotipo M2-

CD206, Ccl1 e TLR8 sono marcatori specifici rispettivamente per i sottotipi di microglia M2a, M2b e M2c.58 Espressione 4 di CD206 sovraregolata da D-Tesa.{{10 }}fold (p < 0,001), Ccl1 3.5-fold (p < 0,005) e TLR8 5-fold (p < 0,01), mentre Tesa libera non ha aumentato significativamente l'espressione di uno qualsiasi di questi tre marcatori (Fig. 5A-C).

Questi dati mostrano che le microglia trattate con D-Tesa dimostrano una significativa sovraregolazione dei marcatori di tutti e tre i sottotipi M2, il che concorda con la comprensione che il fenotipo della microglia è plastico e non binario.63-65

La nomenclatura M1/M2 semplifica eccessivamente la complessità che la microglia può esistere in uno spettro di stati di attivazione; lungo questo continuum, sono stati caratterizzati tre distinti fenotipi M2 (M2a, M2b e M2c) e D-Tesa induce l'espressione di marcatori coerenti con ciascuno di questi stati.58,61,63,66,67 Le microglia M2a sono coinvolte nell'aumento della fagocitosi di agenti patogeni proteine ​​attraverso la sovraregolazione dei recettori scavenger, la riparazione dei tessuti e le azioni antinfiammatorie.

Le microglia M2b sono come le microglia M1 in quanto esprimono IL-1, TNF- e IL-6; tuttavia, le microglia M2b sono distinte dalle microglia M1 in quanto esprimono IL-10 ad alti livelli e sottoregolano l'espressione di iNOS. I macrofagi e la microglia M2b stimolano le cellule T Th2, il che è indicativo di uno dei ruoli di M2b nell'indurre una risposta antinfiammatoria.

Le microglia M2c sono coinvolte nella guarigione delle ferite, nel rimodellamento dei tessuti, nel sequestro del ferro e nell'attivazione di STAT3 che riduce la segnalazione proinfiammatoria.58,61,63,66 L'attività PPAR di Tesa stimola un ciclo feedforward che si traduce in una maggiore espressione di PPAR e della sua proteina di segnalazione a monte (STAT6), che sono entrambi marcatori M2a.58D-Tesa ha aumentato l'espressione di PPAR 2.3-fold (p=0.0036)e STAT6 3.4- volte (p < 0,001), mentre il Tesa gratuito ha aumentatoSTAT6 1.8-volte (p=0.011) senza un aumento significativo dell'espressione PPAR (aumento di 1,58-volte, p=0.17) (Fig. 5D ed E).

L'aumentata espressione di STAT6 e PPAR determina la produzione di geni antiinfiammatori e l'inibizione dei segnali proinfiammatori inibendo l'attività di NF-κB. Poiché la microglia M2a può essere indotta trattando la microglia con IL-4, che segnala attraverso STAT6 e PPAR, la sovraregolazione di queste due proteine ​​di segnalazione a valle può provocare una polarizzazione M2a feedforward.68

Nei nostri test, l'attivazione di LPS ha aumentato i livelli di IL-6, TNF- e IL-1 e il trattamento con D-Tesa ha ulteriormente sovraregolato l'espressione di queste citochine (Fig. S6A–D†), il che è probabile dueto D-Tesa che induce il fenotipo M2b (Fig. 5B).

Tesa libero ha aumentato l'espressione di IL-6 e non ha modificato in modo significativo l'espressione di TNF e IL-1 (Fig. S6A–D†). Mentre queste citochine sono secrete dalla microglia M1, anche la microglia M2b esprime queste citochine.58,61 CD86 è un marcatore sia della microglia M1 che di M2b e aumenta con il trattamento D-Tesa (Fig. S6E†).

Inoltre, il soppressore della segnalazione delle citochine (SOCS) è una famiglia di proteine ​​intracellulari che regolano la polarizzazione fenotipica della microglia sopprimendo molteplici vie di segnalazione attivate dalle citochine.69 SOCS1 è un membro di questa famiglia ed è stato dimostrato che inibisce LPS/TLR4 mediata dalla segnalazione di NF-kB e JAK2, riducendo così la quantità di TNF-, IL-1 e IL-6 rilasciati dalla microglia M1 attraverso il percorso LPS/TLR4.

D-Tesa sovraregola l'espressione di SOCS1 rispetto al controllo solo LPS (Fig. S6F†), suggerendo che l'aumento di IL-6, TNF- e IL-1 mostrato da D-Tesa potrebbe essere dovuto all'induzione del Fenotipo M2b e non tramite il potenziamento del fenotipo che induce LPS/TLR4, M1-.

Inoltre, i segnali LPS attraverso TLR4 e per prevenire un'eccessiva attivazione cellulare, la microglia possiede un meccanismo di feedback negativo per cui l'attivazione di TLR4 porta a una ridotta espressione di TLR4.70

Il trattamento con Tesa libero e D-Tesa ha aumentato i livelli di TLR4 rispettivamente di 3,6-volte (p < 0.001) e 3,7-volte (p < 0,001) (Fig. 5F), suggerendo che Tesa e D-Tesa hanno alterato la tipica via di segnalazione di feedback negativo LPS/TRL4.

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