Efficacia e meccanismi di un composto di fibre di Angelica Sinensis Cistanche per alleviare la stitichezza

Astratto:Stipsiè un disturbo diffuso che potrebbe avere un impatto significativo sulla qualità della vita delle persone e aumentare alcuni rischi di malattie associate. In questo studio, è stato stabilito un modello murino di costipazione acronica utilizzando loperamide cloridrato. Ai topi è stato somministrato tramite sonda un composto di fibre di Angelica sinensis Cistanche, composto da Dang Gui [Angelica sinensis (Oliv.) Diels],Rou Cong Rong (Cistanche deserticolaY.C.Ma), fibra di frumento e xilano a basso peso molecolare ad alto dosaggio (3,6 g·kg-1, 30volte la dose umana raccomandata) e a basso dosaggio (0,6 g·kg{{8} }, 5 volte la dose umana raccomandata) per 14 giorni. Lo studio ha valutato l'efficacia terapeutica del composto osservando la morfologia fecale, misurando il contenuto di acqua e conducendo esperimenti sulla motilità dell'intestino tenue. Inoltre, sono stati condotti test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per valutare i livelli sierici degli ormoni gastrointestinali tra cui motilina (MTL), gastrina (GAS), i fattori infiammatori interleuchina-1 (IL-1) e fattore di necrosi tumorale. - (TNF-). Per valutare il danno tissutale del colon è stato utilizzato l'esame istopatologico con colorazione H&E. Inoltre, sono stati condotti esperimenti Western blot e immunoistochimici per esaminare i livelli di espressione di acquaporina -3 (AQP3) e c-Kit nel colon. I risultati hanno indicato che il composto di fibre di Angelica sinensis Cistanche potrebbe migliorare la morfologia fecale, aumentare il contenuto di acqua fecale e aumentare i tassi di transito intestinale nei topi. Inoltre, si è verificato un aumento significativo dei livelli sierici degli ormoni gastrointestinali e una notevole riduzione dei livelli dei fattori infiammatori. Il miglioramento del danno istopatologico del colon è stato accompagnato da una marcata diminuzione dell'espressione della proteina del canale dell'acqua del colon AQP3 e da un aumento significativo dell'espressione di c-Kit. Questi risultati suggeriscono collettivamente la presenza di una relazione dose-risposta. Questi risultati indicano che il composto di fibre di Angelicasinensis Cistanche allevia efficacemente la stitichezza nei topi. La sua azione è associata alla regolazione dell'espressione della proteina del canale dell'acqua del colon AQP3 e del c-Kit, insieme alla modulazione dei fattori infiammatori sierici e degli ormoni gastrointestinali. Questo esperimento è stato approvato dal Comitato Etico per gli Esperimenti sugli Animali dell'Università di Jinan.

Parole chiave:stipsi; lubrificazione intestinale e sollievo dalla stitichezza; cibo funzionale; colon; Medicina tradizionale cinese

QUANTO TEMPO IMPIEGA LE CISTANCHE A FUNZIONARE?

Stipsiè uncomune malattia gastrointestinale. The global prevalence of constipation in the elderly (>60 anni) è del 18,9%[1] e la prevalenza è spesso più elevata nelle donne[2]. È caratterizzata da difficoltà nella defecazione e frequente stitichezza. riduzione e indurimento delle feci, ecc., che portano a disagio fisico e disfunzione gastrointestinale e persino inducono o aggravano malattie gastrointestinali, malattie cardiovascolari [3], ecc., compromettendo gravemente la qualità della vita. Le prescrizioni della medicina tradizionale cinese sono ampiamente utilizzate per migliorare la stitichezza e hanno effetti clinici buoni e definiti [4,5]. Il composto fibroso di Angelica e Cistanche deserticola utilizzato in questo studio è preparato da Cistanche deserticola, Angelica sinensis, fibra di grano e xilooligosaccaridi. Cistanche deserticola e Angelica sinensis sono due medicinali tradizionali cinesi comunemente usati nei lassativi, che hanno l'effetto di regolare la funzione intestinale e migliorare la stitichezza. [6-9], due medicine tradizionali cinesi hanno la stessa origine della medicina e del cibo nel mio paese. Il loro uso combinato può ottenere l'effetto di ricostituire qi e sangue e di armonizzare yin e yang. La fibra di grano è ricca di fibre alimentari insolubili e solubili, che possono favorire la peristalsi intestinale e la defecazione e viene spesso utilizzata come farmaco ausiliario per trattare la stitichezza; lo xilo-oligosaccaride è un oligosaccaride funzionale in grado di regolare la flora intestinale, stimolando così la peristalsi intestinale. , aumentano l'umidità delle feci [10], combinano i quattro sapori e trattano la causa principale della malattia. Questo studio mirava a valutare l'efficacia di questo composto di fibre di angelica e cistanche deserticola su topi stitici ed esplorarne il possibile meccanismo d'azione.

Materiali e metodi

Animali sperimentali: 40 topi Kunming maschi di grado specifico esente da agenti patogeni (SPF), di età compresa tra 4 e 5 settimane, sono stati acquistati da Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., numero di licenza SCXK (Guangdong) 2021-0011, The la temperatura ambiente è di 22 ± 2 gradi, l'umidità è del 50% ± 10% e il ciclo giorno e notte è di 12 ore/12 ore. I protocolli e le procedure sperimentali erano conformi ai principi etici dell'uso e della cura degli animali e sono stati approvati dal Comitato etico per la sperimentazione animale dell'Università di Jinan.

La sostanza in esame: il preparato del composto fibroso di Angelica sinensis e Cistanche deserticola è costituito da Angelica Sinensis e Cistanche deserticola, che vengono estratte con acqua, concentrate, essiccate e frantumate per ottenere una polvere di pasta secca (la resa in pasta è del 52,95%). La polvere di pasta secca viene miscelata con fibra di frumento e xilo-oligosaccaride per un uso successivo. Angelica sinensis (numero di lotto 230404CP108) e Cistanche deserticola (numero di lotto 230303CP109) sono state acquistate da Hebei Wanxiu Pharmaceutical Co., Ltd. e sono state testate per conformarsi all'edizione 2020 della farmacopea cinese. Gli xilo-oligosaccaridi sono stati acquistati da Shandong Bailong Chuangyuan Biotechnology Co., Ltd. Il numero di lotto è 20210829026 e l'ispezione è conforme a GB/T35545; la fibra di grano proviene da J. Rettenmaier & Söhne GmbH + Co KG e il numero di lotto è 07501230126. Basato su un adulto di 60 kg, il dosaggio raccomandato di composto di fibre di angelica e cistanche per gli esseri umani è 7,118 g·d-1 , di cui il dosaggio di fibra di grano è 3,5g·d-1. La compatibilità di questo composto è angelica: cistanche: fibra di grano: xilooligosaccaridi=2:2:3:2 (il dosaggio dei pezzi di decotto si basa sulla droga grezza). Prendi 30 volte la dose umana raccomandata come gruppo a dose alta e 5 volte la dose umana raccomandata come gruppo a dose bassa, rispettivamente 3,6 e 0,6 g·kg-1·d-1. Preparare una sospensione con acqua pura, mescolare bene e mettere da parte.

Farmaci e reagenti Loperamide cloridrato (loperamide, LOP), specifiche: ogni compressa contiene loperamide cloridrato

Amine 2 mg, 12 capsule/scatola, numero di lotto del prodotto: MIJ3102, acquistato da Xi'an Janssen Pharmaceutical Co., Ltd.; Mosapride Citrate Tablets (Quali), specifiche: ogni compressa contiene 5 mg di Mosapride Citrate, 24 compresse/scatola, numero di lotto del prodotto: 25220603, acquistato da Lunan Beite Pharmaceutical Co., Ltd.; polvere di carbone attivo, specifica: polvere marrone da 200 mesh, numero di lotto A805337, acquistata da Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; gomma arabica, specifica: polvere, numero di lotto A108975, acquistata da Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.

Etanolo assoluto (fabbrica di reagenti chimici di Tianjin Damao, 64-17-5); Persolfato di ammonio (Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., A6295-500g); Tris-Base (FD2010), tampone di caricamento 5× (FD002), anticorpo -actina (FD0060), anticorpo secondario anti-coniglio di capra (FDR007), anticorpo secondario anti-topo di capra (FDM007) e kit di sviluppo del colore ECL (FD8020) sono stati tutti acquistati da Hangzhou Fude Biotechnology Co., Ltd.; Tampone di lisi RIPA (Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd., P0013B); paraformaldeide al 4% (Biosharp Company, BL539A); Kit per immunoistochimica (Jiangsu KGI Biotechnology Co., Ltd., KGOS60); Kit di quantificazione delle proteine ​​dell'acido bicinconinico (BCA) (Thermo Fisher Scientific, SLZ60212); motilina (MTL), gastrina (GAS) e fattori infiammatori interleuchina-1 (IL-1), fattore di necrosi tumorale (fattore di necrosi tumorale-, TNF-) Kit ELISA (Shanghai Enzyme Biotechnology Co., Ltd ., YJ201829, YJ037432, YJ002095, YJ301814); anticorpo acquaporina 3 (acquaporina 3, AQP3) (Affinity Company, AF5222); c -Anticorpo del kit (Cell Signaling Technology, 3074S).

Strumento: contatore per acqua super pura (Millipore Company, USA, Milli Q); Bilancia elettronica (Sartorius, Germania)

L'azienda, BS224S); Bilancia analitica elettronica (Shanghai Benpu Instrument Technology Co., Ltd., FA2204N); Centrifuga refrigerata ad alta velocità (Sigma Company, Germania, 3K15); Lettore di micropiastre (Thermo Company, USA, Multiskan Mk 3); Microtomo a paraffina (Leica, Germania) Company, RM2255); Bagno metallico a temperatura costante (Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd., TU-100C); Macinatore rapido per campioni completamente automatico (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd., JXFSTPRP-24); Strumento per elettroforesi (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., DYY-6C); microscopio a scansione (Precipoint Company, Precipoint M8); sistema di imaging in chemiluminescenza (Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd., Tanon 5200).

Raggruppamento e creazione del modello: 40 topi sono stati allevati in modo adattivo per 5 giorni e poi divisi casualmente in gruppi di controllo negativo.

(controllo), gruppo modello (LOP), gruppi composti ad alta e bassa dose (LOP+PF-H, OP+PF-L), gruppo di controllo positivo (mosapride citrato, LOP+MOS). Ogni giorno dalle 9 all'10 di notte, a tutti i gruppi tranne il gruppo di controllo negativo sono stati somministrati 10 mg·kg-1 di loperamide cloridrato tramite sonda gastrica per stabilire un modello di stitichezza nel topo, mentre al gruppo di controllo negativo è stato somministrato un uguale quantità di acqua pura mediante sonda gastrica. Dalle 14 alle 15 ore, ai gruppi ad alto dosaggio e a basso dosaggio sono stati somministrati rispettivamente 3,6 e 0,6 g·kg-1 del composto e al gruppo di controllo positivo sono stati somministrati mosapride citrato (MOS) 5 mg·kg{{ 19}}.

, al gruppo di controllo negativo e al gruppo di controllo modello sono state somministrate quantità uguali di acqua pura mediante sonda gastrica per 14 giorni consecutivi.

Lo stato e le caratteristiche delle feci dei topi sono stati osservati e registrati durante il periodo di intervento del farmaco. Sono stati registrati lo stato di base e le feci dei topi in ciascun gruppo.

Caratteri, pesatevi 3 volte a settimana e aggiustate il dosaggio. Nei giorni 3, 7, 10 e 14 dopo la somministrazione, sono stati raccolti da 3 a 4 pellet di feci fresche da ciascun topo, pesati immediatamente e registrati come peso umido, essiccati in un forno e registrati come peso secco e umidità fecale. è stato calcolato il contenuto Calcolare il contenuto di umidità fecale (%)=(peso umido − peso secco)/peso umido × 100%.

La determinazione della funzione di propulsione dell'intestino tenue è stata effettuata secondo i metodi sperimentali richiesti dalla letteratura di riferimento [11] e da "Metodi per il test e la valutazione delle funzioni funzionali degli alimenti salutari (2023 edizione)". Dopo l'ultima dose, i topi di ciascun gruppo sono stati a digiuno e privi di acqua per 16 ore. Gruppo modello, formula del composto Ai gruppi ad alto e basso dosaggio e al gruppo di controllo positivo è stata somministrata una sospensione di loperamide cloridrato (10 mg·kg-1) mediante sonda gastrica, mentre al gruppo di controllo negativo è stata somministrata una sospensione uguale quantità di acqua pura mediante sonda gastrica. 0,5 ore dopo, ai gruppi del composto ad alta e bassa dose e al gruppo di controllo positivo è stato somministrato inchiostro (contenente il 5%) contenente le corrispondenti dosi del campione di prova (3,6 g·kg-1, 0,6 g·kg-1, 5 mg·kg-1) rispettivamente. (polvere di carbone attivo, 10% gomma arabica) e quantità uguali di inchiostro sono state somministrate ai gruppi negativo e modello. Gli animali sono stati uccisi immediatamente dopo 0,5 ore mediante dislocazione cervicale e sono state misurate la "lunghezza totale dell'intestino tenue" e la "lunghezza di avanzamento dell'inchiostro". Calcolare la velocità di avanzamento dell'inchiostro=lunghezza di avanzamento dell'inchiostro (cm)/lunghezza totale dell'intestino tenue (cm) × 100%.

Per rilevare i livelli di MTL, GAS, TNF- e IL-1 nel siero, il sangue è stato prelevato dai bulbi oculari del topo, centrifugato a 4 gradi, 3 500 r·min-1 per Dopo 10 minuti è stato prelevato il siero superiore e sono stati determinati MTL e GAS nel siero di topo secondo il kit ELISA. e livelli di TNF-, IL-1.

H&E rileva cambiamenti patologici nel tessuto del colon. Il colon dei topi viene lavato con soluzione salina normale e incubato in paraformaldeide al 4%.

Sono stati fissati in aldeide, incorporati regolarmente dopo 24 ore, sezionati, cotti e colorati con H&E, e i cambiamenti patologici del tessuto del colon sono stati osservati al microscopio ottico.

Il metodo immunoistochimico è stato utilizzato per rilevare l'espressione di AQP3 e c-Kit nel tessuto del colon. Sono stati raccolti i tessuti del colon dei topi di ciascun gruppo.

Sezioni in paraffina, deparaffinazione, idratazione, recupero dell'antigene, blocco della catalasi endogena, blocco con siero di capra al 2%, aggiunta rispettivamente di anticorpi AQP3 e c-Kit e incubazione notturna a 4 gradi, soluzione salina tamponata con fosfato, PBS) per 5 minuti Colorazione di contrasto con ematossilina, gradiente disidratazione dell'etanolo, trasparenza dello xilene, sigillatura della gomma neutra, scansione al microscopio a scansione e utilizzo del software Image J per analizzare i risultati.

Il metodo Western blot è stato utilizzato per rilevare l'espressione di AQP3 e c-Kit nel tessuto del colon. Prendere 10 mg di tessuto del colon di topo congelato e posizionarlo in una provetta da centrifuga con 150 μL di tampone di lisi RIPA contenente l'1% di inibitore della proteasi. Utilizzare una smerigliatrice rapida per omogeneizzare il tessuto. , centrifugare l'omogenato con una centrifuga a bassa temperatura a 10 000 r·min-1 per 10 minuti, prendere il surnatante, determinare la concentrazione proteica con il metodo di quantificazione delle proteine ​​BCA, miscelare con il tampone di caricamento, denaturare la proteina e analizzare i risultati in base a ciascun campione. Sono stati caricati 30 ug di proteina, sottoposti a elettroforesi SDS-PAGE, trasferimento a umido sulla membrana e quindi bloccati con latte scremato in polvere al 5% a temperatura ambiente per 1,5 ore, lavati tre volte con TBST, posti l'anticorpo primario su un agitatore e incubati per una notte 4 gradi, quindi rimosso e lavato con tampone TBST Lavare 3 volte con la soluzione, incubare con anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente e quindi lavare 3 volte con TBST. Per lo sviluppo del colore viene utilizzata la soluzione operativa di chemiluminescenza ECL e per lo sviluppo viene utilizzato un sistema di imaging di chemiluminescenza completamente automatico. Il software Image J viene utilizzato per analizzare i risultati.

Metodi statistici Tutti i dati coinvolti in questo esperimento sono espressi sotto forma di media ± deviazione standard. GraphPad Prism è stato utilizzato per tracciare i dati sperimentali e il confronto tra i gruppi è stato eseguito utilizzando ANOVA a una via o ANOVA a due vie; quando le differenze tra i gruppi erano statisticamente significative, è stato utilizzato il metodo della differenza meno significativa (LSD). ) Effettuare confronti a coppie tra i gruppi e P < 0.05 è considerata una differenza statisticamente significativa.